核酸探针描述学习教案.pptx

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1、会计学1核酸探针核酸探针(tn zhn)描述描述第一页，共59页。2 核酸分子核酸分子(fnz)杂交（杂交（nucleic acid hybridization）指具有互补序列的两条核酸单链在一指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。程。不同来源的不同来源的DNA或或RNA单链在一定条单链在一定条件下重新组成的新的双链分子件下重新组成的新的双链分子(fnz)杂交分子杂交分子(fnz)。第1页/共58页第二页，共59页。3第一节第一节 核酸探针杂交核酸探针杂交(zjio)的基本理论的基本理论一、变性与复性一、变性与复性 第2页/共5

2、8页第三页，共59页。4 DNA的变性的变性(binxng)(denaturation)：在某些理化因素(yn s)作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。第3页/共58页第四页，共59页。5第4页/共58页第五页，共59页。6解链温度解链温度(wnd)（融解温度（融解温度(wnd)，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA发生(fshng)变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。第5页/共58页第六页，共59页。7第6页/共58页第七页，共59页。8增色效应：增色效

3、应：DNA变性变性(binxng)后对后对260nm紫外光收紫外光收增加的现象。增加的现象。第7页/共58页第八页，共59页。9DNA的复性的复性(f xn)（renaturation)：在适当条件下，变性在适当条件下，变性在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可再恢复的两条互补链可再恢复的两条互补链可再恢复的两条互补链可再恢复(huf)(huf)成天然的双螺旋结构的过程。成天然的双螺旋结构的过程。成天然的双螺旋结构的过程。成天然的双螺旋结构的过程。热变性热变性(binxng)的的DNA经缓慢冷却后即可复经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火性，此过程称为退火(anneal

4、ing)。第8页/共58页第九页，共59页。10第9页/共58页第十页，共59页。11减色效应：减色效应：变性变性DNA复性复性后对后对260nm紫紫外光吸收外光吸收(xshu)减少减少的现象。的现象。第10页/共58页第十一页，共59页。121.常用常用(chn yn)的变性方法：的变性方法：热变性热变性(binxng)酸碱变性酸碱变性(binxng)化学试剂变性化学试剂变性 第11页/共58页第十二页，共59页。132.影响影响(yngxing)复性的因素复性的因素 序序列列简简单单的的分分子子(fnz)复复性性快快，如如poly(dT)和和poly(dA)识别快识别快 DNA片段愈大，扩

5、散速度愈低，复性慢片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 离子强度离子强度有利于复性有利于复性 DNA浓度浓度复性复性 Tm值的估算值的估算(sun)20bp Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺（甲酰胺%）第12页/共58页第十三页，共59页。14n n核酸核酸(h sun)杂交：不同来源的两条核杂交：不同来源的两条核酸酸(h sun)单链由于具有互补序列，在单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。分子。+第13页/共58页第十四页，共59页。15第14页/共5

6、8页第十五页，共59页。16第15页/共58页第十六页，共59页。17二、影响杂交二、影响杂交(zjio)的因素的因素 1.核酸分子核酸分子(fnz)的浓度和长度的浓度和长度 2.温度温度(wnd)：比：比Tm低低2530较适宜较适宜3.离子强度：离子强度离子强度：离子强度杂交反应率杂交反应率 第16页/共58页第十七页，共59页。18 4.杂交杂交(zjio)液中的甲酰胺液中的甲酰胺 甲酰胺能降低核酸杂交甲酰胺能降低核酸杂交(zjio)的的Tm，含含30%50%甲酰胺的杂交甲酰胺的杂交(zjio)溶溶液温度能降低到液温度能降低到3042。使用甲酰胺的优点：使用甲酰胺的优点：低温下探针低温下探

7、针(tn zhn)更稳定；更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。能更好地保留非共价结合的核酸。第17页/共58页第十八页，共59页。19注注意意(zh y)：待测核酸顺序与探针待测核酸顺序与探针(tn zhn)顺序顺序同源性高的杂交，用水溶液时取同源性高的杂交，用水溶液时取68，用，用50%甲酰胺溶液时取甲酰胺溶液时取40。待测核酸顺序待测核酸顺序(shnx)与探针同源性与探针同源性不高时，以不高时，以50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3540杂交。杂交。第18页/共58页第十九页，共59页。205.核酸分子的复杂性直接影响核酸分子的复杂性直接影响(yngxing)复性复性几率。几率。6.非特异性

