《基因诊断》课件.ppt

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1、第十四章第十四章基因诊断基因诊断第一节第一节概述概述一、一、什么是基因诊断什么是基因诊断 所所谓谓基基因因诊诊断断，就就是是在在基基因因水水平平上上对对疾疾病病或或人人体体的的状状态进行诊断，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。态进行诊断，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。是以是以DNADNA和和RNARNA为诊断材料，利用分子生物学技术，为诊断材料，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程；其通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程；其临床意义在于能检测临床意义在于能检测DNADNA或或RNARNA的结构变动与否，量的多的结构变动与否，量的多少及表达

2、情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。二、基因诊断的概念界定以下二、基因诊断的概念界定以下6 6个方面内容：个方面内容：（一）诊断水平（一）诊断水平 基因水平基因水平 （二二）诊诊断断技技术术 从从方方法法学学来来说说，没没有有特特殊殊的的基基因因诊诊断断方方法法，就就是是分分子子生生物物学技术在临床上的应用。学技术在临床上的应用。（三）诊断材料（三）诊断材料 DNA DNA和和RNA RNA。（四）诊断内容（四）诊断内容 1 1、对于内源性基因来说

3、：基因结构和表达是否异常。、对于内源性基因来说：基因结构和表达是否异常。2 2、对对于于外外源源性性基基因因来来说说：入入侵侵基基因因的的种种类类，是是病病毒毒核核酸酸、细细菌菌质质粒粒还还是是寄生虫寄生虫DNA.DNA.（五）诊断途径（五）诊断途径 1 1、直直接接检检查查基基因因结结构构是是否否存存在在：DNADNA点点突突变变、缺缺失失插插入入、基基因因重重排排、染染色体畸变、色体畸变、mRNAmRNA剪接缺失错位或结构变化等。剪接缺失错位或结构变化等。2 2、检查基因转录产物、检查基因转录产物mRNAmRNA：1 1）已经转录还是没有转录？）已经转录还是没有转录？2 2）应该转录还是不

4、应该转录？应该转录还是不应该转录？3 3）转录正常、过量还是过少？转录正常、过量还是过少？3 3、检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。（六）（六）诊断目的诊断目的 1 1、确诊相应疾病或得出相应结论。确诊相应疾病或得出相应结论。2 2、是防治疾病或基因治疗的根据。是防治疾病或基因治疗的根据。三、基因诊断的思路三、基因诊断的思路 （一）基因是随便能诊断的吗？总不能乱诊断吧？（一）基因是随便能诊断的吗？总不能乱诊断吧？（二）基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别（二）基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别 和联系？和联系？（三）基因诊断的理论基础和技

5、术（三）基因诊断的理论基础和技术 能不能诊断能不能诊断 诊断学基础诊断学基础 怎样诊断？怎样诊断？为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法表表1表型诊断（传统方法）表型诊断（传统方法）基因诊断基因诊断（一一）诊诊断断依依据据疾疾病病表表型型变变化化基基因因结结构构异异常常和和表达异常表达异常（二）分（二）分类类临床诊断（病因、病解、病生）临床诊断（病因、病解、病生）DNA诊断诊断血血清清学学诊诊断断RNA诊诊断断生化学诊断生化学诊断（三三）特特异异性性表表型型改改变变在在很很多多情情况况

6、下下是是非非特特以以探探测测基基因因为为目目标标，只只要要异性的，往往难以明确诊断，异性的，往往难以明确诊断，有特异性探针，利用分子有特异性探针，利用分子延误病情如延误病情如FOU?杂交原理即可杂交原理即可诊断，具有诊断，具有 很高的特异性。很高的特异性。（四四）敏敏感感性性探针可用探针可用“放标放标”或或“非放非放 诊断灵敏度高，标本只需诊断灵敏度高，标本只需 微量，微量，DNApg水平即可。水平即可。（五）早期诊断（五）早期诊断因为表型改变往往出现较晚，因为表型改变往往出现较晚，在表型改变之前，基因在表型改变之前，基因难难以以早早期期诊诊断断结结构构或或表表达达已已发生改变，发生改变，故往

7、往可以早期诊断。故往往可以早期诊断。（六）基因诊断范围广（六）基因诊断范围广 因因为为：探探针针可可为为任任何何来来源源和和种种类类，序序列列可可为为已已知知或或未未知知，目目标标可可为为特特定定基基因因或或 特特定定基基因因组组合合，外外源源性性或或内内源源性性基基因因，所所以适应性强，诊断范围广。以适应性强，诊断范围广。被被检检查查基基因因是是否否处处于于活活化化状状态态并并不不重重要要，故故可可对对分分化化阶阶段段表表达达特特异异性性基基因因及及其其异异常常进进行行检检测测和和诊诊断断，这这对对肿肿瘤瘤（如如CMLCML）疗效及预后尤为重要。）疗效及预后尤为重要。在在感感染染性性疾疾病病

