《基因工程概论》课件.ppt

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1、基因工程基因工程 Genetic EngineeringGenetic Engineering 主讲教师：李黄金主讲教师：李黄金Email:Email:任课教师：张文峰、陈伟任课教师：张文峰、陈伟生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院1313 自我介绍自我介绍n98年获理学博士学位，中山大学年获理学博士学位，中山大学n92-2006年在企业工作年在企业工作n“重组人表皮生长因子重组人表皮生长因子(rhEGF)(rhEGF)衍生物衍生物”*国家一类新药国家一类新药(1998)(1998)*国家高技术产业化示范工程国家高技术产业化示范工程(2002)(2002)*中国药典中国药典200520

2、05版三部收录品种版三部收录品种第一章第一章 基因工程概述基因工程概述 基因工程与基因工程与生物技术世纪生物技术世纪基因工程的基本概念、原理与过程基因工程的基本概念、原理与过程基因工程的历史基因工程的历史基因工程的未来基因工程的未来课程结构课程结构 一、基因工程与生物技术世纪一、基因工程与生物技术世纪人类文明发展的三次技术革命人类文明发展的三次技术革命1.1.工业革命工业革命 19 19世纪，解放双手世纪，解放双手2.2.信息革命信息革命 20 20世纪，解放大脑世纪，解放大脑3.3.生物技术革命生物技术革命 21 21世纪，改造生命，创造世纪，改造生命，创造生命生命生物技术世纪生物技术世纪“

3、我们正处在世界历史的一场伟大变革中，一场从物理学和化学时代转变到生物学时代、从工业革命转变到生物技术世纪的伟大革命”杰里金杰里金.里夫金里夫金 美国华盛顿特区，经济趋势基金会总裁美国华盛顿特区，经济趋势基金会总裁生物技术生物技术？生物技术（生物技术（生物技术（生物技术（BiotechnologyBiotechnology）根据现代生命科学理论与各种工程技术所根据现代生命科学理论与各种工程技术所根据现代生命科学理论与各种工程技术所根据现代生命科学理论与各种工程技术所建立的、用以改造各种生物有机体来满足建立的、用以改造各种生物有机体来满足建立的、用以改造各种生物有机体来满足建立的、用以改造各种生物

4、有机体来满足人类各种需要的技术体系。人类各种需要的技术体系。人类各种需要的技术体系。人类各种需要的技术体系。以细胞与基因以细胞与基因以细胞与基因以细胞与基因操作为核心。操作为核心。操作为核心。操作为核心。现代生物技术产业化关键领域现代生物技术产业化关键领域u医药生物技术医药生物技术u农业生物技术农业生物技术u工业生物技术工业生物技术u能源生物技术能源生物技术u环境生物技术环境生物技术u信息生物技术信息生物技术u国防生物技术国防生物技术基因工程基因工程基因工程基因工程生物技术体系的核心生物技术体系的核心生物技术体系的核心生物技术体系的核心转基因动、植物转基因动、植物转基因动、植物转基因动、植物重

5、组微生物重组微生物重组微生物重组微生物天然细胞天然细胞蛋白质、酶蛋白质、酶蛋白质、酶蛋白质、酶高分子化合物高分子化合物高分子化合物高分子化合物小分子化合物小分子化合物小分子化合物小分子化合物工程细胞工程细胞功能功能功能功能基因基因基因基因基基基基因因因因工工工工程程程程药物、诊断试剂药物、诊断试剂药物、诊断试剂药物、诊断试剂基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗/疫苗疫苗疫苗疫苗干细胞治疗干细胞治疗干细胞治疗干细胞治疗人类自身人类自身功能功能功能功能基因基因基因基因动、植物、动、植物、微生物微生物工业领域工业领域工业领域工业领域医药领域医药领域医药领域医药领域农业领域农业领域农业领域农业领域能源领域

