高效液相色谱概述课件.ppt

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1、高效液相色谱法(HPLC)High Performance Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography第一节 概述一、一、高效液相色谱法及其特点高效液相色谱法及其特点1.1.高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）：以：以经典液相色谱法经典液相色谱法为基础，引入为基础，引入气相色谱气相色谱的理论和实验技术，发展的理论和实验技术，发展而成的而成的分离分析分离分析方法。方法。2.高效液相色谱法与高效液相色谱法与经典液相色谱法、气相色谱法经典液相色谱法、气相色谱法的区别的区别（1）与经典液相色谱法的比较）与经典液相

2、色谱法的比较 经典柱色谱法分离过经典柱色谱法分离过程程装载样品装载溶剂重力洗脱玻璃柱硅胶氧化铝纤维素滤网1050100150Volume(mL)Time(hr)1.02.03.04.0普通规格固定相普通规格固定相普通规格固定相普通规格固定相常压输送流动相常压输送流动相常压输送流动相常压输送流动相色谱柱一次使用色谱柱一次使用色谱柱一次使用色谱柱一次使用离线检测离线检测离线检测离线检测高效液相色谱法分离过程高效液相色谱法分离过程进样口进样口检测器检测器色谱图色谱图色谱柱色谱柱溶剂溶剂高压泵高压泵混合器混合器高压输送流动相高压输送流动相高压输送流动相高压输送流动相高效固定相高效固定相高效固定相高效固

3、定相在线检测在线检测在线检测在线检测色谱柱多次使用色谱柱多次使用色谱柱多次使用色谱柱多次使用高灵敏检测器高灵敏检测器高灵敏检测器高灵敏检测器差别：差别：主要在于主要在于固定相的性质、形状及粒度固定相的性质、形状及粒度，其，其 次是次是检测手段和输液设备检测手段和输液设备。经典液相色谱经典液相色谱固定相：固定相：粒粒 度：度：60600m（多孔）多孔）柱柱 长：长：10200cm（d=1050mm）n 约为约为250/m 流动相：流动相：靠重力输送靠重力输送 经典液相色谱无经典液相色谱无在线在线检测器检测器缺点：缺点：（1）粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，）粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩

4、散和传质阻力大。扩散和传质阻力大。（2）无检测设备，分析速度慢、效率低。）无检测设备，分析速度慢、效率低。只能做为只能做为分离手段分离手段高效液相色谱法高效液相色谱法固定相：固定相：520m，球形。流动相：高压泵输液。球形。流动相：高压泵输液。检测器：在线检测。检测器：在线检测。（2）高效液相色谱与气相色谱的比较高效液相色谱与气相色谱的比较气相色谱法分离过程气相色谱法分离过程1.载气瓶 2.压力调节器 3.净化器 4.稳压阀 5.柱前压力表 6.流量计 7.进样器 8.色谱柱 9.柱温箱 10.馏分收集口 11.检测器 12.检测器恒温箱 13.记录装置 14.尾气出口HPLC与与GC的差别：

5、的差别：主要在于做为主要在于做为流动相的液流动相的液体和气体性质之间体和气体性质之间的差别，其次是的差别，其次是操作条件和操作条件和分析对象分析对象的差别。的差别。流动相流动相G C:惰性气体，与组分分子间无作用力。只起运载惰性气体，与组分分子间无作用力。只起运载 组分的作用。组分的作用。HPLC:各种液体，与组分分子间有作用力，同时与固各种液体，与组分分子间有作用力，同时与固 定相展开对组分的竞争，对分离起很大作用。定相展开对组分的竞争，对分离起很大作用。分析对象分析对象G C:柱温下具有足够挥发性和热稳定性的物质、气柱温下具有足够挥发性和热稳定性的物质、气 体或沸点较低的化合物。体或沸点较

6、低的化合物。操作条件温度：G C:一定柱温下进行分离。一定柱温下进行分离。HPLC:通常室温下进行分离。通常室温下进行分离。检测器：检测器：G C:TCD、FID、ECD、FPD和和NPD HPLC:UV、DAD、FD、RID3.3.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点（1 1）分离效能高）分离效能高 （2 2）选择性高）选择性高 （3 3）灵敏度高）灵敏度高（4 4）分析速度快）分析速度快 （5 5）应用范围广）应用范围广二、高效液相色谱法在药物分析中的应用二、高效液相色谱法在药物分析中的应用 色谱法具有分离分析两种功能，因此在药物分析色谱法具有分离分析两种功能，因此在药物分析中，中，H