8、的的诊诊断断，能能检检查查正正在在生生长长或或潜潜伏伏病病原原体体，能能明明确确既既往往感感染染或或现现行行感感染染，对对不不易易诊诊断断（如如产产毒毒性性E.coliE.coli）和和不不能能安安全全培培养养（如如立立克克次次体体）进进行行基基因因诊诊断断，扩扩大大了了实实验验室室诊诊断范围。断范围。（七）二者关系（七）二者关系1.基基因因诊诊断断必必须须建建立立在在临临床床一一般般检检查查的的基基础础上上，它它必必须须是是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）2.基基因因诊诊断断是是分分子子生生物物学学和和医医学学遗遗传传学学发发展展到

9、到今今天天人人们们的的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。3.尽尽管管实实验验研研究究和和临临床床应应用用技技术术原原理理相相同同，但但诊诊断断对对象象是是人的时候应该慎重！（不能乱诊断）人的时候应该慎重！（不能乱诊断）4.同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云（举例）。同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云（举例）。细胞膜细胞核DNAmRNA转录翻译（protein）临床表现基因诊断生化诊断血清学诊断临床诊断图一 基因诊断与表型诊断（五）基因诊断与诊断学（五）基因诊断与诊断学（一一）诊诊断断是是用用医医学学科科学学的的方方法法对对疾疾病病的的表表现现所

10、所作作出出的的辩辩证证逻逻辑辑的的结论。诊断目的：为了防御疾病和进健康。结论。诊断目的：为了防御疾病和进健康。（二二）诊诊断断学学是是论论述述诊诊断断疾疾病病的的基基本本原原则则和和方方法法的的一一门门课课程程。其其基基本本原原则则就就是是研研究究症症状状体体征征发发生生的的基基本本规规律律和和机机理理以以及及建建立立诊诊断断的的思思维维程程序序。基基本本诊诊断断方方法法包包括括：询询问问病病史史、体体检检、实实验验室室检检查查、以以及及其其他他检检查查如如：心心电电图图、超超声声检检查查、内内窥窥镜镜、CT、核核磁磁共共振振等等等。等。（三三）基基因因诊诊断断是是诊诊断断学学的的续续写写，是

11、是诊诊断断学学的的新新篇篇章章，从从这这个个意意义义上来说：上来说：基因诊断遵循诊断学的基本原则；基因诊断遵循诊断学的基本原则；基基因因诊诊断断的的基基础础是是医医学学基基础础，专专业业基基础础是是医医学学分分子子生生物物学学和和医医学学遗遗传传学学，不不同同的的是是我我们们在在基基因因水水平平上上，学学习习和和研研究究：基基因因解解剖剖（结结构构）、基基因因生生理理（转转录录翻翻译译等等）、基基因因病病解解（结结构构异异常常），基基因因病病生生（表表达达异异常常），然然后后主主要要应应用用分分子子生生物物学学技技术术手手段段进进行行基因诊断。基因诊断。（六）基因诊断的思维程序：（六）基因诊断

12、的思维程序：第一套：逆向遗传学（第一套：逆向遗传学（reversegenetics）思维程序思维程序1.提取人类基因组（总）提取人类基因组（总）DNA；2.建立建立DNA文库（文库（DNABANK）；）；3.克隆任一克隆任一DNA片段作为探针。片段作为探针。4.确确立立该该探探针针在在基基因因组组中中的的位位置置；这这种种探探针针在在基基因因组组中中的的位位置置一一旦旦被确定下来，就可以成为遗传标记（被确定下来，就可以成为遗传标记（geneticmarker）.5.大大量量应应用用此此类类新新的的遗遗传传标标记记(用用染染色色体体步步移移法法或或染染色色体体跳跳跃跃法法)建建立各条染色体的连锁

13、基因图谱，最终建立整个人类的基因图谱。立各条染色体的连锁基因图谱，最终建立整个人类的基因图谱。6.筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人；筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人；7.克克隆隆病病变变基基因因8.比比较较正正常常基基因因和和异异常常基基因因的的差差别别推推测测正正常常异异常常基基因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。第二套第二套拿来主义拿来主义1.您诊断您诊断/研究的疾病是否：与研究的疾病是否：与/有有/知道知道1）基因有关；）基因有关；2）该基因的正常）该基因的正常/异常序列；异常序列；3）该基因结构）该基因结构/表