6、能源领域能源领域能源领域环境领域环境领域环境领域环境领域军事领域军事领域军事领域军事领域基因工程是现代生物技术体系的核心基因工程是现代生物技术体系的核心 细胞工程 发酵工程 分离工程 蛋白质工程 抗体工程 酶工程 途径工程 。基基基基因因因因工工工工程程程程n基因工程（基因工程（Genetic EngineeringGenetic Engineering）是指按预先设计的蓝图，将不同来源的目的基因在体外与载体DNA进行拼接重组，然后导入受体细胞，并使之持续稳定繁殖，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能的技术。二、基因工程的概念、原理与过程二、基因工程的概念

7、、原理与过程1 1、概念、概念广义的基因工程广义的基因工程n基因工程基因工程 是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。n上游技术上游技术 指的是目的基因克隆、表达载体和工程菌（或细胞）的构建与分析。n下游技术下游技术 基因工程菌或细胞的大规模培养以及表达产物的分离纯化过程。基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用基因工程的应用分离、扩增、鉴定、研究、整理分离、扩增、鉴定、研究、整理分离、扩增、鉴定、研究、整理分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源生物信息资源生物信息资源生物信息资源大规模生产大规模生产大规模生产大规模生产生物活性物质生物活性物质生物活性物质

8、生物活性物质设计、构建设计、构建设计、构建设计、构建生物的新性状甚至新物种生物的新性状甚至新物种生物的新性状甚至新物种生物的新性状甚至新物种基因工程概念的发展基因工程概念的发展n遗传工程（遗传工程（Genetic Engineering)Genetic Engineering)nDNADNA重组技术（重组技术（DNA RecombinationDNA Recombination）n分子分子/基因克隆（基因克隆（Molecular/Gene CloningMolecular/Gene Cloning）n基因工程（基因工程（Gene/Genetic Engineering)Gene/Genetic

9、 Engineering)n基因操作（基因操作（Gene Manipulation)Gene Manipulation)应用领域以应用领域以“基因工程基因工程”、“DNADNA重组重组”为为主主有关术语有关术语n n克隆（克隆（clone)clone)：无性繁殖系无性繁殖系n n克隆化（克隆化（cloningcloning）：）：构建无性繁殖系的操作过程。构建无性繁殖系的操作过程。n n重组子（重组子（recombnants)recombnants)：不同来源不同来源DNADNA插入载体分子所插入载体分子所形成的杂合分子。形成的杂合分子。n n重组（重组（recombinationrecomb

10、ination）：）：构建构建DNADNA重组子的过程重组子的过程n n构建（构建（construct):construct):通过基因操作获得重组通过基因操作获得重组DNADNA、重组细、重组细胞或动植物个体的过程。胞或动植物个体的过程。n工程菌（细胞）：工程菌（细胞）：通过基因操作所获得的、用于生产特定产物的微生物通过基因操作所获得的、用于生产特定产物的微生物菌种（工程菌）或动植物细胞（工程细胞）。菌种（工程菌）或动植物细胞（工程细胞）。n转基因动物（植物）转基因动物（植物）通过基因操作所获得的、带有特定新功能基因的动物通过基因操作所获得的、带有特定新功能基因的动物或植物。或植物。n分子育

11、种分子育种 基于基因操作技术改良动植物生产性能、并获得新品基于基因操作技术改良动植物生产性能、并获得新品种的过程。种的过程。基因工程产业化中的几个概念基因工程产业化中的几个概念基因工程产业化中的几个概念基因工程产业化中的几个概念基因工程的三大要素基因工程的三大要素n基因：供体，目的基因（Vs用途,interesting/target gene）、外源基因（Vs宿主,foreign gene）n载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗 传的DNA分子。n宿主：受体，能摄取外源DNA、并能使其稳定维 持的细胞（组织、器官或个体）。基因工程最突出的二个优点基因工程最突出的二个优点 打破了常规育种难

12、以突破的物种之间界限打破了常规育种难以突破的物种之间界限 可使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚可使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。可在受体细胞内大量复制并保存目的基因可在受体细胞内大量复制并保存目的基因 为大量制备纯化的目的基因、研究基因的结构与功能为大量制备纯化的目的基因、研究基因的结构与功能提供了基础。提供了基础。2 2、基因工程的基本原理、基因工程的基本原理基因的物质基础一致基因的物质基础一致 所有物种可通过所有物种可通过DNADNA重组来进行遗传改造。重组来进行遗传改造。所有物种

