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1、地地高高辛辛标标记记与与检检测测 D DN NA A试试剂剂盒盒说说明明书书 SANY GROUP system office room【SANYUA16H-地地 高高 辛辛 标标 记记 与与 检检 测测 D D N N A A 试试 剂剂 盒盒DIGDNALabelingandDetectionKitDIGDNALabelingandDetectionKit采用地高辛-dUTP进行随机引物 DNA标记,碱性标记,利用NBT/BCIP酶联免疫,随时即用。此试剂盒可对 10ng-3gDNA 进行 25 次标记反应,可检测 1010cm2面积的杂交膜 50张指导手册指导手册1 1 前言前言1.11
2、.1 内容表内容表1 1 前言前言1.1 内容表1.2 试剂盒成分2.2.介绍介绍2.1 产品简介3.3.操作步骤和所需材料操作步骤和所需材料3.1 在你开始前3.2 流程图3.3 地高辛标记 DNA3.4 标记效率的确定3.5DNA的转移和固定3.6 杂交3.7 免疫检测3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.21.2 试剂盒的成分试剂盒的成分瓶号瓶号12标记标记无标记对照 DNA1无标记对照 DNA22管 1mL3DNA稀释缓冲液50g/mL鱼精 DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0 在 25澄清溶液20LDIG标记的对照DNA5g/mL质粒 pBR328DNA(用 Ba
3、mHI线性化)澄清溶液用于确定标记效率567六聚核苷酸混合物标记用混合物DNA聚合酶 1 大片段标记级200L8抗地高辛的碱性磷酸酶结合物750U/mL从羊中获取的,Fab段,结合碱性磷酸酶澄清溶液内容内容包括功能包括功能4910NBT/BCIP封阻试剂附加仪器与所需试剂附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外,你必须准备一些溶液。在下表中,你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息。操作程序操作程序3.3DIG-DNA标记水浴仪器设备仪器设备试剂试剂灭菌的双蒸水0.2MpH8.0 灭菌的EDTA3.4标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组
4、合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备尼龙膜,带正电荷*杂交袋*,或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶(分子杂交炉)注意:当用地高辛杂交缓冲液工作时,不要用开口的托盘。3.7免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*TE缓冲液或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液2SSC或者 10SSCDIGEasyHyb(杂交缓冲液,需单独购买)3.6杂交检测缓冲液3.8DNA斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴DMF0.2MNaOH,0.1%SDS2SSC*标记的产品可以从 RocheAppliedScience获得。2.2.介绍
5、介绍2.12.1 产品概况产品概况实验原则实验原则此试剂盒采用 DIG(地高辛),一种甾类半抗原,steroidhapten去标记 DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。步骤步骤描述描述根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的 DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生DNADNA 标记标记产的反应混合物,其中含有地高辛 dUTP,碱性标记和所有的试剂,包括随机引物标记所必须的酶,已预先混合优化的 5浓度反应缓冲液。根据标准方法,地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核杂交杂交酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP 能够更加容易和有效的被洗脱下来,使固定在膜上的核酸可以与其
6、他的地高辛标记探针再次杂交。杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测,免疫检测免疫检测Fab段,然后采用即时可用的化学发光底物 NBT/BCIP可以看到杂交结果。应用应用地高辛标记 DNA探针可以用于:所有类型的滤膜杂交样品材料样品材料至少 100bp的 DNA片段线性的质粒,cos质粒或者 DNA超螺旋的 DNA实验时间实验时间步骤步骤DNA标记杂交免疫检测显色检测数量检测数量一个试剂盒足够用于:25 个标准的标记反应,每个反应的膜板 DNA 不超过 3g;并可以检测 50张 1010cm2的杂交膜。质量控制质量控制反应时间反应时间1h-O/N6horO/N1.5h0.5-16h根据操
