《实时定量PCR》课件.ppt

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1、实时实时定量定量PCR（qRT-PCR）实时定量PCR（qRT-PCR）Polymerase Chain Reaction（PCR）聚合酶链式反应伟大的天才发现！伟大的天才发现！Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链PCR的基本原理的基本原理PCR的基本原理的基本原理

2、模板DNA9450-65引物1引物2DNA引物72PCR的基本原理引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点第1轮结束94第2轮开始PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点50-65TaqTaqTaqTaq72PCR的基本原理vPCR反应条件vPCR过程vPCR的特点第2轮结束PCR基本原理基本原理MgMg2+2+模板模板引物引物dNTPdNTPDNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR反反应应基本要素基本要素 1、单单、双、双链链DNA，cDNA均可均可 2、不能混有蛋白不能混有蛋白酶酶、核酸、核酸酶酶、DNA聚合聚合酶酶

3、抑制抑制剂剂DNA结结合蛋白合蛋白类类 3、一般一般100ng DNA模板模板/100 L,模板模板浓浓度度过过高会高会导导致反致反应应的非特异性增加的非特异性增加（1）模板）模板 1、引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 2、引物的设计 （2）引物（3）Taq DNA聚合聚合酶酶 1、酶酶的用量一般的用量一般为为0.5-2.5 U/50 l，2、酶酶量增加使反量增加使反应应特异性下降特异性下降;酶酶量量过过少少影响反影响反应产应产量。量。（4）Mg2+1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系

4、。2、Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。3、Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度 2、四种dNTP浓度应相等 3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）dNTP(1)(1)变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链,9494 3 30-0-4 40 0s s(2)(2)退火退火v温度由温度由引物长度引物长度和和GCGC含量含量决定。决定。v增

5、加温度能减少引物与模板的非特异性结增加温度能减少引物与模板的非特异性结合合;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数循环参数（3 3）延伸）延伸v68-75,68-75,一般为一般为7272v延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4）循环次数）循环次数v主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度,一般为一般为25-3525-35次次v次数过多次数过多,扩增效率降低扩增效率降低,错误掺入率增加错误掺入率增加常用常用PCR反反应应体系体系(以以HiFi Taq为为例例)v模板模板 1.0 Lv上游引物上游引物 0.5 Lv下游引物下游引物 0.

6、5 Lv10X HiFi Buffer（+Mg2+）2.5 LvdNTPs 2.0 LvHiFi Taq酶酶 0.2-0.3 LvddH2O 补补足足25 Lv共共 25 L常用常用PCR反反应应条件条件v94 2-5minv94 30-40svTm 30-45sv72 1min/1kbv72 10minv12 +25-35个循环几种常用几种常用PCR技技术术vRT-PCR(Reverse Transcription PCR)v反向反向PCR (Reverse PCR)vRACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)vqRT-PCR(Quantitative Re

7、al Time PCR)基因基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链RT-PCR(反反转录转录PCR)DNA水平水平RNA水平水平蛋白水平蛋白水平RT-PCR基本原理基本原理mRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverse TranscriptionmRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTcDNART-PCR一般步一般步骤骤v1、RNA提取RNA质质量的量的检测检测一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性完整性和纯纯度度完整性检测（完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）琼脂糖胶电泳）纯度检测（纯度检测（OD260/280）OD260/280一般介于一般

8、介于1.9-2.1之间，小于之间，小于1.9时蛋白污染；大于时蛋白污染；大于2.1时时RNA发生降解发生降解28S18S5Sv2、反转录RT-PCR一般步一般步骤骤在冰盒上加入以下试剂：组成体积随机引物随机引物或或Oligo dT）1L1-5g Total RNAxLDEPC-Treated H2OyL 体系配制完成后瞬时离心，70反应反应5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,此步骤的作用是此步骤的作用是去除去除mRNA的二级结构的二级结构。RT-PCR一般步一般步骤骤组成体积5X Buffer4LdNTPs1LRNAse inhibitor1LM-MLV1L

9、DEPC-Treated H2OxL1、混匀，42，90min2、70，10min，终止反应3、A3检测在冰盒上加入以下试剂：反向PCR(reverse）PCR)已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列v反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。v可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶反向PCR原理vcDNA 末端快速

10、末端快速扩扩增技增技术术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是一种基于是一种基于PCR技技术术从从低丰度的低丰度的转录转录本中快速本中快速扩扩增增cDNA 的的5和和3末末端的有效方法端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。而受到越来越多的重视。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)AAAAAAAAmRNA接头序列AAAAAAAAmRNAGeneRacer 3PrimerGSP2GeneRacer 3Nested PrimerNGSP2Reverse transcri

