《动物基因工程》课件.ppt

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1、第十一章第十一章动物基因工程动物基因工程河南科技大学河南科技大学1第一节基因工程概述理论上的三大发现理论上的三大发现vDNA为遗传物质：为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实的肺炎双球菌转化实验验vDNA双螺旋结构的发现和双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制半保留复制机制v遗传密码与中心法则遗传密码与中心法则河南科技大学河南科技大学2技术上的三大发明技术上的三大发明1.限制性内切酶和连接酶：限制性内切酶和连接酶：DNA的的“手术刀手术刀”与与“缝纫机缝纫机”2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等等3.逆转录酶：从逆转录酶：从mRNA到到DNA，使

2、真核基因，使真核基因制备成为可能制备成为可能河南科技大学河南科技大学3河南科技大学河南科技大学4河南科技大学河南科技大学5河南科技大学河南科技大学6河南科技大学河南科技大学7河南科技大学河南科技大学8河南科技大学河南科技大学9河南科技大学河南科技大学10河南科技大学河南科技大学113、基因工程的内容、基因工程的内容v目的基因的获得目的基因的获得v目的基因与载体的连接成重组目的基因与载体的连接成重组DNA分子分子v重组重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞v筛选重组克隆筛选重组克隆v基因表达与产物分离基因表达与产物分离河南科技大学河南科技大学12基因操作中的工具酶基因操作中的工具酶手术刀手术

3、刀限制性核酸内切酶、核酸外切酶限制性核酸内切酶、核酸外切酶缝纫机缝纫机连接酶连接酶复印机复印机DNA聚合酶、逆转录酶聚合酶、逆转录酶第二节第二节基因操作中的工具酶基因操作中的工具酶河南科技大学河南科技大学13一、限制性内切酶的概述一、限制性内切酶的概述（一）（一）概念概念限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链能识别双链DNADNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。脱氧核糖核酸水解酶。主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到10001000种以种以上，搞清

4、识别序列的有上，搞清识别序列的有300300种以上。种以上。河南科技大学河南科技大学14（二）限制性内切酶（二）限制性内切酶命名规则命名规则限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母取，即由其属名的第一个字母(大写大写)与种名的第一、与种名的第一、二两个字母二两个字母(小写小写)组成酶的基本命名，若酶的产生组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有菌由株系之分，则有4个或个或4个以上拉丁字母组成，个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。其第四个字母之后表示株系。如如EcoRI来源于来源于Echerichia.coliRY13

5、BamHI来源于来源于B.amyloliquefaciens河南科技大学河南科技大学15H in d IIHaemophilus(属名属名)Influenzae(种名种名)d(株系株系)罗马数字罗马数字限限制制性性内内切切酶酶命命名名举举例例河南科技大学河南科技大学16 类别类别反应必须因子反应必须因子专一性专一性 活性活性 I型型S-腺苷基蛋氨酸，腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+识别部位和切点不同，识别部位和切点不同，无特定切割位点无特定切割位点内切内切甲基化甲基化 II型型Mg2+切断识别部位或其附近切断识别部位或其附近的特定部位的特定部位只有限制酶只有限制酶活性活性 III型型ATP，Mg

6、2+识别部位和切点不同，识别部位和切点不同，但切断特定部位但切断特定部位内切内切甲基化甲基化（三）限制性内切酶分类（三）限制性内切酶分类河南科技大学河南科技大学17河南科技大学河南科技大学18（四）（四）II型限制性内切酶的特性型限制性内切酶的特性（1）II型限制酶的识别特异性型限制酶的识别特异性回文识别序列回文识别序列II型限制酶的识别序列大多是具有型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构双重对称结构性结构,或称或称回文序列回文序列(PalindromicSequence)河南科技大学河南科技大学19（2）识识别别特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，其其长长度度一一般般为为48个核苷酸且

7、呈二重对称。个核苷酸且呈二重对称。（3）具具有有特特定定的的酶酶切切位位点点，即即限限制制性性内内切切酶酶在在其其识识别别序序列列的的特特定定位位点点对对双双链链DNA进进行行切切割割，由由此此产生特定的酶切末端。产生特定的酶切末端。河南科技大学河南科技大学20识别序列识别序列(位点位点)双链双链DNA分子上分子上能识别的特定核能识别的特定核苷酸序列苷酸序列被识别的碱基序被识别的碱基序列通常具有双轴列通常具有双轴对称性，即回文对称性，即回文序列序列(PalindromicSequence)。EcoR I 的识别序列的识别序列河南科技大学河南科技大学21二、二、DNA聚合酶聚合酶（一）一）DNA

