微生物的生长及控制学习教案.pptx

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1、会计学1微生物的生长微生物的生长(shngzhng)及控制及控制第一页，共134页。n n 个体生长个体繁殖群体生长n n 群体生长个体生长个体繁殖n n 在微生物的研究(ynji)和应用中，只有群体的生长才有实际意义。n n 微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行殖交替进行(jnxng)的过程，称之为发育。的过程，称之为发育。第2页/共134页第二页，共134页。第一节第一节 测定生长测定生长(shngzhng)(shngzhng)繁殖的方法繁殖的方法n n微生物学中将微生物学中将(z

2、hngjing)(zhngjing)在实验室条件下从一个在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。n n一、纯培养的分离方法一、纯培养的分离方法n n（一）、稀释法（一）、稀释法n n液体稀释法液体稀释法n n固体稀释倒平板法固体稀释倒平板法第3页/共134页第三页，共134页。稀释(xsh)倒平板法 第4页/共134页第四页，共134页。（二）、平板(pngbn)划线分离法 用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划平板表面进行平行划线、

3、扇形划线或其他形式的连续划线线，如果划线适宜，如果划线适宜(shy)的话，微生物能一一分散，经培的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。养后，可在平板表面得到单菌落。第5页/共134页第五页，共134页。（三）、单孢子(boz)或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体(gt)进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制或单细胞进行培养。也可以采用特制(tzh)的毛细管在载玻片的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培

4、养基的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。进行培养。第6页/共134页第六页，共134页。（四）、选择性培养基分离法各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性(txng)可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。微生物纯培养分离微生物纯培养分离(fnl)方方法的比较法的比较分离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法平皿划线法方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法单细胞挑取法局限于高度专业化的科学

5、研究局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法利用选择培养基法适适用用于于分分离离某某些些生生理理类类型型较较特特殊殊的的第7页/共134页第七页，共134页。二、微生物生长繁殖二、微生物生长繁殖二、微生物生长繁殖二、微生物生长繁殖(fnzh)(fnzh)(fnzh)(fnzh)的测定的测定的测定的测定n n测定微生物生长(shngzhng)的方法根据：n n 生长(shngzhng)意味着原生质含量的增加第8页/共134页第八页，共134页。（一）测生长量（一）测生长量（一）测生长量（一）测生长量n n1、直接法n n测体积 n n称干重：1mg干菌体=5-10mg湿菌体n n =5-101

6、07个菌体n n2、间接法 n n比浊法 n n生理(shngl)指标法 第9页/共134页第九页，共134页。比浊法比浊法比浊法比浊法第10页/共134页第十页，共134页。生理(shngl)指标测定法常用于对微生物的快速鉴定(jindng)与检测微生物的生理指标微生物的生理指标(zhbio)，如呼吸强度，耗氧量、酶，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。活性、生物热等与其群体的规模成正相关。与微生物生长量相平行的生理指标：含氮量含氮量、含碳量、几丁质含量、DNA、RNA等等蛋白质总量=含N量%6.25第11页/共134页第十一页，共134页。(二二二二)计繁殖计繁殖计

7、繁殖计繁殖(fnzh)(fnzh)(fnzh)(fnzh)数数数数 n n 即计算微生物的个体数目(shm)n n 计繁殖数只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子 第12页/共134页第十二页，共134页。1 1 1 1、直接、直接、直接、直接(zhji)(zhji)(zhji)(zhji)法法法法 n n 所得的结果是包括死细胞在内的总菌数 n n a、涂片染色法n n 原菌液含菌数/mL=视野中平均菌数视野个数/cm2 100 n n 稀释倍数n n b、比例(bl)计数法n n c、血球计数板n n 第13页/共134页第十三页，共134页。利用血球利用血球计数板，计数板，在

8、显微镜在显微镜下计算一下计算一定容积定容积(rngj)里样品中里样品中微生物的微生物的数量。数量。缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度需要相对高的细菌浓度(nngd)；个体小的细菌在显微镜下难以观察。个体小的细菌在显微镜下难以观察。原菌液含菌数原菌液含菌数/mL=/mL=每小每小格平均数格平均数4001000040010000稀释稀释(xsh)(xsh)倍数倍数第14页/共134页第十四页，共134页。2 2 2 2、间接、间接、间接、间接(jin ji)(jin ji)(jin ji)(jin ji)法法法法