14、达异常的类型；表达异常的类型；4）特异性探针）特异性探针/PCR引物；引物；5）转录物；）转录物；6）表达产物）表达产物/表达产物功能表达产物功能/表达产物功能测定方法。表达产物功能测定方法。2.据据1设计基因诊断方案。设计基因诊断方案。第二节第二节基因诊断的分子生物学基础基因诊断的分子生物学基础一、基因诊断的理论一、基因诊断的理论（一）生物大分子结构和功能（一）生物大分子结构和功能（二）基因组结构和功能（二）基因组结构和功能（三）遗传信息的复制和表达（三）遗传信息的复制和表达（四）基因表达的调控（四）基因表达的调控（五）细胞通讯与细胞信号转导的分子机制（五）细胞通讯与细胞信号转导的分子机制（

15、六）癌基与抑癌基因（六）癌基与抑癌基因（七）基因与疾病（七）基因与疾病二、二、基因诊断的技术基因诊断的技术（一）核酸分子杂交，（一）核酸分子杂交，在这些方法中，在这些方法中，1.Southern印迹法印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。分析、基因突变分析等。2.Northern印迹法印迹法可用于组织细胞中总可用于组织细胞中总RNA或或mRNA的定性和定的定性和定量分析。量分析。3.斑点杂交斑点杂交可用基因组中特

16、定基因及其表达的定性及定量分析，方可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。4.原位杂交原位杂交可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体

17、定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。出基因和基因产物的亚细胞定位。(二）聚合酶链式反应（二）聚合酶链式反应（PCR）PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性（三）单链构象多态性单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCRSSCP技术。（四）限制酶酶谱分析（四）限制酶酶谱分析基因突变可能导致基因上某一

18、限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（五）（五）DNA序列测定序列测定DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。（六）（六）DNA芯片技术芯片技术应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。三、基因诊断的内容三、基因诊断的内容（一）基因结构异常（基因突变检测）（一）基因结构异常（基因突变检测）、点突变、点突变1）已知的点突变）已知的点突变2）未知的突变）未知的突变2、少数核首酸的缺失或插入、少数核首酸的缺

19、失或插入3、大片段丢失或插入、大片段丢失或插入4、基因重排（染色体易位）、基因重排（染色体易位）5、基因扩增、基因扩增（二）基因表达异常（基因转录物探测）（二）基因表达异常（基因转录物探测）1、mRNA相对定量相对定量2、mRNA绝对定量绝对定量3、mRNA长度分析长度分析（三）连锁分析（三）连锁分析（了解内容）（了解内容）1、限制性片段长度、限制性片段长度2、性家系连锁分析、性家系连锁分析3、连锁不平衡、连锁不平衡（四）病原体的诊断（四）病原体的诊断入侵基因的种类入侵基因的种类四、基因诊断的途径四、基因诊断的途径（一）内源性基因诊断的途径主要有（一）内源性基因诊断的途径主要有3种：种：即：基

20、因突变的检测即：基因突变的检测mRNA的探测的探测连锁分析连锁分析采取哪一条途径主要取决于：采取哪一条途径主要取决于：对致病基因及其分子病理学的了解程度；对致病基因及其分子病理学的了解程度；致病基因本身突变类型的复杂性。致病基因本身突变类型的复杂性。（二）外源基因的入侵的病原体的诊断 1.入侵基因组DNA具有特异的DNA序列，以区别于别种生物体DNA序列。2.能把这种特异的DNA序列制成具有特定信号的探针。五、基因诊断的基本方法五、基因诊断的基本方法（一）点突变（一）点突变1、已知点突变、已知点突变PCR/ASO探针斑点（或缺缝）杂交法探针斑点（或缺缝）杂交法（1）据突变（位点序列：）据突变（

21、位点序列：）a.设计一对引物，设计一对引物，b.合成一合成一对寡核苷酸探针（正常对寡核苷酸探针（正常/突变序列杂合子）突变序列杂合子）（2）提取患者基因组（总）提取患者基因组（总）DNAPCR扩增（突变序列）扩增（突变序列）DNA片段片段（与（与ASO）斑点（或狭缝）杂交）斑点（或狭缝）杂交洗脱条件：完全配对（牢）不洗脱；洗脱条件：完全配对（牢）不洗脱；不完全配对（不牢）易洗脱。不完全配对（不牢）易洗脱。（3）结果分析：）结果分析：与与正正常常探探针针杂杂交交，而而不不和和突突变变探探针针杂杂交交表表示示受受检者不存在这种基因；检者不存在这种基因；只与突变探针杂交，说明突变基因是纯合子；只与突