7、作步骤中的说明对未标记的对照 DNA【pBR328】进行标记,并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用 0.1pg同源 DNA 点在膜上 16h 后成色显影检测。试剂盒的储存和稳定性试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15到-25(保质期印在标签上)。在干冰中运输。一旦开封,请根据下表选择适宜的储存条件。试剂盒成分试剂盒成分储存条件储存条件抗地高辛碱性磷酸酶结合物(8号管)2-8稳定。NBT/BCIP2-8,避光保存(9号管)或者 15-25保存 4 周封阻液(10 号管)未开封时,2-8或者 15-25稳定;一旦开封,应分装并储存在-15到-25或者无菌条件下 2-
8、8间可以稳定保存 1个月;工作溶液都应是新鲜配制的灵敏度和特异性灵敏度和特异性采用 southern杂交从 1g 人胎盘 DNA(经 Bgl或 EcoR酶切)中检测到单拷贝基因。3 3实验步骤和所需材料实验步骤和所需材料3.13.1 在你开始前在你开始前主要的操作要求主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示:要求要求在清洁的条件下进行操作指引指引高压灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括:SDS,吐温 20,并应该加入到已灭菌的溶液中。用干净的孵育托盘处理膜的要求每次使用前都要严格地清洗实验托盘带无粉手套处理膜的时候,只能够用干净的镊子夹膜的边缘3.23.2 流程图流程图3.33
9、.3 部分部分3.43.4 部分部分3.53.5 部分部分3.63.6 部分部分3.73.7 部分部分3.83.8 部分部分3.33.3 地高辛标记地高辛标记 DNADNA介绍介绍随机引物标记的 DNA 带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂,这是一种含有随机六碳糖,dNTP 混合物的 5浓度标记混合物,其地高辛标记地高辛标记 DNADNA 标记效率的检测标记效率的检测 DNADNA 固定固定 杂交杂交 免疫检测免疫检测 洗脱和洗脱和 DNADNA 斑点与另一探针的杂交斑点与另一探针的杂交中 dNTP 混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP,标记级的 Klenow酶
10、和适合的反应缓冲液。附加设备和所需试剂附加设备和所需试剂水浴冰水混合物此表中列出了成分,储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。溶液溶液水成分成分高压灭菌的双蒸水0.2MEDTA,pH8.0储存条件储存条件/稳定性稳定性15-25,稳定用途用途稀释 DNAEDTA(乙二胺四乙酸)15-25,稳定终止标记反应模板模板 DNADNA:模板 DNA 所需特征:特征特征详细信息详细信息模板 DNA应该采用 theHighPurePlasmidIsolationKit 进行制备。纯度当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时,我们建议额外额外进行一次苯酚进行一次苯酚/氯仿抽提氯仿抽提以去除残余的蛋白质。在
11、标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用,那么此步骤也是需要进行的。为了获得理想的结果,模板 DNA应该线性化,且大小应该在100-10000bp以上。如果模板 DNA大于 10kb,那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为 4个核苷酸的限制性酶(如Hae)对模板进行酶解。上面步骤描述原则上 10ng-3g 的模板均可以标记上,然而请仔细查看在给定的表中,用于你的杂交实验所需的探针。可大小数量以根据提供的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因,需标如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因,需标记的模板记的模板 DNADNA 用量至少用量至少 3
12、00ng300ng(探针浓度:(探针浓度:25ng/mL25ng/mL 杂交杂交液)。液)。标记从琼脂糖凝胶上分离的标记从琼脂糖凝胶上分离的 DNADNA如果你想要完成基因组的 southern杂交,你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板 DNA从载体上分离出来。为了从凝胶中分离 DNA,你可以用琼脂糖凝胶 DNA提取试剂盒(theAgaroseGelDNAExtractionKit)进行大小在 400bp-5kbp范围内 DNA 片段的回收。这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后,不需要进一步纯化即可对 DNA片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高效的