9、n n 原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过(tnggu)生长形成菌落。n n 所测的菌落就是待测样品所含的活菌数。第15页/共134页第十五页，共134页。n n平板(pngbn)菌落计数法 第16页/共134页第十六页，共134页。第17页/共134页第十七页，共134页。n n优点：优点：n n适用于多种材料；适用于多种材料；n n菌数较少也能准确测定。菌数较少也能准确测定。n n缺点：缺点：n n并非所有微生物在试验期间都并非所有微生物在试验期间都能长出菌落；能长出菌落；n n意外的损伤可能导致菌落减少；意外的损伤可能导致菌落减少；n n肉眼肉眼(ruyn)无法观察

10、的菌落。无法观察的菌落。活菌指示剂：活菌指示剂：TTC（2，3，5-氯化三苯基氯化三苯基(bnj)四氮唑）四氮唑）第18页/共134页第十八页，共134页。厌氧的菌落厌氧的菌落厌氧的菌落厌氧的菌落(jnlu)(jnlu)计数法计数法计数法计数法l l亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法 l l厌氧手套(shuto)箱培养法l l 用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）的研究工作 l l厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法 l l 不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。第19页/共134页第十九页，共134页。

11、一、同步一、同步(tngb)培养培养概念：同步培养(synchronous culture)是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时(tngsh)进行生长或分裂的群体细胞。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段(jidun)，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。第二节 微生物的生长规律第20页/共134页第二十页，共134页。同步同步(tngb)培培养方法养方法机械(jxi)方法环境(hunjng)条件诱导法离心方法离心方法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法温度温

12、度培养基成份控制培养基成份控制最高稳定期的细胞接种最高稳定期的细胞接种第21页/共134页第二十一页，共134页。硝硝酸酸(xiosun)纤纤维维素素滤滤膜膜法法离离心心法法第22页/共134页第二十二页，共134页。n n机械法：机械法：n n优点：不影响细菌代谢；优点：不影响细菌代谢；n n缺点：不能用于即使是相同缺点：不能用于即使是相同(xin tn)发育阶段个体大小发育阶段个体大小不一致的微生物。不一致的微生物。n n诱导法：诱导法：n n优点：方法多、应用范围广；优点：方法多、应用范围广；n n缺点：对细菌代谢有影响。缺点：对细菌代谢有影响。第23页/共134页第二十三页，共134页

13、。将少量单细胞的纯培养物接种于一恒定容积的新鲜培养基中在合适条件下进行培养，在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量(shling)的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长生长(shngzhng)曲线曲线二、单细胞微生物的典型生长二、单细胞微生物的典型生长(shngzhng)曲线曲线第24页/共134页第二十四页，共134页。生长生长(shngzhng)曲曲线可分：线可分：延滞延滞(ynzh)期期对数对数(dush)期期衰亡期衰亡期稳定期稳定期第25页/共134页第二十五页，共134页。（一

14、）延滞（一）延滞（一）延滞（一）延滞(yn zh)(yn zh)(yn zh)(yn zh)期（期（期（期（lagphaselagphaselagphaselagphase）n n特点：特点：n n生长速率常数等于零；生长速率常数等于零；n n细胞形态变大或增长；细胞形态变大或增长；n n细胞内细胞内RNA尤其尤其(yuq)是是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；含量增高，原生质呈嗜碱性；n n合成代谢活跃；合成代谢活跃；n n对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。将少量将少量(sholing)菌种接入新鲜培养基后，在开始菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少

15、，生长速度接一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期、调整期。近于零。也称延迟期、适应期、调整期。第26页/共134页第二十六页，共134页。延滞期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶、辅酶或是缺乏充足的中间代谢物。为产生(chnshng)诱导酶或合成有关的中间代谢物，就需要有一段适应期，于是出现了生长的延滞期。出现出现(chxin)延滞期的延滞期的原因？原因？第27页/共134页第二十七页，共134页。n n影响延滞期长短的因影响延滞期长短的因影响延滞期长短的因影响延滞期长短的因素素素素 n n菌种菌种菌种菌种n n