8、杂交反应：在杂交前将非特异非特异性杂交反应：在杂交前将非特异性位点进行封闭，以减少性位点进行封闭，以减少(jinsho)对探针对探针的非特异性吸附作用。的非特异性吸附作用。常用常用(chn yn)封闭物：封闭物：变性非特异变性非特异DNA：鲑鱼精子：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺小牛胸腺DNA 高分子化合物：高分子化合物：Denhardt溶液溶液 脱脂奶粉脱脂奶粉 第19页/共58页第二十页，共59页。21第二节第二节 核酸核酸(h sun)探针探针 一、探针的选择一、探针的选择(xunz)原则原则 1.高度高度(god)的特异性的特异性 2.制备探针的难易性和检测手段的灵敏法制备探针的难易性和检测

9、手段的灵敏法 二、探针的种类二、探针的种类 第20页/共58页第二十一页，共59页。221.1.基因组基因组基因组基因组DNADNA探针探针探针探针(tn zhn)(tn zhn)从从从从 基基基基 因因因因(jyn)(jyn)组组组组 DNADNA文文文文 库库库库 中中中中 选选选选 取取取取 某某某某 一一一一 基基基基 因因因因(jyn)(jyn)片段片段片段片段 与载体与载体(zit)连接（质粒、噬菌体）连接（质粒、噬菌体）克隆克隆(PCR扩增扩增)酶切酶切优点：优点：无性繁殖、制备方法简单；无性繁殖、制备方法简单；不易降解不易降解（与（与RNA比较）；比较）；标记方法成熟。标记方法

10、成熟。第21页/共58页第二十二页，共59页。232.cDNA2.cDNA探针探针探针探针(tn zhn)(tn zhn)（complementary DNAcomplementary DNA）S1核酸酶切平两端核酸酶切平两端(lin dun)优点：优点：不含内含子及高度不含内含子及高度重复序列但不易重复序列但不易(b y)获得获得 载体连接载体连接克隆克隆通过逆转录通过逆转录双链双链cDNA加接头加接头限制酶限制酶 粘性末端粘性末端第22页/共58页第二十三页，共59页。243.RNA探针探针(tn zhn)：检测：检测DNA和和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性优点：杂交效率高

11、，稳定性高，非特异性 杂交较少杂交较少,未杂交探针可用未杂交探针可用RNase 降解降解(jin ji)，减少本底的干扰。，减少本底的干扰。缺点：易降解，标记方法缺点：易降解，标记方法(fngf)复杂复杂 第23页/共58页第二十四页，共59页。254.寡核苷酸探针寡核苷酸探针(tn zhn)优点：优点：可根据需要合成相应序列；可根据需要合成相应序列；探针短探针短,序列复杂性低序列复杂性低,分子量小，分子量小，因此杂交时间短因此杂交时间短;长长 度只有度只有1050bp，该识别序，该识别序列内列内1个碱基的变化可明显降低杂个碱基的变化可明显降低杂交交Tm值。值。可大量合成，价格低，能够用酶可大

12、量合成，价格低，能够用酶学或学或 化学方法进行化学方法进行(jnxng)非放射性标记。非放射性标记。第24页/共58页第二十五页，共59页。26三、探针设计三、探针设计三、探针设计三、探针设计(shj)(shj)原则：原则：原则：原则：长度长度长度长度(chngd)(chngd)：1050bp 1050bp 碱基成分碱基成分(chng fn):G+C含量为含量为40%60%探针分子内无互补序列。探针分子内无互补序列。避免同一碱基重复出现。避免同一碱基重复出现。一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序一旦选定某一序列后，尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较，与非靶区域的同源性不应超过列进行同

13、源性比较，与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续或有连续8个或更多的碱基同源。个或更多的碱基同源。第25页/共58页第二十六页，共59页。27四、探针标记四、探针标记(bioj)物的选择物的选择 理想理想(lxing)的标记物：的标记物：具有具有(jyu)高度的灵敏性高度的灵敏性与探针结合后，不影响杂交及探针的主与探针结合后，不影响杂交及探针的主要理化特性要理化特性检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，检测方法高灵敏性、高特异性，假阳性率低，环境污染少，价格低廉；环境污染少，价格低廉；若用酶促方法标记，应对若用酶促方法标记，应对Km影响不大影响不大第26页/共58页第二十七页，共59页。2

14、8（一）常用（一）常用(chn yn)的放射的放射性标记物性标记物 1.1.常用常用(chn yn)探记探针的同位探记探针的同位素：素：2.2.32P、3H、35S、14C、125I、131I第27页/共58页第二十八页，共59页。292.特性特性(txng)：检测特异性强；检测特异性强；灵敏度高；灵敏度高；对酶促反应对酶促反应(fnyng)无任何影响，也不影无任何影响，也不影响碱基配对的特异性和稳定性；响碱基配对的特异性和稳定性；易造成易造成(zo chn)放射性污染；放射性污染；半衰期短的同位素应用受到限制，随用半衰期短的同位素应用受到限制，随用随标记，立即使用，不能长时间存放。随标记，立