13、所有物种DNADNA的复制机制相同的复制机制相同 宿主来源的复制调控元件可使目的基因在异源宿主来源的复制调控元件可使目的基因在异源宿主中高效扩增与稳定传代。宿主中高效扩增与稳定传代。所有物种遵循相同的基因表达原理所有物种遵循相同的基因表达原理 宿主来源的转录水平（启动子、终止子、增强宿主来源的转录水平（启动子、终止子、增强子）和翻译水平（核糖体结合位点、偏爱密码子）子）和翻译水平（核糖体结合位点、偏爱密码子）的调控元件可实现目的基因的异源高效表达。的调控元件可实现目的基因的异源高效表达。3 3、基因工程的基本过程、基因工程的基本过程目的基因克隆目的基因克隆切、接、转、增、检切、接、转、增、检获

14、得目的获得目的基因基因PCRPCR、RT-PCRRT-PCR、化学合成、基因文库、化学合成、基因文库工程细胞或个体构建工程细胞或个体构建将含目的基因表达元件的载体导入特定宿主细胞或个体，将含目的基因表达元件的载体导入特定宿主细胞或个体，并筛选可稳定遗传与表达目的基因的重组子并筛选可稳定遗传与表达目的基因的重组子基基因因克克隆隆的的基基本本过过程程切切切切、接接接接、转转转转、增增增增、检检检检mRNAmRNAmRNAmRNA合成合成合成合成大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌是是是是中中中中心心心心角角角角色色色色体体体体外外外外重重重重组组组组（切切切切、接接接接）切切：用：用DNADNA限制性

15、内切酶切割目的基因与载体限制性内切酶切割目的基因与载体DNA DNA 接接：用：用DNADNA连接酶连接目的基因与载体连接酶连接目的基因与载体DNADNA，获得含，获得含 目的基因、复制元件与筛选标记的重组目的基因、复制元件与筛选标记的重组DNADNA分子。分子。转转：将重组：将重组DNADNA分子导入宿主细胞（大肠杆菌）。分子导入宿主细胞（大肠杆菌）。增增：少量进入宿主细胞的重组：少量进入宿主细胞的重组DNADNA分子利用复制元件自分子利用复制元件自 主复制、并大量扩增。主复制、并大量扩增。检检：利用筛选标记基因和：利用筛选标记基因和/或目的基因的表达产物进行重或目的基因的表达产物进行重 组

16、子的筛选与鉴定。组子的筛选与鉴定。基因工程的基本过程基因工程的基本过程基基因因工工程程（广广义义）基基本本过过程程转化克隆宿主，转化克隆宿主，制备表达载体。制备表达载体。转化表达宿主转化表达宿主基因工程发酵（培养）基因工程发酵（培养）中试规模分离纯化AKTA explorer 1001946 1950 1955 1960 19651970 1975 1980 1985 1990 1995 1944DNA是遗传物质1949Hbs贫血1953双螺旋1956HbsGlu-Val1966遗传密码第一个R酶1972重组质粒1975DNA杂交1977DNA测序1981转G小鼠1983HD病G定位1985P

17、CR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一个基因治疗1995细菌G组序列1996酵母基因组序列三、基因工程的历史三、基因工程的历史 （一）基因工程诞生的理论基础（一）基因工程诞生的理论基础 20世纪中期分子遗传学理论的重大进展 1确定了生物遗传的物质基础是DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验 噬菌体DNA转化实验 19441944年，美国年，美国微生物学家微生物学家AveryAvery证明基因证明基因就是就是DNADNA分子，分子，提出提出 DNADNA是遗传是遗传信息的载体。信息的载体。2、Watson、Crick阐明阐明DNA双螺旋结构（双螺旋结构（1953）