16、接种接种接种接种(jizhng)(jizhng)龄龄龄龄 n n接种接种接种接种(jizhng)(jizhng)量量量量 n n培养基成分培养基成分培养基成分培养基成分 第28页/共134页第二十八页，共134页。n n 在工业发酵和科研中通常采取(ciq)一定的措施缩短延滞期：l通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短(sudun)；l利用对数生长期的细胞作为利用对数生长期的细胞作为“种子种子”；l尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；l适适当当扩扩大大接接种种量量等等方方式式缩缩短短(sudu

17、n)迟迟缓缓期期，克克服服不不良良的的影影响。响。第29页/共134页第二十九页，共134页。（二）指数（二）指数（二）指数（二）指数(zhsh)(zhsh)(zhsh)(zhsh)期期期期（exponentialphaseexponentialphaseexponentialphaseexponentialphase）n n 又称为对数期，是指生长曲线中紧接延滞期的一个又称为对数期，是指生长曲线中紧接延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。细胞以几何级数速度分裂的一段时期。n n特点：特点：n n生长速率常数生长速率常数R R最大，因而细胞每分裂一次所需的代时最大，因而细胞每分裂一次所

18、需的代时GG或原生质增加一倍所需的倍增或原生质增加一倍所需的倍增(bi zn(bi zn)时间最短；时间最短；n n细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；n n酶系活跃，代谢旺盛。酶系活跃，代谢旺盛。第30页/共134页第三十页，共134页。繁殖繁殖繁殖繁殖(fnzh)(fnzh)(fnzh)(fnzh)代数（代数（代数（代数（n n n n）繁殖繁殖(fnzh)(fnzh)代数代数 n=3.322(lgx2 n=3.322(lgx2lgx1)lgx1)12=2124=2248=23816=2416=1 24.2nx2=x1 2nlgx2=lgx1

19、+nlg2n=（lgx2 lgx1）/lg2=3.322(lgx2 lgx1)第31页/共134页第三十一页，共134页。生长速率生长速率生长速率生长速率(sl)(sl)(sl)(sl)常数（常数（常数（常数（R R R R）代时（代时（G G）第32页/共134页第三十二页，共134页。n n例：设大肠杆菌在接种时的细胞(xbo)浓度为100个/mL，经过400min的培养细胞(xbo)浓度增至10亿个/mL，求该菌的繁殖代数和世代时间。n n解：n=3.322(lg x 2 lg x1)n n =3.322(lg 109 lg102)n n =23.2n n n n G=1/R=(t1 t

20、2)/3.322(lg x 2 lg x1)n n =17.3第33页/共134页第三十三页，共134页。影响影响影响影响(y(y ngxingxi ng)ng)指数期微生物代时的因素指数期微生物代时的因素指数期微生物代时的因素指数期微生物代时的因素 菌种菌种 营养成分营养成分 营养物浓度营养物浓度 培养培养(piy(piy ng)ng)温度温度 凡处于较低浓度范围内可影响(yngxing)生长速率和菌体产量的某营养物称为生长因子。第34页/共134页第三十四页，共134页。n n大肠杆菌(d chn n jn)：12.5-17minn n枯草芽孢杆菌：26-32minn n嗜热乳杆菌：66-

21、87minn n结核分枝杆菌：792-932minn n梅毒密螺旋体：1980min第35页/共134页第三十五页，共134页。大肠杆菌：牛奶 12.5min 肉汤 17min产气肠杆菌：肉汤或牛奶 16-18min 组合 29-44min乳酸(r sun)链球菌：牛奶 26min 乳糖肉汤 48min第36页/共134页第三十六页，共134页。对数生长期的细菌个体形态、化学组成对数生长期的细菌个体形态、化学组成(zchn)和生理和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料，也是增殖噬菌体的最适宿研究