11、ptionGeneRacer Oligo dT PrimerTTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCGcDNATTTTTTTTTGTGACAGTACGGCAATGCATCGCATAGCAACTGTCG已知片段RACE 3RACE原理mRNAAAAAAAmRNANNNNNNNNNNNAAAAAAOligo dTReverse TranscriptionNGSP1GeneRacer 5Nested PrimerGSP1GeneRacer 5 PrimerGeneRacer RNA Oligo SequenceNNNNNNNNNNN接头序列TTTTTT

12、NNNNNNNNNNNcDNAmRNAAAAAAANNNNNNNNNNN已知片段5RACE原理qRT-PCR(Quantitative Real Time PCR)v通过通过荧光染料荧光染料或荧光标记的特异性或荧光标记的特异性探针探针,对对PCRPCR产物进行标记跟踪产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过实时在线监控反应过程程,结合相应的软件可以对结果进行分析结合相应的软件可以对结果进行分析,计计算待测样品的初始模板量。算待测样品的初始模板量。内内内内掺掺掺掺式染料式染料式染料式染料 SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探序列特异性探序列特异性探序列特异性探针针针针 Taqm

13、anTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探引物特异性探引物特异性探引物特异性探针针针针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)1、SYBR Green 法SYBR Green 工作原理SYBR Green法优缺点融解曲线（dissociation curve）正常有非特异性扩增 2、TaqMan探针法作用机理TaqManTaqMan法与法与SYBR Green I的的比较比较几个重要概念几个重要概念基基线线（Baseline）荧

14、荧光光阈值阈值（threshold）v荧光阈值（荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线上是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。荧光域值是倍。荧光域值是PCR315个循环荧光信个循环荧光信号标准差的号标准差的10倍，荧光域值设定在倍，荧光域值设定在 PCR扩增扩增的指数期。的指数期。Ct值值（threshold value）v每个反应管内的荧光信号到达设每个反应管内的荧光

15、信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值。值。v研究表明，各模板的研究表明，各模板的Ct值与该模值与该模板的板的起始拷贝数起始拷贝数的对数存在线性关的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，系，起始拷贝数越多，Ct值越小。值越小。反之亦然。反之亦然。定量PCR的数学原理荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法相对定量相对定量内参基因目的基因120.2内参基因v内参基因内参基因：qRT-PCR时时，每个，每个标标本都要做本都要做对对应应的内参，而且每次都是管家基因，一般用的内参，而且每次都是管家基因，一般用-actin，有，有时时也用也用GAPDH。v管家基因

16、管家基因：又称：又称持家基因持家基因(house-keeping genes)生物体各生物体各类细类细胞中都表达，其胞中都表达，其产产物是物是对对维维持持细细胞基本生命活胞基本生命活动动所必需的蛋白所必需的蛋白质编码质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶酶系基因系基因与核糖体蛋白基因等。是与核糖体蛋白基因等。是为维为维持持细细胞基本生胞基本生命活命活动动所需而所需而时时刻都在表达的基因。刻都在表达的基因。内参基因的选择v理想的内参基因应该满足以下条件理想的内参基因应该满足以下条件：v1、不存在假基因，以避免基因、不存在假基因，以避免基因 DNA的扩增的扩增v2、高

17、度或中度表达，排除低表达、高度或中度表达，排除低表达v3、稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞、稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别别v4、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关v5、其稳定的表达水平与目标基因相似、其稳定的表达水平与目标基因相似v6、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响何实验处理措施的影响 常用内参基因家蚕常用内参基因vActin3vGAPDHv sw22934数据处

18、理（Ct法）qRT-P C R的的优优点及限制因素点及限制因素vqRT-PCR不仅实现了不仅实现了PCR从定性到定量的从定性到定量的飞跃，而且与常规飞跃，而且与常规PCR相比，它具有相比，它具有操作操作简简便便、快速高效快速高效、敏感性敏感性高高、特异性特异性强强、有效、有效解决了解决了PCR污染污染的问题、的问题、自动化程度高自动化程度高等特等特点点qRT-PCR限制因数v实验费用昂贵，需要设置多组重复和对照v怎样避免扩增基因组DNA、如何消除和评定由于样品处理、仪器的差异和个人操作而带来的误差以及如何更准确定量基因？v值得指出的是，qRT-PCR只能定量mRNA水平，但mRNA水平可能不能

19、反映细胞中蛋白水平，因为在转录后还有诸多调节因素。v要准确而全面的了解机体的表达水平，除了分析mRNA水平外，还需要免疫组织化学和生物化学实验的数据。v更多关于更多关于qRT-PCR的信息，请参照的信息，请参照：引物设计引物设计v常用引物设计软件：primer Premier，Oligov序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列v引物长度：17-25bpv碱基尽可能随机分布,GC%：40%-60%v尽量避免错配（False Priming)、引物二聚体(Dimer)和发夹结构（Hairpin）引物设计引物设计v引物长度：17-25bpvGC%:40-60%vTm:60（Primer Premier 5.0）v产物长度：80-300bp,100-200bp最佳