13、 PCR 产物纯化试剂盒(HighPurePCRProductPurificationKit)进行纯化,以去除残留的琼脂糖颗粒。步骤步骤此步骤用于标记 10ng-3gDNA。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的 DNA(最高达 10g)。步步骤骤操作操作1向一个反应管仲中加入 10ng-3g 模板模板 DNADNA(线性或超螺旋)和高压灭菌的双蒸水,终体积达 15l;作为对照,向另一管中加入 5l 无标记对照DNA(Vial2)和高压灭菌水,终体积达 15l沸水浴 10 分钟以变性 DNA,然后迅速插入冰水混合物中注意:完全变性对于标记的有效性是十分重要的加入以下试剂到变性探针或对照 DNA
14、中:23试剂Vial5Vial6Vial7充分混合并简单离心;37孵育 1 小时或者过夜体积2L2L1L注意:较长的孵育时间(最高达 20小时)能够提高地高辛标记 DNA 的产量加入 2L0.2MEDTA(pH8.0)和/或 65加热 10 分钟终止反应4注意:采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到 1000bp 甚至更长,这主要取决于原始模板 DNA的长度标记反应的产量表 1:此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用 1gDNA 作为模板。1 小时内,大约有 15%的核苷酸参与到了0.8g新合成的地高辛标记 DNA中。20 小时
15、后消耗了大约 38%的核苷酸。模板 DNA10ng30ng100ng300ng1000ng3000ng1h15ng30ng60ng120ng260ng530ng20h50ng120ng260ng500ng780ng890ng使用 DIG-High-Prime 溶液,增加不同模板 DNA的量进行反应,并检测反应 1 小时和反应 20 小时的差异。地高辛标记 DNA的产量由放射线示踪器进行测定,并通过斑点杂交进行证实(10个独立标记实验的平均值)。3.43.4 标记效率的确定标记效率的确定介绍介绍地高辛标记 DNA产量的确定对于获得最佳的,具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高
16、容易产生背景,而太低浓度则容易导致信号弱。实验原则实验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤步骤1描述描述将地高辛标记 DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上;尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照 DNA(Vial4)作为标准。采用 anti-DIG-AP结合物(Vial8)和随时即用的 NBT/BCIP对尼龙膜进行免疫检测。比较地高辛标记 DNA 与对照 DNA的一系列稀释点的强度确定标记效率。2所需附加溶液的制备所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无 DNA酶和 RNA酶系列产品中获得。溶液
17、溶液洗涤缓冲液成分成分/制备制备0.1M 马来酸0.15MNaClpH7.5(20)储存储存/稳定性稳定性15-25,稳定用途用途去除未结合的抗体马来酸缓冲液检测缓冲液0.3%(v/v)Tween200.1M 马来酸15-25,稳定0.15MNaCl用 NaOH(固体)调节 pH 值到7.5(20)0.1MTris-HCl15-25,稳定0.1MNaClpH9.5(20)10mMTris-HCl1mMEDTApH8.015-25,稳定封阻液的稀释调整 pH 值到 9.5TE 缓冲液终止颜色反应试剂盒工作溶液的制备试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法:溶液溶液成分成分/制备方法
18、制备方法储存储存/稳定性稳定性用途用途用马来酸缓冲液按照 1:10的比例将 10 封阻液(10号瓶按体积封阻溶液比 10%溶解)稀释成 1 工作溶液每次使用前将原始管中的 anti-digoxigenin-AP(8 号管)10000rpm离心 5 分钟。然后从表面小心吸抗体溶液取所需用量。用封阻溶液按照1:5000(150mU/mL)的比例稀释 anti-digoxigenin-AP一直新鲜制备封阻膜上非特异结合位点2-8,12h与地高辛标记的探针结合取 40LNBT/BCIP(9号管)底物显色于 2ml 检测缓冲液中混匀液注意:避光保存稀释系列稀释系列即配即用根据合成核苷酸的预期产量开始下面
19、的的系列稀释,标记的探针和地高辛标记的探针和地高辛标记的对照标记的对照 DNADNA(Vial4Vial4)应该稀释到)应该稀释到 1ng/L1ng/L。利用第 3.3章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记 DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。注意:表 1 中给出的产量是采用高纯度的 DNA 模板在最佳条件下生产出的。按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照 DNA进行一系列的梯度稀释。DNADNA 稀释稀释缓冲液(缓冲液(3 3号管)号管)(L)(L)495354545454545501:1001:3.31:101:101:101:101:10-管管DNADNA(L