8、DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase)(DNA Polymerase)的基本特性的基本特性 能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链分子引物链的的3-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从膜版上的解离作用。膜版上的解离作用。DNA-OH DNA-(pdN)n nPPi dATP，dTTP，dCTP，dGTP，Mg2DNA聚合酶聚合酶河南科技大学河南科技大学22大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶1E.coliDNA聚合酶聚合酶的活性的活性5-3DNA聚合酶活性。聚合酶活性。5-3外切核酸酶活性。

9、外切核酸酶活性。3-5外切酶活性。外切酶活性。河南科技大学河南科技大学232E.coliDNA聚合酶聚合酶的用途的用途 利用利用 E.coliDNA聚合酶聚合酶的的5-3外切外切核酸酶活性，可用切口平移法（核酸酶活性，可用切口平移法（nicktranslation）标记）标记DNA，所有，所有DNA聚合聚合酶中只有此酶有此反应。酶中只有此酶有此反应。用于用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性。但由于具有聚合活性。但由于具有5-3外切活性，现在外切活性，现在已不再使用，而改用已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶酶和反转录酶（详见后面）。（详见后面）。对对

10、3突出端的突出端的DNA作末端标记（交换或置作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用换反应），但是此反应用T4或或T7DNA聚合聚合酶效果会更好酶效果会更好。河南科技大学河南科技大学24（二）（二）KlenowDNA聚合酶聚合酶 v无无53外切活性外切活性v有聚合活性有聚合活性v有有35外切活性外切活性v由于没有由于没有5-3外切活性，使用范围进一步扩大外切活性，使用范围进一步扩大河南科技大学河南科技大学25KlenowDNA聚合酶用途聚合酶用途补平补平3凹端凹端DNA。抹平抹平DNA3凸端。凸端。通过置换反应对通过置换反应对DNA进行末端标记。进行末端标记。在在cDNA克隆中合成第二链。克

11、隆中合成第二链。随机引物标记。随机引物标记。应用于应用于Sanger双脱氧链末端终止法的双脱氧链末端终止法的DNA测测序。序。应用于应用于PCR反应，现在已经被反应，现在已经被TaqDNA聚合聚合酶等取代。酶等取代。在体外诱变中，用于从单链模板合成双链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA。河南科技大学河南科技大学26（三）（三）T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶来源于聚合酶来源于T4噬菌体感噬菌体感染的染的E.coli，分子量，分子量114kDa。T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶与聚合酶与Klenow酶相似，但酶相似，但3-5外外切活性强切活性强200倍，且不从单

12、链倍，且不从单链DNA模板上替换模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高1倍。倍。河南科技大学河南科技大学27（五）逆转录酶（五）逆转录酶逆逆转转录录酶酶是是一一种种有有效效地地转转录录RNA产产生生cDNA的的酶酶。产产物物DNA称称cDNA，即即互互补补DNA(complementaryDNA)，该该酶酶又又称称为为依依赖赖于于RNA的的DNA聚聚合合酶酶(RNA-dependentDNApolymerase)。逆逆转转录录酶酶在在基基因因工工程程中中的的主主要要用用途途是是以以真真核核mRNA为为模模板板，合合成成cDNA，用用以以组

13、组建建cDNA文文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。河南科技大学河南科技大学28（六）末端转移酶（六）末端转移酶v来源于小牛胸腺来源于小牛胸腺v催化催化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端羟基端vdNTP为为T或或C，二价阳离子首选，二价阳离子首选CO2+；为；为A或或G首选首选Mg2+v对对3羟基突出末端的底物作用效率最高羟基突出末端的底物作用效率最高v在在cDNA或载体或载体3末端加同聚尾用于克隆末端加同聚尾用于克隆v用标记的用标记的rNTP、dNTP或或ddNTP来标记来标记DNA片段的片段的3末端。末端。河南科技大学河南科技大学29DNA聚合