22、变探针杂交，说明突变基因是纯合子；与与正正常常/突突变变，探探针针都都可可杂杂交交，说说明明突突变变基基因因是杂合子；是杂合子；与与正正常常/突突变变探探针针都都不不杂杂交交说说明明不不是是已已发发现现的的突突变。变。2、未知点突度、未知点突度SSCPPAGE法、测序法法、测序法提取提取DNADNA变性变性SSCPPAGE测序确证测序确证（二）少数较苷酸缺失或插入的诊断方法可以用（一）二）少数较苷酸缺失或插入的诊断方法可以用（一）的方法的方法（五）基因扩增（五）基因扩增限制酶酶切待测基因的限制酶酶切待测基因的DNA或或CDNA片段作为片段作为探针（位置改变）法光密度扫描（定量）。探针（位置改变

23、）法光密度扫描（定量）。基基因因扩扩增增拷拷贝贝数数增增加加（分分子子量量）电电泳泳行行为为改改变变杂杂交交条条带带位置改变位置改变与标准与标准/正常对照定性正常对照定性/量扫描。量扫描。（四四）基基因因重重排排（染染色色体体易易位位）多多次次/重重PCR电电泳泳分分析析、其其前前提提是是已已知知重排基因和重排位点的序列。重排基因和重排位点的序列。（三）大片段丢失（三）大片段丢失多次多重失多次多重失PCR电泳分析电泳分析设计引物使获得产物序列长短不同，有固定大小，据不同长短序列存设计引物使获得产物序列长短不同，有固定大小，据不同长短序列存在与否，检测是否有某些基因片段的缺失与突变（注意正常对照

24、）。在与否，检测是否有某些基因片段的缺失与突变（注意正常对照）。53引物引物1引物引物3致病基因致病基因引物引物4引物引物253引物引物1引物引物3（六）多态性分析（六）多态性分析1、RFLP（）基基本本方方法法：PCR产产物物酶酶切切产产物物电电泳泳分分析析。基基因因连连锁锁分分析（析（PCR/RFLP连锁分析法）连锁分析法）。人人群群个个体体核核苷苷酸酸序序列列的的差差异异性性、称称为为DNA的的多多态态性性。由由此此影影响响限限制制酶酶切切部部位位点点而而致致RFLP（限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性）。RFLP按按照照孟德尔方式遗传。故：孟德尔方式遗传。故：可检测人群中个体间存

25、在的可检测人群中个体间存在的RFLP（限制酶酶谱分析）（限制酶酶谱分析）遗遗传传病病的的基基因因诊诊断断（连连锁锁分分析析）。如如果果一一特特定定家家庭庭（系系）中中，某某一一致致病病基基因因与与特特异异性性的的多多态态性性片片段段紧紧密密连连锁锁（连连锁锁是是指指同同一一条条染染色色体体上上相相邻邻近近的的基基因因一一起起被被被被遗遗传传），就就可可以以用用这这种种多多态态性性片片段段作作为为“遗遗传传标标志志”，来来判判断断家家庭庭成成员员或或胎胎儿儿基基因因组组中中是是否否携携带带有有致致病病基基因因。对对于于某某一一限限制制酶酶来来说说：酶酶切切位位点点在在人人群群中中存存在在共共性性

26、（可可能能一一样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。（）（）DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组，多态性位点普遍存在整个人类基因组，估计每估计每100个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。如果建立起一套以个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。如果建立起一套以20CM间隔平均分布于整个基因的间隔平均分布于整个基因的RFLP位点，位点，选用合适的探针，理论上可选用合适的探针，理论上可以对所有的遗传病进行基因诊断以对所有的遗传病进行基因诊断。（3）关于基因连锁分析）关于基因连锁分析多数遗传病诊断途径，多数遗传病诊断途径，因为：经基因突变检测途径，适用病种有限，原因

27、是：因为：经基因突变检测途径，适用病种有限，原因是：a、致病的基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不同的突变类型。、致病的基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不同的突变类型。b、不不少少致致病病基基因因仅仅仅仅知知道道在在哪哪一一号号染染色色体体位位置置，尚尚未未克克隆隆出出来来，对对其其结结构构和和分子机制毫无能知。分子机制毫无能知。c、有的致病基因尚未确定。、有的致病基因尚未确定。基因连锁分析必须具备的先决条件：基因连锁分析必须具备的先决条件：a、家家系系中中的的关关键键成成员员（父父母母）为为RFLP的的杂杂合合子子，才才能能区区分分两两条条同同源源染染色色体体。连锁遗传病只