22、微生物基本代谢的良好材料，也是增殖噬菌体的最适宿主。主。对数生长期的细菌常在生产上用作种子，使微生物发酵对数生长期的细菌常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。的迟缓期缩短，提高经济效益。第37页/共134页第三十七页，共134页。（三）稳定期（三）稳定期（stationaryphasestationaryphasestationaryphasestationaryphase）n n特点特点n n生长速率生长速率(sl)常数常数R等于等于0n n菌体产量达到了最高点菌体产量达到了最高点 n n菌体产量与营养物质的消耗间菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例呈现出一定的比

23、例 n n 关系，即，生长产量常数关系，即，生长产量常数Y 又称为恒定又称为恒定(hngdng)期或者最高生长期。期或者最高生长期。第38页/共134页第三十八页，共134页。稳定期到来稳定期到来稳定期到来稳定期到来(doli)(doli)的原因的原因的原因的原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，例如营养物的比例失调，例如营养物的比例失调，例如营养物的比例失调，例如C C C CN N N N比值不合适比值不合适比值不合适比值不合适(hsh)(hsh)(hsh)(hsh)等；等；等

24、；等；酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或H2O2H2O2H2O2H2O2等有害代谢产物的累积；等有害代谢产物的累积；等有害代谢产物的累积；等有害代谢产物的累积；pHpHpHpH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。第39页/共134页第三十九页，共134页。稳定期的细胞稳定期的细胞稳定期的细胞稳定期的细胞(xbo)(xbo)行为行为行为行为细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；细胞

25、开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数多数多数多数(dush)(dush)(dush)(dush)芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物；是乳酸等发酵生产的最佳收获期。是乳酸等发酵生产的最佳收获期。是乳酸等发酵生产的最佳收获期。是乳酸等发酵生产的最佳收获期。第40页/共134页第四十页，共134页。获得更多的菌体物

26、质获得更多的菌体物质(wzh)或代谢产物采取或代谢产物采取措施：措施：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气(tng q)、搅拌或振荡等。第41页/共134页第四十一页，共134页。（四）衰亡（四）衰亡（四）衰亡（四）衰亡(shuiwng)(shuiwng)(shuiwng)(shuiwng)期（期（期（期（declinephasedeclinephasedeclinephasedeclinephase或或或或deathphasedeathphasedeathphasedeathphase）n n 个体死亡的速度超过新生的速度，因此，整个群体就呈现出负生长（R为负值）n

27、n现象：n n 细菌代谢(dixi)活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。第42页/共134页第四十二页，共134页。特点：特点：细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态；退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶（autolysis）；）；有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物；素等次生代谢产物

28、；在芽孢杆菌在芽孢杆菌(gnjn)中，芽孢释放往往也发生在中，芽孢释放往往也发生在这一时期这一时期第43页/共134页第四十三页，共134页。三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养 连续培养：又称开放连续培养：又称开放(kifng)培养，当微生物以单批培养，当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养

29、物。于是容器内的培养物就可达到动态平断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，就形成了连续生长。态和衡定的生长速率上，就形成了连续生长。第44页/共134页第四十四页，共134页。连续培养器连续培养器连续培养器连续培养器 连续培养的基本连续培养的基本(jbn)原则：原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。以同样的速率移出培养物。第45页/共134页第四十五页，共134页。恒浊器（恒浊器（恒浊器（恒浊器（turbido

30、statturbidostatturbidostatturbidostat）n n 控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器，可达到恒密度的目的，使微生物在最高生长速率(sl)下生长。n n 为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。n n 第46页/共134页第四十六页，共134页。通过连通过连续培养续培养装置中装置中的光电的光电系统控系统控制培养制培养液中菌液中菌体浓度体浓度(nngd(nngd)恒定、恒定、使细菌使细菌生长连生长连续进行续进行的一种的一种培养方培养方式。式。用于菌用于菌体以及体以及与菌体与菌体生长平生长