14、酶在基因工程中的用途：聚合酶在基因工程中的用途：1)DNA分子的体外合成分子的体外合成2)体外突变体外突变3)DNA片段探针的标记片段探针的标记4)DNA的序列分析的序列分析5)DNA分子的修复分子的修复6)聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)等等河南科技大学河南科技大学30三、三、DNA连接酶与连接酶与DNA分子的体外连接分子的体外连接体外体外DNA片段的连接方式：片段的连接方式：（1）用）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段片段（2）用）用T4DNA连接酶将平端的连接酶将平端的DNA片段连接起来片段连接起来（3）先先在在DNA片片段段的的末末端端加加

15、上上化化学学合合成成的的衔衔接接物物或或接接头头，使使之形成粘性末端之后，再用之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来连接酶将它们连接起来。注注意意：1、DNA连连接接酶酶不不能能连连接接两两条条单单链链的的DNA分分子子或或环环化化单单链链的的DNA分分子子，被被连连接接的的DNA链链必必须须是是双双螺螺旋旋DNA分子的一部分。分子的一部分。用用于于将将两两段段乃乃至至数数段段DNA片片段段拼拼接接起起来来的的酶酶称称为为连连接接酶酶。它它催催化化DNA5磷酸基与磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。羟基之间形成磷酸二酯键。河南科技大学河南科技大学31具有具有3-OH和和5-P基团的缺

16、口基团的缺口被被DNA连接酶封闭起来连接酶封闭起来如果缺失一个或数个核苷酸的裂口如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来连接酶则不能将它封闭起来注意：2、连接酶如果缺失一个或数个核苷酸的裂口如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来连接酶则不能将它封闭起来河南科技大学河南科技大学32四、四、其他酶类其他酶类 1、T4多核苷酸酶多核苷酸酶T4多多核核苷苷酸酸酶酶催催化化ATP的的-磷磷酸酸基基转转移移至至DNA或或RNA片段的片段的5-未端。未端。在基因工程中主要用于：在基因工程中主要用于：1)标记标记DNA片段的片段的5-端，制备杂交探针，端，制备杂交

17、探针，2)基因化学合成中，寡核苷酸片段基因化学合成中，寡核苷酸片段5-磷酸化，磷酸化，3)用于测序引物的用于测序引物的5-磷酸标记。磷酸标记。河南科技大学河南科技大学332 2、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的功功能能是是去去除除DNA或或RNA 5-未未端端的的磷磷酸酸基基，反反应可表示为：应可表示为：碱性磷酸酶碱性磷酸酶5p DNA或或5p RNA 5HO DNA或或5OH RNA碱性磷酸酶可用于：碱性磷酸酶可用于：1)去去除除DNA片片段段5磷磷酸酸，以以防防止止在在重重组组中中的的自自身身环环化化，以以提提高高重重组效率。组效率。2)在在用用r-32PATP标标记记DNA

18、或或RNA的的5-磷磷酸酸前前，去去除除DNA或或RNA片段的非标记片段的非标记5-磷酸。磷酸。河南科技大学河南科技大学34利利用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶CIP防防止止载载体体的的再再环环化化pUC19SacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPslISphIHind III对接DNA可通过凝胶电泳纯化靶DNA3OH3OH5”P5”P5”P5”P3OH3OH用T4噬菌体DNA连接酶连接去磷酸化的质粒与靶DNA3OH3OH3OH3OH用CIP去除5P限制性内切酶3OH3OH3OH3OH鉴定重组子：检查a互补能力的丧失情况核酸杂交对小量制备的质粒DNA进行酶切分析CIP：牛小肠提取：牛小肠提

19、取BAP:大肠杆菌提取大肠杆菌提取河南科技大学河南科技大学353、核酸酶、核酸酶（nuclease）核酸外切酶：可降解核酸外切酶：可降解dsDNA中或中或DNA-RNA中的中的一条链一条链核酸内切酶：可切割核酸内切酶：可切割DNA链中的单链链中的单链（1）BAL31核酸酶（核酸酶（BAL31nuclease）：）：来源于交替单胞菌来源于交替单胞菌，主要活性为，主要活性为3外切核酸酶外切核酸酶活性，可从线性活性，可从线性DNA两条链的两条链的3端迅速去除端迅速去除单核苷酸，随后可从单链单核苷酸，随后可从单链DNA内部发挥缓慢的内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链内切酶活性，形成截短了的

