细胞器的分离纯化.pptx

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1、会计学1细胞器的分离纯化细胞器的分离纯化实验目的实验目的 n n认识离心机，学习离心机的使用方法n n学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法 第1页/共11页实验原理实验原理n n 离心技术离心技术离心技术离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。离分析技术。n n细胞分级分离法细胞分级分离法细胞分级分离法细胞分级分离法是一种通过离心从而分离细胞内不同结构成份的是一种通过离心从而分离细胞内不同结构成份的细胞器细

2、胞器(包括核、叶绿体、线粒体、微体等包括核、叶绿体、线粒体、微体等)以研究其形态结构，化以研究其形态结构，化学组成成份和生理活性的方法。学组成成份和生理活性的方法。第2页/共11页n n这个方法包括这个方法包括匀浆化匀浆化匀浆化匀浆化，分级分离分级分离分级分离分级分离，分析分析分析分析三个步骤。通过匀浆化得三个步骤。通过匀浆化得到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的液体环境下，在离心机中进到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的液体环境下，在离心机中进行离心分离处理。因为离心力的作用，可以把细胞内比重和大小行离心分离处理。因为离心力的作用，可以把细胞内比重和大小不同的各种结构分开。不同的各种结构分开。第3页

3、/共11页n n匀浆化匀浆化匀浆化匀浆化：在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破碎。这就是细。这就是细。这就是细。这就是细胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆 。n n分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同来将其分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同来将其分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同来将其分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等的不同来将其分离。分离。分离。分

4、离。n n分析分析分析分析：对用这样方法得到的分离物进行化学分析对用这样方法得到的分离物进行化学分析对用这样方法得到的分离物进行化学分析对用这样方法得到的分离物进行化学分析，可以大大丰富，可以大大丰富，可以大大丰富，可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。细胞各种组分的结构和机能的知识。细胞各种组分的结构和机能的知识。细胞各种组分的结构和机能的知识。第4页/共11页细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常用相对离心场细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常用相对离心场细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常用相对离心场细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常

5、用相对离心场表示表示表示表示 相对离心场相对离心场n nRCF=1.11 x 10RCF=1.11 x 10-5-5(n n)2 2 r r RCFRCF表示相对离心场表示相对离心场表示相对离心场表示相对离心场 n n（rpmrpm）表示离心机每分钟的转数表示离心机每分钟的转数表示离心机每分钟的转数表示离心机每分钟的转数 r r 表示表示表示表示离心半径，即离心半径，即离心半径，即离心半径，即离心机转轴中心与离心管中心的距离离心机转轴中心与离心管中心的距离离心机转轴中心与离心管中心的距离离心机转轴中心与离心管中心的距离 由于离心管的位置由转（由于离心管的位置由转（rotor）决定，因此）决定，

6、因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。必须由查阅相关转子的参数而得。第5页/共11页差速离心法差速离心法 从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离粒分离沉淀下来

7、，从而使各种亚细胞组分得以分离粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒差速离心法主要用于分离细胞器和病毒差速离心法主要用于分离细胞器和病毒差速离心法主要用于分离细胞器和病毒n n优优优优点点点点：操操操操作作作作简简简简单单单单，离离离离心心心心后后后后用用用用倾倾倾倾倒倒倒倒法法法法即即即即可可可可将将将将上上上上清清清清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。n n缺缺缺缺点点点点：分分分分离离离离效效效效果果果果差差差差，

8、不不不不能能能能一一一一次次次次得得得得到到到到纯纯纯纯颗颗颗颗粒粒粒粒；壁壁壁壁效效效效应应应应严严严严重重重重，特特特特别别别别是是是是当当当当颗颗颗颗粒粒粒粒很很很很大大大大或或或或浓浓浓浓度度度度很很很很高高高高时时时时，在在在在离离离离心心心心管管管管一一一一侧侧侧侧会会会会出出出出现现现现沉沉沉沉淀淀淀淀；颗颗颗颗粒粒粒粒被被被被挤挤挤挤压压压压，离离离离心心心心力力力力过过过过大大大大、离离离离心心心心时时时时间间间间过过过过长长长长会会会会使使使使颗颗颗颗粒粒粒粒变变变变形形形形、聚聚聚聚集而失活。集而失活。集而失活。集而失活。第6页/共11页普通离心机普通离心机普通离心机普通

9、离心机第7页/共11页高速低温离心机高速低温离心机高速低温离心机高速低温离心机第8页/共11页实验用品实验用品(一一)材料：新鲜菠菜材料：新鲜菠菜 (二二)器械：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、器械：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、200200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器等。目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器等。(三三)试剂试剂 l l、线粒体离心匀浆介质、线粒体离心匀浆介质 2 2、1 1詹纳斯绿詹纳斯绿 B B的的0.25M0.25M蔗糖溶液。蔗糖溶液。3 3、0.05M TrisHCL0.05M TrisHCL液体液体 PH 8.0PH 8.0 0.02M

10、Tris 55ml 0.02M Tris 55ml 0.1N HCI 55ml 0.1N HCI 55ml 蒸馏水蒸馏水200ml 200ml 4 4、0.35mol/lNaCl0.35mol/lNaCl第9页/共11页菠菜叶叶绿体的分离菠菜叶叶绿体的分离菠菜叶叶绿体的分离菠菜叶叶绿体的分离取去叶脉的新鲜菠菜取去叶脉的新鲜菠菜取去叶脉的新鲜菠菜取去叶脉的新鲜菠菜5g5g于研钵内，加入于研钵内，加入于研钵内，加入于研钵内，加入0.35mol/L NaCl 15ml0.35mol/L NaCl 15ml研磨研磨研磨研磨 绿色的匀浆液用尼龙网（绿色的匀浆液用尼龙网（绿色的匀浆液用尼龙网（绿色的匀浆液

11、用尼龙网（200200目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心管目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心管目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心管目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心管 1000rpm1000rpm离心离心离心离心4min4min，除去沉淀，除去沉淀，除去沉淀，除去沉淀 上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以上清液在高速低温离心机上以3000rpm3000rpm离心离心离心离心5min5min，所得沉淀即为叶绿体，所得沉淀即为叶绿体，所得沉淀即为叶绿体，所得沉淀即为叶绿体 用用用用0.35mol/L NaCl0.35mol/L NaCl液稀释，置冰箱中保存备用液稀释，置冰箱中保存备用液稀释，置冰箱中保存备用液稀释，置冰箱中保存备用 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察第10页/共11页