28、要母亲为某一连锁遗传病只要母亲为某一RFLP的杂合子即可。的杂合子即可。b、子子代代存存在在患患病病的的纯纯合合子子，这这样样才才能能确确定定致致病病基基因因与与哪哪条条染染色色体体RFLP共共同同遗传。遗传。c、任任何何一一种种遗遗传传病病、单单独独使使用用一一种种RFLP、均均有有相相当当一一部部分分父父母母染染色色体体无无法法区分、所以要联用若干种区分、所以要联用若干种RFLP及相当探针，提交诊断。及相当探针，提交诊断。d、待检亲代必须为生物学意义亲代。、待检亲代必须为生物学意义亲代。连锁不平衡并不多见：连锁不平衡并不多见：指指某某一一个个多多态态性性位位点点在在基基因因和和等等位位突突

29、变变基基因因中中的的分分布布频频率率有有显显着着差异。因此可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊断。如：差异。因此可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊断。如：正正常常人人酶酶切切图图谱谱有有9/9、22/9、22/22kb型型，-地地贫贫纯纯合合子子只只有有9/9kb型型（kan发发现现撕撕工工岛岛人人-珠珠蛋蛋白白基基因因3BamHI的的多多态态性性位位点点）故故不不经经家家系系分析，仅以这一多态性即可用产前诊断。分析，仅以这一多态性即可用产前诊断。RFLP连锁分析可能常是可靠的连锁分析可能常是可靠的。连锁分析存在一定的错误原因是：。连锁分析存在一定的错误原因是：a、人人为为差差错

30、错。b、RFSP连连锁锁分分析析方方法法本本身身的的差差错错程程度度（方方法法本本身身局局限性。）限性。）因因为为在在减减数数分分裂裂中中间间传传染染色色体体的的某某些些区区域域可可以以发发生生重重组组和和交交换换，从从而而使使得得原原先先共共同同遗遗传传的的DNA突突变变与与RFLP发发生生分分离离，这这样样情情况况下下作作出出连连锁锁分分析析结结果果就就会会发发生生错错误误。诊诊断断的的错错误误率率可可以以从从DNA标标志志与与疾疾病病的的共共同同遗遗传传度度来来估估计计，重重组组率率高高于于5%的的连连锁锁探探针针不不宜宜采采用用，事事实实表表明明，除除个个别别情情况况外外，由由于于染染

31、色色体体重重组组所所致致的的错错误误诊诊断断小小于于1%，因因此此，RFLP连锁分析通常是可靠的。连锁分析通常是可靠的。2、微小重复序列（如、微小重复序列（如CA序列）多态性分析。序列）多态性分析。（）基本方法：（）基本方法：PCR/PAGE家系分析法（教材家系分析法（教材P146）。）。重重复复单单位位和和重重复复次次数数不不同同具具有有高高度度的的遗遗传传多多态态性性，对对他他们们和和等等位位基基因因进进行行家家系系分分析析，说说明明他他们们遵遵照照孟孟德德尔尔遗遗传传规规律律、是是一一套套新新的的遗传标记系统遗传标记系统（）应用举例：（）应用举例：产前基因诊断杜氏肌营养不良（突变类型未明

32、）。产前基因诊断杜氏肌营养不良（突变类型未明）。（七）基因表达异常的诊断。七）基因表达异常的诊断。1、mRNA相对定量相对定量（1）点杂交（或狭缝杂交）光密度扫描法；）点杂交（或狭缝杂交）光密度扫描法；（2）RTPCR；2、mRNA绝对定量绝对定量RTPCR/竞争性竞争性PCR3、mRNA长长度度分分析析 Northern杂杂交交法法，RTPCR产物电泳分析产物电泳分析（八）病原体的诊断（八）病原体的诊断PCR法法第三节第三节基因诊断的应用基因诊断的应用一、一、遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断（一）血红蛋白病（一）血红蛋白病血血红红蛋蛋白白病病是是由由于于血血红红蛋蛋白白合合成成异异常常所所致

33、致的的遗遗传传性性血血液液病病。习习惯惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血类。上分为异常血红蛋白病和地中海贫血类。1.异常血红蛋白病是异常血红蛋白病是珠珠蛋蛋白白肽肽链链结结构构的的改改变变变变导导致致主主要要功功能能部部位位氨氨基基酸酸的的置置换换，影影响响Hb的的溶溶解解度度、稳稳定定性性及及生生物物学学功功能能。分分子子基基础础：单单碱碱基基替替代代，缺缺失失、插入插入.地中海贫血（地中海贫血（地中海贫血和地中海贫血和地中海贫血）地中海贫血）是是珠珠蛋蛋白白合合成成速速率率降降低低，导导致致链链和和非非链链合合成成的的不不平平衡衡多多余余的的珠珠蛋蛋白白链沉积在链沉积在Rbc膜上膜上改变了