18、3生物遗传的“中心法则”解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。自我复制，遗传信息由父代传给子代；通过转录，遗传信息传给RNA；通过翻译，信息传给蛋白质和酶；基因型决定生物的表型。DNA RNA protein 4“操纵子”学说揭示了基因表达和调控的机制。5 5、破译了全部的遗传密码、破译了全部的遗传密码基因工程的理论依据基因工程的理论依据 相同的遗传物质基础（相同的遗传物质基础（相同的遗传物质基础（相同的遗传物质基础（DNADNADNADNA）相同的遗传机制（相同的遗传机制（相同的遗传机制（相同的遗传机制（DNADNADNADNA的复制）的复制）的复制）的复

19、制）相同的基因表达法则（中心法则）相同的基因表达法则（中心法则）相同的基因表达法则（中心法则）相同的基因表达法则（中心法则）通用的遗传密码（通用的遗传密码（通用的遗传密码（通用的遗传密码（64646464个密码子）个密码子）个密码子）个密码子）多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系基因可重组或转移（天然重组、转座）基因可重组或转移（天然重组、转座）基因可重组或转移（天然重组、转座）基因可重组或转移（天然重组、转座）1核酸内切酶和DNADNA连接酶连接酶的发现 为DNA的体外重组准备了基本的“工具”nSmith发现了第一个限制性核

20、酸内切酶(restrictien endonuclease，RE)HindII。分子手术刀:特异性切割nBoyer发现了第一个用于基因工程的内切酶EcoRInKhorana发现了T4 DNA连接酶（Ligase），粘合剂:能将DNA片段连接在一起（二）基因工程诞生的技术基础（二）基因工程诞生的技术基础（二）基因工程诞生的技术基础（二）基因工程诞生的技术基础B B B Bo o o oy y y ye e e er r r r发发发发现现现现的的的的E E E Ec c c co o o oR R R RI I I I 2DNA载体系统的发现 目的基因、DNA片段不能复制，也易破坏。必须连到具有

21、复制能力的载体（vector)DNA分子上。研究表明质粒、噬菌体和病毒是理想的载体分子。大肠杆菌的质粒首先用于载体。3、大肠杆菌DNA转化体系建立 1970年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源DNA；1972年Cohen C报道，质粒DNA也能被大肠杆菌吸收。而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的DNA片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。4、DNA分离、纯化技术的建立分离、纯化技术的建立 凝胶电泳：凝胶电泳：Agarose gel,PAGEAgarose gel,PAGE 可以分离纯化可以分离纯化DNADNA片段，并检测连接情况片段，并检测连接情况 （三）基因

22、工程的诞生（三）基因工程的诞生1980年年Nobel化学奖化学奖19721972年斯坦福大学的年斯坦福大学的Paul BergPaul Berg小组完成了首小组完成了首次体外重组实验：次体外重组实验：Berg的开创性实验的开创性实验将将SV40SV40的的DNADNA片段与片段与 噬菌体的噬菌体的DNADNA片段连片段连接起来接起来。DNADNA重组重组(体外）体外）：不同的不同的DNADNA分子间发生分子间发生共价连接形成重组共价连接形成重组DNA DNA 分子。分子。重组重组DNADNASVSV4040D DNANADNADNA片段片段（用（用DNADNA末端转移酶，而非限制末端转移酶，而

23、非限制性内切酶）性内切酶）T T4 4DNADNA连接酶连接酶Boyer 和和Cohen进行了第一个基因工程实验进行了第一个基因工程实验 2 2、1973 1973 年年Cohen Cohen 成功地进行了体外重组和转化实验成功地进行了体外重组和转化实验 分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组的连接，再将这种重组的DNADNA分子转化大肠杆菌，某些转化菌落分子转化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。他的工作是世界上第一次成功的基因重组实验，并有基

24、因他的工作是世界上第一次成功的基因重组实验，并有基因表达及新的表型。表达及新的表型。1973-Boyer,Cohen&Chang:真正意义上的基因工程实验真正意义上的基因工程实验Transform E.coli with recombinant plasmidStanley Cohen&Stanley Cohen&Annie ChanAnnie ChanHerbert BoyerHerbert BoyerKanamycin resistance geneKanamycin resistance genePlasmid Plasmid pSC101pSC101Tetracycline Tetra