7、PLCHPLC已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的主要手段。杂质分离及含量测定的主要手段。中国药典中国药典：1953195320052005年共出版发行七版年共出版发行七版滴定分析：各版均占滴定分析：各版均占5050以上。以上。UV:UV:用于含量测定、含量均匀度或溶出度测定。用于含量测定、含量均匀度或溶出度测定。IRIR：用于原料药鉴别（用于原料药鉴别（20002000版版444444个品种）个品种）8585版开始收载版开始收载HPLCHPLC法法7 7项项9090版版7676项；项；20002000版版200200多项；多项；

8、20052005版版10001000多项多项 美国药典委员会（美国药典委员会（USPC）成立于成立于1820年，至今年，至今近近200年。出版发行了年。出版发行了25版药典。版药典。75年（年（19版）将版）将HPLC载入药典载入药典20版版62项；项；21版版363项；项；22版版871项；项；23版版1188项；项；24版含量测定方法：版含量测定方法：1386项项 鉴别：鉴别：519项项 杂质检查：杂质检查：206项项 如今：在评价世界各国药典水平时，如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法已法已成为反映各国药典先进性的重要指标之一。成为反映各国药典先进性的重要指标之一。三、高效液相色谱

9、法的分类三、高效液相色谱法的分类 1.按固定相的聚集状态分按固定相的聚集状态分 液固色谱；液液色谱液固色谱；液液色谱 2.按溶质在两相间分离过程中的物理化学原理分按溶质在两相间分离过程中的物理化学原理分 （1）吸附色谱（）吸附色谱（Adsorption Chromatography）（2）分配色谱（）分配色谱（Partition Chromatography）（3）离子色谱（）离子色谱（Ion Chromatography）（4）空间排阻色谱（）空间排阻色谱（Size Exclusion Chromatography)（5）亲和色谱（）亲和色谱（Affinity Chromatography）

10、（6）手性色谱（）手性色谱（Chiral Stationary Chromatography）3.按流动相压强分按流动相压强分 （1）高效液相色谱法（）高效液相色谱法（HPLC）（2）超高效液相色谱法（）超高效液相色谱法（UPLC）四、高效液相色谱法的应用范围和局限性四、高效液相色谱法的应用范围和局限性1.应用范围应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。涉及石油化

11、工产品、食品、药品、生物化工厂品涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工厂品及环境污染物。约占全部有机物的及环境污染物。约占全部有机物的80。2.方法的局限性方法的局限性 （1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境。）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境。（2）缺少通用检测器）缺少通用检测器 （3）不能完全替代气相色谱）不能完全替代气相色谱 （4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性 的生化样品分析的生化样品分析 综上，高效液相色谱法与其他分析方法一样，综上，高效液相色谱法与其他分析方法一样，不是尽善尽美的。作为从事药物分析工作的人们在不是尽善尽美的

12、。作为从事药物分析工作的人们在掌握高效液相色谱法的特点、应用范围和局限性的掌握高效液相色谱法的特点、应用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际分析任务中发挥重要作用解决实际分析任务中发挥重要作用。第二节第二节 高效液相色谱法的基本理论高效液相色谱法的基本理论一、高效液相色谱参数一、高效液相色谱参数1.定性参数定性参数 t R、t0、2.柱效参数柱效参数 、w1/2、w w=4 或 W=1.699w1/2 3.相平衡参数相平衡参数 K=CS/Cm k=ms/mm=CS VS/CmVm=K.VS/Vm 4.分离参数分离参数R=

13、1.0 裸露面积裸露面积95.4R=1.5裸露面积裸露面积99.7 R1.5完全分开完全分开二、高效液相色谱法的基本理论二、高效液相色谱法的基本理论 色谱分析法的目的是将样品中各组分彼此分离，达到色谱分析法的目的是将样品中各组分彼此分离，达到可以测定的目的，然后用合适的方法进行定性、定量分析。可以测定的目的，然后用合适的方法进行定性、定量分析。对于最难分离的物质对，分离有三种情况：对于最难分离的物质对，分离有三种情况：由三种分离情况可得出：由三种分离情况可得出：由三种分离情况可得出：由三种分离情况可得出：1.1.两组分若想分开，两组分若想分开，两组分若想分开，两组分若想分开，t tR R差别应