20、平端双链DNA分子分子（约占（约占10-20%）以及带有约）以及带有约5个核苷酸突出个核苷酸突出单链的截短分子（约占单链的截短分子（约占80-90%）。对于所形）。对于所形成的单链突出，可用成的单链突出，可用DNA聚合酶补平。聚合酶补平。河南科技大学河南科技大学36（2）Sl核酸酶（核酸酶（S1nuclease）Sl核酸酶来源于米曲霉，可降解单链核酸酶来源于米曲霉，可降解单链DNA或或RNA，是一种单链核酸酶。产生带，是一种单链核酸酶。产生带5磷酸磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链，对的单核苷酸或寡核苷酸双链，对dsDNA、dsRNA和和DNA:RNA杂交体不敏感。酶浓度杂交体不敏感。酶浓度大时可完

21、全消化双链，中等浓度可在切口或小缺大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。口处切割双链。该酶可用于分析该酶可用于分析DNA:RNA杂交体的结构，杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链打开双链cDNA合成中产生的发荚环。合成中产生的发荚环。河南科技大学河南科技大学37（3）脱氧核糖核酸酶）脱氧核糖核酸酶（DNase）DNase来源于牛胰，是内切核酸酶，可来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。在。在Mg2+存在下，独立作用于每条存在下，独立作用于

22、每条DNA链，链，且切割位点随机。在且切割位点随机。在Mn2+存在下，它可在两存在下，它可在两条链的大致同一位置切割条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或，产生平端或1-2个核苷酸突出的个核苷酸突出的DNA片段。片段。河南科技大学河南科技大学38（4）核糖核酸酶）核糖核酸酶A（RibonucleaseA或或RNaseA）核糖核酸酶核糖核酸酶A来源于牛胰，为内切核酸酶，来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击可特异攻击RNA上嘧啶残基的上嘧啶残基的3端。可除去端。可除去DNA:RNA中未杂交的中未杂交的RNA区，可用来确定区，可用来确定DNA或或RNA中单碱基突变的位置。广泛用来中单碱基突变的

23、位置。广泛用来去除去除DNA样品中的样品中的RNA。核糖核酸酶核糖核酸酶A商品制剂可能会污染其它酶商品制剂可能会污染其它酶（如（如DNA酶），使用前应加热使酶），使用前应加热使DNA酶失活。酶失活。河南科技大学河南科技大学39第三节第三节基因工程的载体基因工程的载体 将外源将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体。的工具称为载体。一、基因工程一、基因工程载体的概念：载体的概念：河南科技大学河南科技大学40二、基因工程载体的分类：二、基因工程载体的分类：基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表

24、达。传代乃至表达。目前已构建应用的基因工程载体主要有目前已构建应用的基因工程载体主要有质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体人工构建的组合载体人工构建的组合载体河南科技大学河南科技大学41一、一、细菌质粒载体细菌质粒载体质粒介绍：质粒介绍：质粒质粒(plasmid)是是能自主复制的双链环状能自主复制的双链环状DNA分子分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从分子，其大小可从1kb到到300kb。质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿

25、藻和真菌细胞中也存在质粒。质粒细胞中也存在质粒。质粒DNA的特点为：的特点为：（1）双链环状；）双链环状；（2）分子量很小；）分子量很小；（3）自主或半自主复制；）自主或半自主复制；（4）不同生物质粒中的基因种类不同。）不同生物质粒中的基因种类不同。河南科技大学河南科技大学42 从从分分子子量量大大小小看看,质质粒粒DNA只只占占细细胞胞染染色色体体组组的的一一小小部部分分，一一般般约约为为1-3%，但但却却编编码码着着一一些些重重要要的的非非染染色色体体控控制制的的遗遗传传性性状状。质质粒粒赋赋予予寄寄主主细细菌菌一一些些额额外外的的特特性性，包包括括抗抗性性特特征征，代代谢谢特特征征，修修

26、饰饰寄寄主主生生活活方方式等。式等。由由质质粒粒DNA编编码码的的基基因因还还包包括括有有产产生生抗抗菌菌素素的的基基因因、芳芳香香族族化化合合物物降降解解基基因因、糖糖酵酵解解基基因因、重重金金属属抗抗性性基基因、产生细菌素的基因等等。因、产生细菌素的基因等等。河南科技大学河南科技大学431质粒的复制质粒的复制每个质粒都有一段每个质粒都有一段DNA复制复制起始位点的序起始位点的序列列，它帮助质粒，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。质粒的在宿主细胞中复制。质粒的复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。于宿主所编码的蛋白质和酶

