引物设计的一般原则学习教案.pptx

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1、会计学1引物设计引物设计(shj)的一般原则的一般原则第一页，共16页。引物设计的一般引物设计的一般(ybn)原则原则1.1.1.1.引物长度引物长度引物长度引物长度 7.7.发卡结构发卡结构发卡结构发卡结构2.2.2.GC%8.2.GC%8.二聚体二聚体二聚体二聚体3.3.3.Tm3.Tm值值值值 9.9.错配错配错配错配4.4.4.34.3端碱基要求端碱基要求端碱基要求端碱基要求 10.10.交叉二聚体交叉二聚体交叉二聚体交叉二聚体5.5.5.55.5端碱基要求端碱基要求端碱基要求端碱基要求 11.11.产物产物产物产物(ch(ch nw)nw)长度长度长度长度6.6.6.G 6.G 值值

2、值值 12.12.评分评分评分评分第1页/共16页第二页，共16页。引物长度引物长度(chngd)n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp，常用的是，常用的是18-24 bp18-24 bp，但不应大于，但不应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp16bp是必是必要的（不容易引起错配）。要的（不容易引起错配）。n n例如：一个长度为例如：一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存在的引物在人类基因组上存在200200个潜在的退火个潜在的退火位点位点(3 x 109/41

3、2=200).(3 x 109/412=200).而一个长度为而一个长度为20bp20bp的引物在人基因组上存在的引物在人基因组上存在的退火位点只有的退火位点只有1/4001/400个个.n n较长的引物（较长的引物（28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板一般是用来区分同源性较高的模板(mb(mb n)n)序列或者使用于产生一些序列或者使用于产生一些突变位点突变位点第2页/共16页第三页，共16页。GC%n n引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发(yn f)反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。第3页/共16页第四页，共16页。Tm值值

4、n nTm DNATm DNA溶解温度，即溶解温度，即DNADNA的双链失去一半时的温度。的双链失去一半时的温度。n nTm Tm 值计算的经验值计算的经验(jngyn)(jngyn)公式公式n nTm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T)n n退火温度一般低于退火温度一般低于TmTm，退火温度越高，特异性越高，但杂交率越低。，退火温度越高，特异性越高，但杂交率越低。PCRPCR退退火温度一般是火温度一般是5555，变性温度，变性温度9494，Tm Tm一般在一般在58-7058-70 之间比较合适。之间比较合适。n n两个引物之间的两个引物之间的TmTm值应尽可能接近，

5、不应超过值应尽可能接近，不应超过44第4页/共16页第五页，共16页。3端碱基要求端碱基要求(yoqi)n n引物引物3 3端的末位碱基对端的末位碱基对Taq Taq 酶的酶的DNA DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为位碱基为A A 的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3 3 个碱基，因此应当避免在引物的个碱基，因此应当避免在引物的3 3端使用碱基端使用碱基A A。n n引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3 3端相似性较

6、高的序列，否则容易导致错配。引物端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3 3端出现端出现3 3 个以上个以上(y(y shng)shng)的连续碱基，如的连续碱基，如GGG GGG 或或CCCCCC，也会使错误引发机率增加，也会使错误引发机率增加 第5页/共16页第六页，共16页。3端碱基要求端碱基要求(yoqi)第6页/共16页第七页，共16页。5端碱基要求端碱基要求(yoqi)n n5端序列(xli)对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。第7页/共16页第八页，共16页。G 值值n nG G 值是指值是指DNA DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对

7、的相对稳定性。应当选用双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3 3端端G G 值较低值较低（绝对值不超过（绝对值不超过9 9），而），而5 5端和中间端和中间G G 值相对较高的引物。引物的值相对较高的引物。引物的3 3端的端的G G 值过高，容易在错配位点形成双链结构值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发并引发(y(y n f)DNA n f)DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）聚合反应。（能值越高越容易结合）n nGG高于高于4.54.5时易引发时易引发(y(y n f)n f)产生引物二聚体和发夹结构产生引物二聚体和发夹结构第8页/共16页第九页，

8、共16页。发卡发卡(f k)结构结构n nHairpin n n一条一条(y tio)引物自身碱基之间发生配对引物自身碱基之间发生配对第9页/共16页第十页，共16页。二聚体二聚体n nDimer Dimer n n 同一条引物的两条连之间发生碱基互补同一条引物的两条连之间发生碱基互补(h b(h b)配对配对第10页/共16页第十一页，共16页。错配错配n nFals priming Fals priming n n引物与模板的发生配对的位置不止一个。尽管只有某一处可以引物与模板的发生配对的位置不止一个。尽管只有某一处可以(ky(ky)与引物完全配对吻合，但是其它位置也可与引物之间发生不与引

9、物完全配对吻合，但是其它位置也可与引物之间发生不完全配对，影响延伸。完全配对，影响延伸。第11页/共16页第十二页，共16页。交叉交叉(jioch)二聚体二聚体n nCross dimer n n两条引物之间发生(fshng)碱基配对第12页/共16页第十三页，共16页。产物产物(chnw)长度长度n nProduct n n根据自己需要决定(judng)，但应尽可能长，这样有利于保持其特异性。第13页/共16页第十四页，共16页。评分评分(png fn)n nRating n n单链评分(png fn)n n双链综合评分(png fn)第14页/共16页第十五页，共16页。谢谢(xi xie)各位！第15页/共16页第十六页，共16页。