14、足够大。即两组分迁移速度差别应足够大。即两组分迁移速度差别应足够大。即两组分迁移速度差别应足够大。即两组分迁移速度 不同不同不同不同 取决色谱体系热力学过程。取决色谱体系热力学过程。取决色谱体系热力学过程。取决色谱体系热力学过程。2.两组分若想分开，色谱峰应足够窄。两组分若想分开，色谱峰应足够窄。峰宽窄峰宽窄的本质的本质是组分是组分在色谱柱内的扩散及在两相中达到分配平衡的速度在色谱柱内的扩散及在两相中达到分配平衡的速度取取决色谱体系动力学过程决色谱体系动力学过程（一）塔板理论（一）塔板理论 1.前提：四个基本假设前提：四个基本假设 2.解决的问题：解决的问题：（1）较好的描述色谱流出曲线的形状

15、）较好的描述色谱流出曲线的形状（2）阐明了溶质的分布随流经色谱柱的流动相体积的变化）阐明了溶质的分布随流经色谱柱的流动相体积的变化 规律及溶质浓度极大点的位置规律及溶质浓度极大点的位置（3）定量说明色谱柱效以及决定色谱区域宽度参数，导出）定量说明色谱柱效以及决定色谱区域宽度参数，导出 了保留体积的基本关系式。了保留体积的基本关系式。3.塔板理论是一种具有一定局限性的半经验理论，其缺点：塔板理论是一种具有一定局限性的半经验理论，其缺点：（1）不能解释不能解释u不同（同一溶质），不同（同一溶质），H（n）不同不同（2）不能说明色谱柱结构参数、操作条件与塔板数的关系）不能说明色谱柱结构参数、操作条件

16、与塔板数的关系（3）忽略了组分在色谱柱内的扩散和传质，因此不能解释）忽略了组分在色谱柱内的扩散和传质，因此不能解释 影响塔板高度的各种因素影响塔板高度的各种因素 综上：塔板理论对色谱体系的设计综上：塔板理论对色谱体系的设计和色谱条件的选择的指导意义有限。和色谱条件的选择的指导意义有限。（二）速率理论（二）速率理论Van DeemterVan Deemter方程方程速率理论主要阐述使色谱峰展宽，柱效降低的各种动力学因素速率理论主要阐述使色谱峰展宽，柱效降低的各种动力学因素 GCGC速率方程速率方程Van Deemteer Van Deemteer 方程式方程式 HPLCHPLC速率方程速率方程G

17、iddings Giddings 方程式方程式涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项纵向扩散项流动相传质流动相传质流动相传质流动相传质阻抗项阻抗项阻抗项阻抗项静态流动相静态流动相静态流动相静态流动相传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项传质阻抗项固定相传质固定相传质固定相传质固定相传质阻抗项阻抗项阻抗项阻抗项1.涡流扩散相（涡流扩散相（HE）HE=A=2dp:填充不规则因子（填充不规则因子（12）dp：固定相平均粒径固定相平均粒径 初始带宽初始带宽最终

18、带最终带宽宽AuH由上得出：由上得出：涡流扩散相只与固定相填充情况有关，涡流扩散相只与固定涡流扩散相只与固定相填充情况有关，涡流扩散相只与固定相填充情况有关，与组分、固定相和流动相性质，流动相流速无相填充情况有关，与组分、固定相和流动相性质，流动相流速无关。关。2.纵向扩散相（纵向扩散相（HL）HL=B/u=2Dm/u:柱中填料间的填充因子；柱中填料间的填充因子；Dm:溶质在流动相中的扩散系数。溶质在流动相中的扩散系数。B线速度uHu 高效液相色谱中，多数情况高效液相色谱中，多数情况 HL=0，这是存在无这是存在无限直径效应限直径效应 的根本原因。的根本原因。3.传质阻抗项（传质阻抗项（HR）HR=Hs+Hm +Hsm 静态流动相流动相固定相C.UHu（1）固定相中的传质阻抗（）固定相中的传质阻抗（Hs）溶质分子从液体流动相转移进入固定相和从固定相移出溶质分子从液体流动相转移进入固定相和从固定相移出重新进入流动相过程为传质。重新进入流动相过程为传质。