27、。通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为位定义为复制子复制子）。）。河南科技大学河南科技大学44 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约每个细胞中拷贝数有限，大约1几个；松驰型几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。质粒拷贝数较多，可达几百。松驰型质粒松驰型质粒:复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如

28、如DNA聚合酶聚合酶、，依赖于，依赖于DNA和和RNA聚合酶聚合酶等等)来进行。来进行。严紧型质粒严紧型质粒:复制要求同时表达一个由质粒编码的复制要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质。蛋白质。2质粒的拷贝数质粒的拷贝数河南科技大学河南科技大学45河南科技大学河南科技大学463质粒的不相容性质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不不相容性相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不相容的质粒一般都利用同一复制系

29、统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现现30多个不相容群，如多个不相容群，如ColE1和和pMB1，pSC101和和p15A

30、。河南科技大学河南科技大学474转移性转移性质粒具转移性。它是指在自然条件下，很质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因宿主内。它需要移动基因mob，转移基因，转移基因tra，顺式因子，顺式因子bom 及其内部的转移缺口位及其内部的转移缺口位点点nic。可分为：可分为：1.转移转移2.带动转移带动转移河南科技大学河南科技大学485、选择标记、选择标记选择标记选择标记用于鉴别目标用于鉴别目标DNA（载体）的存（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。抗生素抗

31、性基因是目前使用最广泛的选择抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。标记。河南科技大学河南科技大学49氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化

32、-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。（1）氨苄青霉素抗性基因（）氨苄青霉素抗性基因（ampr）河南科技大学河南科技大学50（2）四环素抗性基因（）四环素抗性基因（tetr）四环素可与核糖体四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。性基因外，

33、还带有四环素抗性基因。河南科技大学河南科技大学51（3）氯霉素抗性基因（）氯霉素抗性基因（Cm r,cat）氯霉素可与核糖体氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性导性P1噬菌体（也携带噬菌体（也携带Tn9）。）。cat 基因编基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基（每个亚基23kDa）。在乙酰辅酶）。在乙酰辅酶A存在的条存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体

34、结合。衍生物，使之不能与核糖体结合。河南科技大学河南科技大学52（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（）卡那霉素和新霉素抗性基因（kan r,neor）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（酸转移酶（APH（3）-,25kDa）的基因，）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。从而干扰了它们向细

35、胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。保护宿主不受这些抗生素的影响。河南科技大学河南科技大学53二、质粒载体的种类二、质粒载体的种类（一）克隆载体（一）克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存克隆载体主要用于扩增或保存DNA片片段，是最简单的载体。段，是最简单的载体。克隆克隆载体必须具备的基本条件：载体必须具备的基本条件：具有复制起点具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有抗菌素抗性基因具有若干个限制酶单一识别位点具有若干个限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数河南科技大学河南科

36、技大学54（1)质粒载体质粒载体pBR322pBR322大大小小为为4361bp，由由人人工工改改造造而而来来，有有一一个个复复制制起起点点、一一个个抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素基基因因、一一个个抗抗四四环环素素基基因因、多种限制酶切点（多种限制酶切点（36个），可容纳个），可容纳5kb左右外源左右外源DNA。优点优点:具具有有较较小小的的分分子子量量。易易于于自自身身DNA的的纯纯化化及及克克隆隆载载体体的的纯纯化化具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号具具有有较较高高的的拷拷贝贝数数。且且经经氯氯霉霉素素扩扩增增后后，每每个个细细胞胞中中可可累累计

37、计10003000个拷贝。个拷贝。河南科技大学河南科技大学55The bacterial chromosome and bacterial plasmids,as shown in the electron microscope.Plasmid DNACircular structurePlasmid DNACircular structureBroken cell河南科技大学河南科技大学56Broken cellThe use of plasmid pBR322 as a cloning vector,showing how insertion of foreign DNA causes i

38、nactivation of the tetracycline resistance gene,permitting easy identification of transformants containing the cloned DNA fragment河南科技大学河南科技大学57外外源源基基因因克克隆隆入入质质粒粒载载体体的的过过程程酶处理酶处理防止自防止自身环化身环化缺缺口口由由宿宿主主细细胞胞的的连连接接酶修复酶修复河南科技大学河南科技大学58DNA cloning using bacterial plasmidsE.ColichromosomePlasmidPurifyplasm