20、)(L)515555550来自于管来自于管#稀释比例稀释比例终浓度终浓度123456789操作步骤操作步骤稀释的原液1223456-1ng/L10pg/L3pg/L1pg/L0.3pg/L0.1pg/L0.03pg/L0.01pg/L0下面的步骤描述的是直接检测。注意:在全部的步骤中,用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。步骤步骤1操作操作分别从你标记的探针和标记对照 DNA的 2-9 号管中取出 1L点在尼龙膜上通过紫外交联或者 120烘烤 30 分钟的方法将核酸固定在膜上将膜转移到一个装有 20mL马来酸缓冲液的塑料容器中在 15-25中振荡孵育 2 分钟2345678在 10mL封阻液中孵育 3
21、0 分钟在 10mL抗体溶液中孵育 30 分钟用 10mL洗涤缓冲液洗涤两次,每次 15分钟在 10mL检测缓冲液中平衡 2-5分钟将膜上带有 DNA的一面朝上,放入盛有 2ml 底物显色液的盒子中,避光,15-25中孵育 5 分钟。注意:不能摇动;可适当打开盒子观察染色情况9结果分析结果分析待显色到适合的效果后用 TE缓冲液洗膜 5min,扫描比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异,并计算出地高辛标记 DNA的量。如果你的探针稀释后量达 0.1pg的点与对照 DNA的点均可见,那么说明标记的探针达到了预期的标记效率,能够满足杂交所需的探针浓度。3.5DNA3.5DNA 的转移和固定的转移和
22、固定转移方法和膜转移方法和膜凝胶电泳的标准操作方法,胶的变性和中和均参照参考文献中 Sambrook等的文章。胶中不加入 EB会更好,因为 EB 可能引起背景不均匀的问题。所有普通类型的 DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验;在实验中,在 20 SSC 中采用毛细管转移的方法将 DNA转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。注意:碱性转移(如在 0.4MNaOH中)不适用于地高辛标记分子量 marker的转移。固定操作固定操作将 DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作:如果你想采用如果你想采用那么那么将膜放到已经用 1010 SSCSSC 浸透的 Whatman3MM滤纸上。洗
23、涤之前用紫外交联这块湿润的膜紫外交联后,将膜放入双蒸水中简单冲洗一下,然后自然晾干。在 2 SSC 简单的洗涤一下膜120,烘烤(尼龙膜)将尼龙膜放在 120下烘烤 30分钟或者根据操作说明的要求进行操作。在 2 SSC 简单的洗涤一下膜将尼龙膜放在 80下真空烘烤 2小时紫外交联的方法(尼龙膜)80,烘烤(尼龙膜)膜的储存膜的储存请根据下表选择膜的储存方法。如果如果你想继续实验那么那么立即将这个膜进行预杂交如果你想稍后进行实验3.63.6 杂交杂交需要的附加设备需要的附加设备 DIGEASYHyb冰水浴震荡水浴或杂交炉那么将干燥的膜储存于 2-8耐高温的塑料或者玻璃盒,培养皿,滚筒瓶或者可密
24、封的塑料袋注意:不要用敞口的容器盛放杂交缓冲液杂交温度杂交温度适宜的杂交温度是根据 GC 含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的,具体的公式如下:Tm=49.82+0.41(%G+C)-(600/I)I=能够杂交上的片段的长度,以碱基对进行计算Topt.=Tm-(2025)这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有 50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度 Topt.要比计算出的 Tm低 20-25。Topt.可以作为一个严谨的杂交温度,允许探针和靶序列之间有 18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于 80%时,你应该相应的降低 Topt(大约每 1%的错
25、配要降低 1.4),同时相应的调整严谨洗涤步骤(即提高 SSC 浓度和降低洗涤温度)。操作步骤操作步骤请参照下表进行实验。步骤步骤1操作操作将适量体积的杂交缓冲液(杂交缓冲液(DIGEASYHyb)提前预热到杂交温度(37-42)。在适当的容器中温和振荡 30分钟进行预杂交。注意:膜应该自由的移动。尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。2变性地高辛标记的 DNA 探针:(在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL)将探针放入沸水浴中煮 5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。注意:因为 DIG-11-dUTP 是碱标记的,因此 DNA探针不能用碱处理(NaOH)的方法变性。3将变性的地高辛标记探