34、膜的通透性和硬度改变了膜的通透性和硬度导致溶血性贫血。导致溶血性贫血。4.诊断要求诊断要求HbPunjab地中海贫血（地中海贫血（珠蛋白珠蛋白合成合成）地中海贫血（地中海贫血（珠蛋白合成珠蛋白合成）占我国新疆异常占我国新疆异常Hb病病55.6%（1）产前诊断为主要目）产前诊断为主要目的。的。每一民族或群体有每一民族或群体有特突变类型谱中国特突变类型谱中国人主要突变类型有人主要突变类型有6种（种（P30）分子基础分子基础Hb链链121密码单个碱基替代：密码单个碱基替代：GAA（Glu)CAA（Gln）改变了改变了EccRI一个识别位点一个识别位点大多数是大多数是珠蛋白基因缺珠蛋白基因缺失所致。失

35、所致。点突变、缺失或插点突变、缺失或插入往往不涉及限制入往往不涉及限制酶识别位点。酶识别位点。DNA诊断：诊断：PCR扩增（扩增（珠蛋白第珠蛋白第3个外个外显子和基因显子和基因3端端DNA序列、全序列、全长长144bp）EcoRI酶切电泳分酶切电泳分析。析。（3）液体分子杂交）液体分子杂交C1限限制酶谱分析，或制酶谱分析，或PCR扩扩增电泳分析增电泳分析PCR/ASO探针法探针法（主要方法）（主要方法）结果结果正常对照正常对照40/104bp两个片段两个片段HbPuNJob144bp,40/104bp两种类型杂合子（同理扩增两种类型杂合子（同理扩增珠蛋白珠蛋白DNA片段片段MnlI酶谱分析酶谱

36、分析诊断诊断HbE（26GluLys)正常对照有正常杂交信正常对照有正常杂交信号（号（C1）酶切片段不缺）酶切片段不缺（C2）PCR产物有产物有（C3）地贫与正常结果地贫与正常结果反之。反之。PCR/RFLP连锁分连锁分析法析法RNA诊断：诊断：异常异常Hb病人病人mRNA的的RT/PCR产物测序知编码区碱基变化产物测序知编码区碱基变化推导相应氨基酸变化。推导相应氨基酸变化。RT-PCR介导的介导的珠蛋白珠蛋白mRNA定量定量。PCR介导的介导的mRNA定量法。定量法。mRNA的剪切缺的剪切缺陷检测（自学）陷检测（自学）（二）（二）杜氏肌营养不良症（杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克营养不良症（

37、）和贝克营养不良症（BMD）1.DMD和和BMD是常见的性连锁隐性遗传病，是常见的性连锁隐性遗传病，2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.2121.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。DMD多在多在5岁发病，在岁发病，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的其发病率为活产男婴的1/3500。BMD症状较症状较DMD为轻，寿命较长，并有生育能力，发病率为轻，寿命较长，并有生育能力，发病率为为1/30000。3.分子基础：分子基础：抗肌萎缩蛋白基因内（抗肌萎缩蛋白基因

38、内（1）DNA片段缺失（片段缺失（60%的病例的病例导致导致阅读框移码阅读框移码移码实变移码实变致致DMD，整码缺失，整码缺失BMD）。）。（2）部分重复（病例的）部分重复（病例的5%）（3）缺缺失失或或重重复复的的2个个热热点点区区该该基基因因5端端处处4555外外显显子子范范围围内。内。4.DMD、DNA诊断诊断因因DMD（及及BMD）大大多多数数为为基基因因缺缺失失所所致致，该该病病DNA诊诊断断主主要要是是抗抗肌萎蛋白基因缺失的检测。诊断技术：肌萎蛋白基因缺失的检测。诊断技术：（1）基因组）基因组探针法探针法用用XP21区分区分离得到的不离得到的不同探针如同探针如（P20）来接）来接进

39、行相应内进行相应内切酶酶谱分切酶酶谱分析、检出率析、检出率取决于探针取决于探针数和酶切位数和酶切位点数目。点数目。（2）cDNA探探针针法法抗抗肌肌萎萎缩缩蛋蛋白白基基因因系系列列cDNA探探针针分分析析患患者者基基因因缺缺失失、外外显显子子拼拼接接改改变变和和基基因因内内部分重复。部分重复。（3）多多重重PCR法法如如有有人人设设计计多多对对引引 物物 进进 行行 多多 重重PCR扩扩增增该该基基因因的的9个个易易发发缺缺失失“热热 点点 区区”DNA片片 段段，可可 检检 出出80%有有基基因因缺缺失失的的DMD患者。患者。（4）多多态态性性分分析法析法基基因因内内及及其其旁旁侧侧探探针针