31、平行行(pngxng)的的代谢产代谢产物生产物生产的发酵的发酵工业工业第47页/共134页第四十七页，共134页。恒化器（恒化器（恒化器（恒化器（chemostatchemostatchemostatchemostat）n n 一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置,又又称为恒组成连续培养。称为恒组成连续培养。n n 通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子，控制生长速率；

32、子，控制生长速率；n n 可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量体产量(ch(ch nling)nling)，却能保持稳定菌体密度的菌体。，却能保持稳定菌体密度的菌体。第48页/共134页第四十八页，共134页。n n 生长速率的控制生长速率的控制(kngzh)(kngzh)因子：一般是氨因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。源或者是无机盐，生长因子等物质。n n恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作：恒化器连续培养通常用于微生物

33、学的研究工作：n n从遗传学角度，允许作长时间的细菌培养而从中分从遗传学角度，允许作长时间的细菌培养而从中分离不同的变种；离不同的变种；n n从生理学角度，能观察细菌在不同生活条件下的变从生理学角度，能观察细菌在不同生活条件下的变化；化；n n从生态学角度，也是研究自然条件下微生物生态体从生态学角度，也是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实验模型。系比较理想的实验模型。第49页/共134页第四十九页，共134页。恒化器与恒浊器的比较恒化器与恒浊器的比较恒化器与恒浊器的比较恒化器与恒浊器的比较(b(b jio)jio)第50页/共134页第五十页，共134页。单级连续培养器单级连续培养器单级

34、连续培养器单级连续培养器n n 如果某微生物代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平行，就可以采用(ciyng)单级恒浊器来进行研究或生产。多级连续培养多级连续培养 如果要生产的恰恰是与菌体生长不平行的那些发酵产物，例如丙酮、丁醇等时，就应根据两者的产生规律(gul)，设计与其相适应的多级连续培养装置（各级间相互串联）。第51页/共134页第五十一页，共134页。n n例：丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇发例：丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇发酵酵n n菌体生长期：菌体生长期：37，时间较短，时间较短，只要产菌体；只要产菌体；n n产物合成期：产物合成期：33，时间较长，时间较长，只要产溶剂只要产溶剂 丙酮、丁醇；丙

35、酮、丁醇；n n两级连续发酵罐：两级连续发酵罐：n n第一级：第一级：37，pH4.3，培养液，培养液稀释稀释(xsh)率率0.125/h;n n第二级：第二级：33，pH4.3，培养液，培养液稀释稀释(xsh)率率0.04/hn n 两级串联两级串联第52页/共134页第五十二页，共134页。连续发酵的优点连续发酵的优点连续发酵的优点连续发酵的优点(yudi(yudi n)n)n n高效，它简化了装料、灭菌高效，它简化了装料、灭菌高效，它简化了装料、灭菌高效，它简化了装料、灭菌(mi jn)(mi jn)(mi jn)(mi jn)、出料、清洗发酵罐等许多、出料、清洗发酵罐等许多、出料、清洗

36、发酵罐等许多、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；n n自控，便于利用各种仪表进行自动控制；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；n n产品质量较稳定；产品质量较稳定；产品质量较稳定；产品质量较稳定；n n节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合节约了大量动力

37、、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。理。理。理。第53页/共134页第五十三页，共134页。连续培养的缺点连续培养的缺点连续培养的缺点连续培养的缺点(qudi(qudi n)n)最主要的是菌种容易退化；其次是易遭杂菌污染(wrn)；营养物利用率一般低与单批培养。第54页/共134页第五十四页，共134页。四、微生物的高密度培养四、微生物的高密度培养四、微生物的高密度培养四、微生物的高密度培养(piy(piy ng)ng)n n 有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体(qnt)密度超过常规培养10倍以上时的生长

38、状态或培养技术。n n方法：n n选取最佳培养基成分和各成分含量；n n补料；n n提高溶氧量的浓度；n n防止有害代谢产物的生成。第55页/共134页第五十五页，共134页。第三节影响微生物生长第三节影响微生物生长(shngzhng)的主要因素的主要因素影响影响(yngxing)因素：因素：氧 温 度 PH 值第56页/共134页第五十六页，共134页。（一）温度（一）温度（一）温度（一）温度(wnd)(wnd)n n生长温度生长温度生长温度生长温度(wnd)(wnd)(wnd)(wnd)的三基点的三基点的三基点的三基点 n n 最低生长温度最低生长温度最低生长温度最低生长温度(wnd)(w