25、cycline resistance generesistance geneE.coliE.coli transformed transformed with with recombinant recombinant plasmidplasmidTransformed cells plated Transformed cells plated onto medium with onto medium with kanamycin and tetracyclinekanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant Only cells wi

26、th recombinant plasmid survive to produce coloniesplasmid survive to produce coloniespSC101pRpR6-56-5抗四环素抗四环素抗卡那霉素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素抗卡那霉素基因基因DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶重组重组重组重组DNADNADNADNA分子分子分子分子培养平皿四环素平板四环素平板卡那霉素基因卡那霉素基因四环素四环素 卡那霉素基因卡那霉素基因大肠杆菌大肠杆菌 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一

27、次成功的基因克隆实验。Boyer-CohenBoyer-CohenBoyer-CohenBoyer-Cohen实实实实验验验验1982198219821982年年年年2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。基因工程的历史性事件基因工程的历史性事件n1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术

28、n1976：世界上第一个基因公司“Genetech”在美国成立n1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素n1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市n1988：PCR技术诞生n1989：我国第一个基因工程药物rhIFN1b上市n2003:世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市四、基因工程的未来四、基因工程的未来 只只 有有 想想 不不 到到 的的 没没 有有 办办 不不 到到 的的基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗基因工程药物基因工程药物疫苗（抗原）的基因工程疫苗（抗原）的基因工程第二代疫苗：第二代疫苗：基因工程疫苗基因工程疫苗第一代疫苗：第一代疫苗：灭活疫苗（牛痘

29、疫苗）灭活疫苗（牛痘疫苗）利用酵母菌生产的重组乙肝利用酵母菌生产的重组乙肝疫苗疫苗FDAFDA正式批准全球首支宫颈癌疫苗正式批准全球首支宫颈癌疫苗生物反应器：转基因动物生物反应器：转基因动物安全廉价环保的生物工厂安全廉价环保的生物工厂生产人血浆凝血酶原的转基因羊生产人血浆凝血酶原的转基因羊第一例转基因动物转基因鼠第一例转基因动物转基因鼠建建建建立立立立动动动动物物物物疾疾疾疾病病病病模模模模型型型型改变传统农业概念改变传统农业概念让植物生产药物让植物生产药物华南农大：胰岛素土豆华南农大：胰岛素土豆最贵的土豆最贵的土豆加拿大：胰岛素香蕉加拿大：胰岛素香蕉改变传统农业概念：改变传统农业概念：人和植

30、物人和植物“杂交杂交”让植物生产人体蛋白质让植物生产人体蛋白质抗体烟草抗体烟草血清白蛋白马铃薯血清白蛋白马铃薯脑啡呔油菜脑啡呔油菜生产促性腺绒毛激素的矮牵牛花生产促性腺绒毛激素的矮牵牛花我们吃的每一口食物都曾通过我们吃的每一口食物都曾通过遗传工程改造过。遗传工程改造过。-转基因大豆转基因大豆:55%:55%种植大豆种植大豆 (2000)(2000)-豆类食品豆类食品:作为食品添加剂溜作为食品添加剂溜上我们的餐桌。上我们的餐桌。转基因抗农药品种转基因抗农药品种一品红一品红让地上长塑料！让地上长塑料！植物合成可降解塑料！植物合成可降解塑料！Production of speciality chemicalsEnkephalinsFatty acidsHuman serum albuminSugar monomersSugar thermoplastic polymersVaccines(e.g.hepatitis)利利用用微微生生物物的的废废液液处处理理厂厂基因工程课程内容5 2 3 4 1 6 7 基因工程概论基因工程概论分子克隆单元操作分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程动物基因工程动物基因工程植物基因工程植物基因工程蛋白质工程、途径工程（自学）蛋白质工程、途径工程（自学）2 2）如何构建？）如何构建？1 1）如何设计？）如何设计？