39、id DNAPurifyhuman DNATreat with EcoR1 to cleave both human and bacterial DNA into different sized fragmentsInsulin geneIncubate E.coli cellsunder conditionswhere they will takeup plasmids fromthe mediumPopulation of plasmidscontaining differentsegments of human DNAPlasmid freeE.coliJoin fragmentsint

40、o recombinantDNAs with DNAligaseRibosomalRNA gene河南科技大学河南科技大学59（2）质粒载体质粒载体pUC18/19这这对对载载体体由由2686bp组组成成，带带有有pBR322的的复复制制起起始始位位点点，一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和一一个个大大肠肠杆杆菌菌乳乳糖糖操操纵纵子子-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因(lacZ)的的调调节节片片段段，一一个个调调节节lacZ基基因因表表达达的的阻阻遏遏蛋蛋白白(repressor)的基因的基因lacI，还有多个单克隆位点。，还有多个单克隆位点。由由于于pUC质质粒粒含含有有Ampr抗抗

41、性性基基因因和和lacZ基基因因，可以通过颜色反应和可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选。对转化体进行双重筛选。河南科技大学河南科技大学60多克隆多克隆位点位点质粒载体质粒载体pUC 19 在在pBR322基础上基础上构建的系列载体构建的系列载体Lac Z 半乳糖苷酶基因，在含半乳糖苷酶基因，在含Xgal培培养基上呈蓝色，插入外源养基上呈蓝色，插入外源DNA，重组，重组子培养呈白色子培养呈白色MSC 区区段段pUC优点：优点：q具有更小的分子具有更小的分子量，更高的拷贝量，更高的拷贝数；数；q适用于用组织化适用于用组织化学方法检测重组学方法检测重组子；子；q具有多克隆位点具有多克隆位

42、点MSC区段，与区段，与M13mp8噬菌体噬菌体相同的克隆区段相同的克隆区段河南科技大学河南科技大学61（二）其他质粒载体（二）其他质粒载体1、低拷贝数载体、低拷贝数载体2、检测转录控制信号的载体、检测转录控制信号的载体3、表达载体：是在常规克隆载体的基础上衍生而、表达载体：是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件物分泌、分离或纯化的元件河南科技大学河南科技大学62噬菌体噬菌体噬噬菌菌体体内内含含双双链链环环形形、单单链链环环形形、双双链链线线形形、单单链链线线形形等等多多种种形形式式、大大小小不

43、不一一的的DNA，最最常常见见的的是是双双链链线线形形DNA,且感染率高。且感染率高。0.02-0.3 m二、二、噬菌体噬菌体(Bacterophage)载体载体河南科技大学河南科技大学63 噬噬菌菌体体的的形形态态 河南科技大学河南科技大学64 噬菌体噬菌体275,000,Scanning electron microscopy河南科技大学河南科技大学65噬菌体特性：噬菌体特性：含有线性双链含有线性双链DNA分子，其长度为分子，其长度为48502bp，两端各有两端各有12个核苷酸组成的个核苷酸组成的5端凸出的互补粘性末端凸出的互补粘性末端端(cohesiveend,cos)，当，当DNA进入

44、宿主细胞进入宿主细胞后，互补粘性末端连接成为环状后，互补粘性末端连接成为环状DNA分子。连接处分子。连接处称之为称之为cos位点。位点。噬菌体为温和噬菌体，噬菌体为温和噬菌体，DNA可以整合到宿主细可以整合到宿主细胞染色体胞染色体DNA上，以溶源状态存在，随染色体的复上，以溶源状态存在，随染色体的复制而复制制而复制河南科技大学河南科技大学66噬菌体能包装DNA长度的75%-105%的外源DNA，约3854kb，即使不对DNA进行改造，也允许承载5kb大小的外源DNA片段带入受体细胞。DNA上的D基因和E基因对噬菌体的包装起决定性作用，缺任何一种基因都将导致噬菌体不能包装。在宿主(受体)细胞中积