39、nd)(wnd)(wnd)、最适生长温度、最适生长温度、最适生长温度、最适生长温度(wnd)(wnd)(wnd)(wnd)和最高生长温度和最高生长温度和最高生长温度和最高生长温度(wnd)(wnd)(wnd)(wnd)温度对微生物生长的影响是通过影响微生物细胞内的生物化学反应(huxu fnyng)而实现。第57页/共134页第五十七页，共134页。n n“最适生长温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。n n最适生长温度不一定(ydng)是一切代谢活动的最适温度。n n例：乳酸链球菌n n 34 繁殖速度最快n n 25-30 细胞产量最高n n 40 发酵速度最快n n

40、 30 乳酸产量最高第58页/共134页第五十八页，共134页。n n青霉素的变温培养青霉素的变温培养(piyng)：n n 30 25 20 25 n n0h 5h 40h 125h 165hn n致死温度致死温度第59页/共134页第五十九页，共134页。n n低温(dwn)微生物：嗜冷微生物n n 专性嗜冷微生物 15 n n 兼性嗜冷微生物 20 n n中温微生物：20-40 n n 室温性微生物 20-25 n n 体温性微生物 35-40 n n高温型微生物：嗜热微生物 n n 45-50 第60页/共134页第六十页，共134页。l l专性好氧菌：需专性好氧菌：需专性好氧菌：需专

41、性好氧菌：需O2O2O2O2（20%20%20%20%），呼吸链，受体），呼吸链，受体），呼吸链，受体），呼吸链，受体O2O2O2O2，有，有，有，有SODSODSODSODl l 和过氧化氢酶；绝大多数微生物属于和过氧化氢酶；绝大多数微生物属于和过氧化氢酶；绝大多数微生物属于和过氧化氢酶；绝大多数微生物属于(shy)(shy)(shy)(shy)此类；此类；此类；此类；l l兼性厌氧菌兼性厌氧菌兼性厌氧菌兼性厌氧菌 ：需：需：需：需O2O2O2O2，呼吸链，呼吸，呼吸链，呼吸，呼吸链，呼吸，呼吸链，呼吸，SODSODSODSOD和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；l l

42、无无无无O2O2O2O2，发酵或无氧呼吸；，发酵或无氧呼吸；，发酵或无氧呼吸；，发酵或无氧呼吸；l l微好氧菌：低微好氧菌：低微好氧菌：低微好氧菌：低O2 O2 O2 O2（2 2 2 2-1O-1O-1O-1O），呼吸链，受体，呼吸链，受体，呼吸链，受体，呼吸链，受体O2O2O2O2，有，有，有，有l l SOD SOD SOD SOD和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；l l耐氧菌：不需耐氧菌：不需耐氧菌：不需耐氧菌：不需O2 O2 O2 O2（2 2 2 2 ），无呼吸链，发酵，有，无呼吸链，发酵，有，无呼吸链，发酵，有，无呼吸链，发酵，有SODSODSODSODl

43、l 和过氧化物酶；和过氧化物酶；和过氧化物酶；和过氧化物酶；l l厌氧菌：厌厌氧菌：厌厌氧菌：厌厌氧菌：厌O2O2O2O2，无，无，无，无O2O2O2O2产能，无产能，无产能，无产能，无SODSODSODSOD和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。l l （二）氧气（二）氧气(yngq)第61页/共134页第六十一页，共134页。第62页/共134页第六十二页，共134页。自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外(ywi)的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物

44、歧化酶，可催化起氧化基化合物分解，最终分解成水。对于好氧微生物虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，氧对一切生物都会使其产生有毒害(dhi)作用的代谢产物，如超氧基化合物与H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基OH.。第63页/共134页第六十三页，共134页。厌氧菌的氧毒害厌氧菌的氧毒害厌氧菌的氧毒害厌氧菌的氧毒害(dhi)(dhi)机制机制机制机制 n n 1971 1971年年McCordMcCord和和FridovichFridovich提出提出SODSOD的学说的学说n n 他们认为，厌氧菌因缺乏他们认为，厌氧菌因缺乏SODSOD，故易

