细菌内毒素干扰实验培训课件.pptx

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1、细菌内毒素干扰实验细菌内毒素干扰实验目 录目 录/C O N T E N T S/C O N T E N T S01010202细菌内毒素干扰实验相关理论和概念细菌内毒素干扰实验具体操作方法及注意事项为什么要进行细菌内毒素干扰实验?影响细菌内毒素实验的主要因素有哪些？思考思考？l通过鲎实验法检供试品内毒素含量，受到多种因素的影响，如供试品的pH值、温度、离子强度、浓度，蛋白质和可发生鲎试剂反应的非内毒素杂质等都会对内毒素的检测产生干扰。l干扰实验的目的是确定供试品在多大稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。-2010版中国药品检验标准操作规范

2、LOGOLOGOu当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。u当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。什么时候需进什么时候需进行干扰实验？行干扰实验？干扰实验所需要的试剂干扰实验所需要的试剂及器具？及器具？l鲎试剂l细菌内毒素检查用水l细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院)l内毒素凝胶检测仪l旋涡混合器l试管架、安瓿架、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记笔等 注意：凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。实验基本流程图实验基本流程图供试品限值确定最大有效稀释

3、倍数确认供试验品干扰实正式实验结果确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定 L=K/ML=K/ML为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kgh)表示.M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)或U/(kgh)表示。最大有效稀释倍数（MVD）的确定MVD=CL/MVD=CL/入入基本操作方法：按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。编号编号内毒素浓

4、度内毒素浓度/被加被加入内毒素的溶液入内毒素的溶液稀释用液稀释用液稀释倍稀释倍数数所含内毒素所含内毒素的浓度的浓度平行管数平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液1248210.50.252222C2/检查用水检查用水1248210.50.252222D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。结果判定：0101020203030404溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用其他

5、情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。当最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(c)。c=antilg(Xn)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；n为每个浓度的平行管数。当c在0.52(包括0.5和2)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。鲎试剂灵敏度复核试验要求：c=antilg(Xn)的

6、计算方法问题？怎么用计算器按出 antilg值？antilg是lg函数的反函数，该表格未经确认可以用power公式原因原因解决措施解决措施解决有关pH的问题用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释用酸、碱或缓冲液来调节pH二价阳离子浓度不足使用含Mg 或Ca 离子的稀释剂稀释样品，降低活性螯合剂的含量注意过高的二价阳离子（如Ca）浓度可能会带来抑制内毒素聚集问题如果内毒素标准品溶液需要储存，必须验证其储存条件是否会影响其活性经常旋涡混合含有标准内毒素的溶液酶、酶抑制剂问题使用BET水稀释10倍，然后使用75加热10分钟异常结果的处理及常见的消除干扰的方法举个列子举个列子Mg离子是鲎试剂重要的辅

7、因子，没有Mg 离子，内毒素将无法激活鲎试剂的酶。常见的螯合剂如：EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类等。供试品中的螯合剂成分会螯合试剂中的二价阳离子（如Mg2+离子），造成抑制。消除干扰的一个重要原则是不能影响供试品中的内毒素活性！要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。谈一谈现象：现象：现象：现象：我司内毒素检测时一般会使用的酸或碱调节PH。且在操作过程中会先调节PH，后加入标准内毒素。已知强酸强碱会破坏内毒素成分。讨论讨论讨论讨论u该操作是否会造成假阴性结果的出现。u操作过程中是否也应该预先添加了标准内毒素再处理供试品溶液u是否需要做内毒素的回收实验个人经验总结及实

8、验操作注意事项：个人经验总结及实验操作注意事项：1.在介于未稀释的原液到MVD之间选择若干浓度时，当MVD不大时，建议选择2倍梯度稀释；当MVD较大时，选择10倍梯度稀释。2.不要选择第一个无干扰的稀释浓度，其干扰状态可能处于临界值。3.凝胶法干扰初实验中。可以选择任意灵敏度鲎试剂，一般为了实验方便，选择低灵敏度的鲎试剂。4.细菌内毒素标准品的开启只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素溶液与封口膜接触，污染标准品溶液。5.稀释后的细菌内毒素溶液静置时间超过10分钟，再用前在旋涡混合器上振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。思考1.1.干扰试验是否要选择

9、合适的干扰试验是否要选择合适的样品或合适的样品或合适的TALTAL灵敏度？灵敏度？2.2.干扰试验中内毒素回收试验干扰试验中内毒素回收试验是否都必须做？是否都必须做？1.干扰试验是否要选择合适的样品或合适的TAL灵敏度？是的。具备一定条件的样品才适合做干扰试验，而样品是否合适，在一定程度上又与所选 TAL的灵敏度密切相关。“合适”的样品是指样品必须不含有可测出的细菌内毒素。具体的讲就是在干扰试验（或干扰试验的预试验）中用样品（或样品的稀释液）所做的阴性管（NPC管）不能凝，如凝说明本批样品不适合用来做干扰试验。有部分实验者认为只要用家兔热原检查结果阴性的样品就可用于干扰试验。这不可靠，因为家兔

10、法不如细菌内毒素检查法灵敏，不能保证在干扰试验（或干扰试验的预试验）中样品的细菌内毒素不被检出。“合适”的TAL灵敏度，是指做干扰试验时所选的TAL灵敏度不能太灵敏，以免得出样品不适合做干扰试验的结论，这是一个实验技巧的问题。另有些实验者认为在正式做干扰试验时，选择TAL的灵敏度（）值必须与样品的稀释倍数（D）有一定的对应关系（如按公式=L/D），这是误解。其实，除了要考虑使样品的细菌内毒素不被检出外，别无理由规定要选什么样的TAL灵敏度去做干扰试验。2.干扰试验中内毒素回收试验是否都必须做？不一定。回收试验的目的是为了考察消除干扰的方法是否会造成样品中原有内毒素检出的增加或减少。因此，对于采用“过滤法”、“沉淀法”、“酸碱调节法”及其他有可能造成样品中原有内毒素检出的增加或减少的方法，理应做内毒素回收试验；而对于直接采用细菌内毒素检查用水稀释就可消除干扰者，则无须进行内毒素回收试验。因为细菌内毒素检查用水含内毒素的量极微，不会对样品中原有内毒素的检出造成明显影响。可见，采用细菌内毒素检查用水稀释消除干扰者，无须进行内毒素回收试验。单击此处添加副标题内容谢 谢 观 看谢 谢 观 看