45、累大量供包装用的其它壳蛋白。DNA分子上有多种限制性内切酶的识别序列，便于用这些酶切割产生外源DNA片段的插入和置换。但是有的酶在DNA上有多个识别序列，有的识别序列位于必需基因区域，将影响外源DNA片段的插入和置换。河南科技大学河南科技大学67 噬噬菌菌体体的的cos末末端端COS5-CGGGGCGGCGACTCG-33-GCCCCGCCGCTGAGC-55-CG GGGCGGCGACTCG-33-GCCCCGCCGCTGA GC-5 COS非必须区非必须区长臂长臂(左左)短臂短臂(右右)噬菌体噬菌体 噬菌体染色体组噬菌体染色体组蛋白蛋白外壳外壳DNA 噬菌体噬菌体COS末端末端连接（感连接

46、（感染后）染后）裂解（包裂解（包装过程）装过程）河南科技大学河南科技大学68构建构建噬菌体载体的基本途径为：噬菌体载体的基本途径为：抹抹去去某某种种限限制制性性内内切切酶酶在在DNA分分子子上上的的一一些些识识别别序序列列，只只在在非非必必需需区区保保留留1-2个个识识别别序序列列。若若保保留留1个个识识别别序序列列，可可供供外外源源DNA插插入入，若若保保留留2个个识识别别序序列列，则则两两个个识识别别序序列列之之间间的的区区域域可可被被外源外源DNA片段置换。片段置换。用用合合适适的的限限制制性性内内切切酶酶切切去去部部分分非非必必需需区区，但但是由此构建的是由此构建的DNA载体不应小于载

47、体不应小于38kb。在在DNA分分子子合合适适区区域域插插入入可可供供选选择择的的标标记记基基因。因。河南科技大学河南科技大学69噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型插入型载体：插入型载体：外外源源DNA克克隆隆到到插插入入型型载载体体分分子子上上，会会使使噬噬菌菌体体的的某某种生物功能丧失效力种生物功能丧失效力.q免免 疫疫 功功 能能 失失 活活（inactivation of immunityfunction)q大大肠肠杆杆菌菌 半半乳乳糖糖苷苷酶酶失失活活（inactivation ofE.coli-galactosidase)替换型载体替换型载体载体载体DNA分子中有一段可以被替

48、换的分子中有一段可以被替换的DNA片断片断河南科技大学河南科技大学70用用噬噬菌菌体体作作为为克克隆隆载载体体河南科技大学河南科技大学71 噬菌体噬菌体DNA的复制的复制（1)感染早期，环形感染早期，环形DNA分子可以按分子可以按 形式从双向进行形式从双向进行复制；感染晚期，复制；感染晚期，滚动复制。滚动复制。（2)稳定整合到染色体稳定整合到染色体DNA上复制。上复制。噬菌体载体可以成功的应用来作为扩增外源基因拷贝数噬菌体载体可以成功的应用来作为扩增外源基因拷贝数的克隆载体，使外源基因得到最大限度的表达。已经应的克隆载体，使外源基因得到最大限度的表达。已经应用用 噬菌体载体实现基因克隆和表达的

49、有噬菌体载体实现基因克隆和表达的有DNA连接酶、连接酶、DNA聚合酶聚合酶I和聚合酶和聚合酶III 亚基等。亚基等。河南科技大学河南科技大学72基基因因工工程程的的主主要要目目的的是是通通过过优优良良性性状状相相关关基基因因的的重重组组，获获得得具具有有高高度度应应用用价价值值的的新新物物种种。为为此此，须须从从现现有有生生物物群群体体中中，根根据据需需要要分分离离出出可可用用于于克克隆隆的的此此类类基基因因。这这样样的的基基因因通通常常称称之之为为目目的的基基因因。目目的的基基因因主主要是要是结构基因结构基因。目的基因：目的基因：纯度很高纯度很高片断大小适于重组操作片断大小适于重组操作 第四

50、节第四节获得真核生物目的基因的方法获得真核生物目的基因的方法河南科技大学河南科技大学73目的基因的获得方法目的基因的获得方法分离分离化学合成化学合成 河南科技大学河南科技大学74一、利用一、利用PCR法获取目的基因法获取目的基因1.PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式聚合酶链式反应，是反应，是80年代发展起来的新技术，是通过模拟体年代发展起来的新技术，是通过模拟体内内DNA复制的方式，在体外选择性地将复制的方式，在体外选择性地将DNA某个某个特殊区域扩增出来的技术。特殊区域扩增出来的技术。摘要：摘要：其过程与其过程与DNA复制一样有三个步骤：模板变复制一样有三个步