40、进进行行RFLP连连锁锁分分析析或或CA多多态态性性分分析析适适用用于于 非非 缺缺 失失 型型DMD。5.DMD、RNA诊断：诊断：诊断技术诊断技术RTPCR扩扩增增该该基基因因外外显显子子（全全长长2.4MB、外外显显子子起起来来全全长长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。（三）苯酮尿症（三）苯酮尿症（PKU）1、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。2、主主要要特特征征：（1）苯苯丙丙氨氨酸酸酪酪氨氨酸酸多多巴巴儿茶酚

41、胺儿茶酚胺苯苯丙丙酮酮酸酸酪酪胺胺黑色素黑色素（2）患患儿儿出出生生后后须须及及早早得得到到低低phe饮饮食食治治疗疗，否否则则发生不可发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍逆大脑损害和严重智力发育障碍。3、分分子子基基础础：（1）迄迄今今约约3/4的的导导致致中中国国人人经经典典型型重重PKU的的突突基基因因已已被被查查清清，它它们们分分属属11种种基基因因PAH基基因因点点突突变变。体外研究表明，这些突变导致体外研究表明，这些突变导致PAH活力活力或丧失。或丧失。（2）PAH第第11外外显显子子的的第第399密密码码GTA（val）GTT（val）中中性性突突变变：不不改改变变任任何何限限制

42、制酶酶识识别别位位点点，故故又又称称“序序列列多多态态性性”。这这一一“序序列列多多态态性性”在在PKU患患者者和和正正常常人人中中存存在在着着连连锁锁不不平平衡衡性性，故故可可作作为为一一种种“遗遗传传标标记记”应用于产前诊断。应用于产前诊断。苯丙氨酸苯丙氨酸羟化酶羟化酶（肝、（肝、PAH）4、DNA诊诊断断：PCR/ASO探探针针法法。若若待待诊诊断断的的PKU家家系系的的基基因因突突变变类类型型尚尚属属“未未知知”或或无无RFLP信信息息。PCR/SSCP直直接接则则序序法法不不定定期期出出导导PKU的的点点突突变。变。5、序列多态性连锁分析、序列多态性连锁分析前提是该家系存在述第前提是

43、该家系存在述第399密码子序列多态性密码子序列多态性用用于于产产前前诊诊断断：（不不知知基基因因实实变变类类型型，也也无无RFLP信息。）信息。）病病案案某某孕孕妇妇曾曾生生育育一一例例PKU患患者者，现现妊妊娠娠第第二二胎胎8周周，要要求求对对胎胎儿儿进进行行产产前前诊断。诊断。诊诊断断：（1）PAH基基因因的的RFLP分分析析：该该家家庭庭除除ECORI外外，其其它它酶酶切切点点都都不不具具有有杂杂合合性性，而而丈丈夫夫、患患儿儿、孕孕妇妇、胎胎儿儿双双均均为为ECORI11/17kb片片段段的的杂杂合合子子，因因此此胎胎儿儿可可能能正正常常，可可能能为为PKU患患者者。据据RFLP分分析

44、析无无法法对对胎胎儿儿作作出出产产前前诊诊断断（为什么？缺乏基因连锁分析先决条件。（为什么？缺乏基因连锁分析先决条件。（2）序序列列多多态态性性：PCR/ASO探探针针DNA片片段段点点杂杂交交法法。PCR扩扩增增父父亲亲、孕孕妇妇/患患儿儿、胎胎儿儿PAH基基因因片片段段。合合成成ASO（相相应应于于第第399密密码码子子中中性实变序列的一对等位基因的特异性实变序列的一对等位基因的特异ASO探针。探针。杂交：杂交：说说明明：患患儿儿扩扩增增DNA片片段段与与正正常常/中中性性突突变变ASO探探针针杂杂交交;父父亲亲;胎胎儿儿扩扩增增a、患患儿儿的的1个个PKU，基基因因与与密密码码子子399

45、AT中中性性突突变变相相偶偶（连连锁锁），这这个个PKU基基因因来来自自母母方方。a.孕孕妇妇。b、胎胎儿儿没没有有这这一一中中性性实实变变，可可以以排排除除胎胎儿儿为为PKLL患患者者，结结合合ECLRI位位点点RFLP资资料料，可可产产和和的的诊诊断断胎胎儿儿完完全全正正常常。c、胎胎儿儿出出生生后后基基因因分分析析和和随随方方证证实实诊诊断断正正确确。DNA片片段段中中能能与与正正常常的的ASO探针杂交探针杂交。四、血友病四、血友病是是一一种种遗遗传传性性凝凝血血功功能能障障碍碍的的出出血血性性疾疾病病，由由于于正正常常凝凝血血过过程程中中血血浆浆凝凝血血的的活活力力有有缺缺陷陷所所致致