45、被生物，故易被生物体内产生体内产生(chnshng)(chnshng)的超氧阴离子自由基（的超氧阴离子自由基（O2-O2-.）毒害致死。）毒害致死。第64页/共134页第六十四页，共134页。(三三)、PHPHl引起膜电荷的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收；l影响代谢(dixi)过程中酶的活性；l改变生长环境中营养物质的可给性和有害物质的毒性。第65页/共134页第六十五页，共134页。微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适反应，而酶促反应都有一个最适pH范围，在此范围内只要条范围，在此范围内只要条件适合

46、，酶促反应速率件适合，酶促反应速率(sl)最高，微生物生长速率最高，微生物生长速率(sl)最最大，因此微生物生长也有一个最适生长的大，因此微生物生长也有一个最适生长的pH范围。范围。微生物微生物最低最低PH最适最适PH最高最高PH细菌细菌3-56.5-7.58-10酵母菌酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌霉菌1-34.5-5.57-8第66页/共134页第六十六页，共134页。n n 微生物作为一个总体来说，其生长微生物作为一个总体来说，其生长(shngzhng)(shngzhng)的的pHpH范围范围极广，绝大多数种类都生长极广，绝大多数种类都生长(shngzhng)(shngzhng)在

47、在pH5pH59 9之间。之间。n n 嗜碱微生物嗜碱微生物n n 耐碱微生物耐碱微生物n n 嗜酸微生物嗜酸微生物n n 耐酸微生物耐酸微生物 第67页/共134页第六十七页，共134页。n n 同一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程中，也有不同的最适pH要求。n n例1：黑曲霉发酵蔗糖n n pH 2-3 柠檬酸为主 少量草酸n n pH 7 草酸为主 少量柠檬酸n n例2：酵母菌乙醇发酵n n pH 4.5-5.0 乙醇 无甘油(n yu)和醋酸n n pH 8 乙醇，甘油(n yu)和醋酸第68页/共134页第六十八页，共134页。微生物内环境中的pH相当稳定，一般都接近中

48、性(zhngxng)。这样，就免除了DNA、ATP和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏。第69页/共134页第六十九页，共134页。微生物对外界微生物对外界微生物对外界微生物对外界(wiji)(wiji)(wiji)(wiji)环境环境环境环境pHpHpHpH的改变的改变的改变的改变第70页/共134页第七十页，共134页。调节调节调节调节(tioji)pH(tioji)pH(tioji)pH(tioji)pH的方法的方法的方法的方法 第71页/共134页第七十一页，共134页。第四节第四节 微生物培养微生物培养(piyng)(piyng)法概论法概论n n良好的微生物培养装

49、置的基本条件：良好的微生物培养装置的基本条件：n n 按照微生物的生长规律进行科学的设按照微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证上，保证(bozhng)微生物获得适宜的温微生物获得适宜的温度和良好的通气等物化条件和防止杂菌污度和良好的通气等物化条件和防止杂菌污染等。染等。第72页/共134页第七十二页，共134页。从少量培养发展到大规模培养；从浅层培养发展到厚层（固体）或深层（液体）培养；从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从静止式液体培养发展到通气搅拌(jiobn)式的液体培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连

50、续培养；从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动、植物细胞；从单菌发酵发展到混菌发酵；从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”，等等。微生物培养技术(jsh)的发展第73页/共134页第七十三页，共134页。实验室培养实验室培养实验室培养实验室培养(piy(piy ng)ng)法法法法 n n（一）固体培养 n n1好氧菌：试管斜面、培养皿平板及较大型的克氏扁平、茄子(qi zi)瓶等的平板培养方法。n n 2厌氧菌：n n （1）高层琼脂柱 n n （2）Hungate滚管技术 n n （3）厌氧培养皿 n n （4）厌氧罐 n n （