26、针加入到预热的地高辛杂交缓冲液(每100cm2的膜加入 3.5mL杂交缓冲液)中,充分混合但要避免产生泡沫(气泡容易产生背景)倒出预杂交液,向膜上加入探针杂交液的混合物;温和振荡孵育 4小时或延长孵育至过夜杂交液的储存杂交液的储存含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25,可以反复使用几次,在每次使用前需要 68新鲜变性 10 分钟。注意:不可以将杂交液煮沸。严谨洗涤严谨洗涤对于大部分 DNA:DNA 应用,用 0.5SSC 进行严谨洗涤已经足够。针对每个探针来说,正确的洗涤条件应该依据经验来确定。4对于人基因组 DNA,采用的条件是 0.5SSC,65。探针长度大于 150bp
27、 且 GC 含量高时,应在 68下进行洗涤。对于长度为 100bp 或更短的探针,洗涤温度应该降低。此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。步骤步骤12操作操作用足够的 22SSCSSC,0.1%SDS 连续振荡洗涤两次,每次 5 分钟。在 65-68,用足够的 0.50.5SSCSSC,0.1%SDS(提前预热到洗涤温度)连续振荡洗涤两次,每次 15分钟。3.73.7 免疫检测免疫检测需要附加的试剂需要附加的试剂请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无 DNA 酶和 RNA酶系列产品中获得。溶液溶液洗涤缓冲液成分成分/制备制备储存储存/稳定性稳定性0.1M
28、 马来酸15-25,稳定0.15MNaClpH7.5(20)0.3%(v/v)Tween200.1M 马来酸15-25,稳定0.15MNaCl用 NaOH(固体)调节 pH值到7.5(20)0.1MTris-HCl15-25,稳定0.1MNaClpH9.5(20)10mMTris-HCl1mMEDTApH8.015-25,稳定用途用途去除未结合的抗体马来酸缓冲液封阻液的稀释检测缓冲液调整 pH 值到 9.5TE缓冲液终止颜色反应试剂盒工作溶液的制备试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法:溶液溶液成分成分/制备方法制备方法用马来酸缓冲液按照1:10 的比例将 10封阻液(10 号
29、瓶按体积比10%溶解)稀释成 1工作溶液每次使用前将原始管中的 anti-digoxigenin-AP(8号管)10000rpm离心 5 分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照 1:5000(150mU/mL)的比例稀释 anti-digoxigenin-AP取 40LNBT/BCIP(9号管)底物显色液于 2ml 检测缓冲液中混匀注意:避光保存操作步骤操作步骤此表描述了完成一张 100cm2膜的免疫检测方法。注意:所有的孵育均是在 15-25下,振荡完成的。如果膜还需要再次与探针杂交,那么任何时候都不要让膜干。步骤步骤123储存储存/稳定性稳定性用途用途封阻溶液一直新鲜制备封阻膜上
30、非特异结合位点抗体溶液2-8,12h与地高辛标记的探针结合即配即用操作操作杂交和严谨洗涤后,将膜简单的用洗涤缓冲液冲洗 1-5分钟在 100mL封阻液中孵育 30 分钟在 20mL抗体溶液中孵育 30 分钟45用 100mL洗涤缓冲液洗涤两次,每次 15分钟在 20mL检测缓冲液中平衡 2-5分钟将膜上带有 DNA的一面朝上,放入盛有 10ml 底物显色液的盒子中,避光,15-25中孵育 5 分钟注意:不能摇动;颜色可在数分钟内显现,持续 16h;可适当打开盒子观察染色情况待显色到适合的效果后用 50mlTE 缓冲液洗膜 5min,扫描673.8DNA3.8DNA 印记的洗脱和再次探针杂交印记
31、的洗脱和再次探针杂交主要信息主要信息印记中的碱性标记形式的 DIG-11-dUTP 能够更容易更有效的被洗脱,以用于再一次的杂交实验。所需附加的仪器和试剂所需附加的仪器和试剂DMF22SSCSSC0.2NNaOH,0.1%SDS操作步骤操作步骤此操作描述的是膜的洗脱。注意:如果计划印记需要洗脱和再次杂交,那么膜在任何时候都不能干。步骤步骤操作操作用大烧杯水浴加热 DMF到 50-601将膜放入其中直到蓝色颗粒从膜上脱落双蒸水充分洗涤23在 37条件下,用含有 0.1%SDS 的 0.2MNaOH洗涤两次,每次 20 分钟,以去除地高辛标记的探针用 22SSCSSC 充分洗涤 5 分钟4空气中干燥或用另一个探针进行预杂交和杂交洗脱后的膜需要的储存条件洗脱后的膜需要的储存条件一旦膜被洗脱,可以将膜放在马来酸缓冲液中或者 2SSC 中准备再用。5 5 附录附录20SSC成分及终浓度配制 1L溶液各成分的用量300mmol/L柠檬酸三钠(二水)88.2g3mol/L氯化钠175.3g水补足 1L溶解柠檬酸三钠(二水)和氯化钠于约 0.9L 水中,调 pH为 7.0,用水补足体积至 1L。
限制150内