46、。患患者者常常因因出出血血不不止止或或继继发发病病而而夭夭折折，治治疗疗主主要要靠靠替替代代疗疗法法，输输入入缺缺乏乏的的血血浆浆因因子子。重重型型血血友友病病甲甲和和乙乙的的男男性性发发病病率率为为1/50001/50000。为甲型血友病和乙型血友病。为甲型血友病和乙型血友病。主要特征：主要特征：是一组是一组X连锁遗传凝血缺陷连锁遗传凝血缺陷疾病。疾病。缺乏缺乏Xq远端的远端的F（凝血（凝血因子因子）所致。）所致。基因突变具极为异质性，基因突变具极为异质性，与与地贫不同。（因子占地贫不同。（因子占X染色体全长染色体全长0,1%，共，共186kb包括包括26个外显子）不个外显子）不存在存族和群

47、体特异性，存在存族和群体特异性，几乎每一种不同的甲型血几乎每一种不同的甲型血友病家系都具有自已独特友病家系都具有自已独特的突变类型。（所以该病的突变类型。（所以该病基因诊断不宜用基因诊断不宜用PCR/ASO探针直接检测点突变，而探针直接检测点突变，而主要依赖主要依赖RFLP连锁分析连锁分析）也是也是X连锁遗传的凝血连锁遗传的凝血缺陷疾病。缺陷疾病。约约1%左右乙型血友病左右乙型血友病人人FIX基因缺失（因而基因缺失（因而在用替代疗法过程中会在用替代疗法过程中会产生产生FIX的抑制物）。的抑制物）。在非缺失（在非缺失（FIX基因）型基因）型中，已发现中，已发现398种不同种不同的基因突变。的基因

48、突变。（FIX基因定位在基因定位在Xq26q27，全长，全长34kb包括包括8个外显子）。个外显子）。已已克克隆隆化化FIXcDNA和和DNA片片段段，鉴鉴定定了了FIX基基因因的的5个个限限制制者者多多态态性性位位点点，故故可可用用RFLP连连锁锁分分析进行产前诊断和携带者检测。析进行产前诊断和携带者检测。病病倒倒：乙乙型型血血友友家家系系分分析析FIX基基因因 发发 现现 某某 患患 者者 缺缺 失失 该该 基基 因因5kbDNA序序列列（第第23外外显显子子+第第2内内含含子子全全部部+部部分分第第1，第第3内含子）内含子）a、对对该该家家系系一一例例乙乙型型血血友友病病变变高高危危妊妊

49、娠娠产产前前基基因因诊诊断断，诊诊断断胎胎儿为男性乙型血友病患者。儿为男性乙型血友病患者。b、对对该该孕孕妇妇第第二二胎胎产产前前诊诊断断为为女女性乙型血友病基因携带者。性乙型血友病基因携带者。（上上海海医医遗遗传传所所淅淅江江乙乙型型血血友友病病家家系）系）4、诊断情况（报道）、诊断情况（报道）：应应用用克克隆隆化化FcDNA与与 VIII基基 因因 连连 锁锁DNA片片段段和和DX18、St14等等分分析析了了基基因因或或旁旁侧侧的的限限制制酶酶酶酶切切位位点点多多态态性性，并并采采用用PCR/BCLI或或XbaIRFLP连连锁锁分分析析法法进进行行了了甲甲型型血血友友病病的的产产前前诊诊

50、断断和和携携带带者者检测。检测。用用PCR/SSCP法法检检查查了了FVIII内内含含子子18处处BCLI的多态性。的多态性。（终终止止妊妊娠娠对对胎胎儿儿作作凝凝血血子子测测定定和和DNA分分析析、证证实实产产前前诊诊断断正确。）正确。）类类别别基因特征基因特征诊断方法诊断方法1、病毒性肝炎、病毒性肝炎甲型肝炎（甲型肝炎（HAV）甲肝病毒基因是线状分甲肝病毒基因是线状分子、约含于子、约含于7500个核苷酸。个核苷酸。已获已获HAV几个毒株几个毒株cDNA克隆。克隆。CDNA探针杂交探针杂交（RNA）法。）法。SSRNA探针杂交探针杂交（RNA）法有报道。）法有报道。乙型肝炎（乙型肝炎（HBV