15、即使用，不能长时间存放。第28页/共58页第二十九页，共59页。303.探针标记探针标记(bioj)的方法的方法 缺缺 口口(quku)平平 移移 法法（nick translation）实实质质：用用-32PdNTP取取代代原原来来DNA链链中中不不带带同同位位素素的的同同种种核核苷苷酸酸，生生成成的的两两条链均被同位素标记。条链均被同位素标记。第29页/共58页第三十页，共59页。31第30页/共58页第三十一页，共59页。32随机引物法（随机引物法（random priming）人工合成人工合成(rn n h chn)的的68个核苷个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物，它们可酸长的各种不

16、同排列顺序的混合物，它们可以随机地互补到以随机地互补到DNA探针的某一处，作为探针的某一处，作为引物，在引物，在Klenow片段作用下，合成与探针片段作用下，合成与探针DNA互补的互补的DNA链，当在反应液中加入链，当在反应液中加入-32PdATP时，即可形成放射性同位素标记时，即可形成放射性同位素标记的的DNA探针，但探针探针，但探针DNA序列是长短不等序列是长短不等的。的。优点：比活度高，结果优点：比活度高，结果(ji gu)稳定稳定第31页/共58页第三十二页，共59页。33第32页/共58页第三十三页，共59页。34用用T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记(bioj)DNA5末端末端

17、5-pCpGpApCpG-3 碱性碱性(jin xn)磷酸酶磷酸酶(AKP）5-HOCpGpApCpG-3-32PATPT4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶(jmi)（PNK）5-32PCpGpApCpG-3 第33页/共58页第三十四页，共59页。35KlenowKlenow片段片段片段片段(pin dun)(pin dun)快速标记快速标记快速标记快速标记DNADNA探针末端探针末端探针末端探针末端 用枯草杆菌蛋白酶切割用枯草杆菌蛋白酶切割(qig)(qig)可得两条多肽链可得两条多肽链 N C53外切(wi qi)酶 35外切酶 53聚合酶 小片段(36000)Klenow片段（67

18、000）3CTTAAG55GAATTC3EcoR 5G AATTC3 3CTTAA G5 Klenow,dNTP,-32PdATP 5GAATT AATTC3 3CTTAA TTAAG5 第34页/共58页第三十五页，共59页。36（二）常用（二）常用（二）常用（二）常用(chn(chn yn yn)的非放射性的非放射性的非放射性的非放射性标记标记标记标记 优点优点优点优点(yudi(yudi n)n)：无环境污染，可较长时间贮存：无环境污染，可较长时间贮存：无环境污染，可较长时间贮存：无环境污染，可较长时间贮存方法方法(fngf)：1.酶标记酶标记法法 2.化学标记法化学标记法要求：标记物应

19、具有耐热、对组织细胞无特异亲和要求：标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不性、分子量小，对探针杂交无影响或影响甚小，不影响影响DNA三维空间构象的形成。三维空间构象的形成。常用的标记物：生物素（常用的标记物：生物素（biotin）、地高辛）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、补骨）、补骨脂素、脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）第35页/共58页第三十六页，共59页。371.生物素标记生物素标记(bioj)核酸探针核酸探针Bio-lldUTP、Bio-7dA

20、TP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。等。2.地高辛（地高辛（Dig）标记核酸）标记核酸(h sun)探针探针第36页/共58页第三十七页，共59页。38第37页/共58页第三十八页，共59页。39第38页/共58页第三十九页，共59页。40第39页/共58页第四十页，共59页。41第40页/共58页第四十一页，共59页。42第41页/共58页第四十二页，共59页。43第三节第三节 核酸分子杂交核酸分子杂交(zjio)技技术术 一、类型：根据反应环境一、类型：根据反应环境(hunjng)分为分为1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定

21、在固体支持物上，另一条核酸在固体支持物上，另一条核酸 链游离链游离(yul)在液体中。在液体中。2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游液相杂交：参与反应的两条核酸链都游 离在液体中。离在液体中。第42页/共58页第四十三页，共59页。44二、固体二、固体(gt)支持物种类支持物种类硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等。孔板等。选择选择(xunz)原则：原则：具有较强的结合核酸具有较强的结合核酸(h sun)的能力；的能力；与核酸与核酸(h sun)的结合比较稳定的结合比较稳定 尽量少的非特异性吸附尽量少的非特异性吸附第43页/共58页第四十四页

22、，共59页。45三、常用三、常用(chn yn)固相固相杂交类型杂交类型Southern印迹印迹(yn j)杂交、杂交、Northern印迹印迹(yn j)杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。第44页/共58页第四十五页，共59页。461.Southern 印迹杂交印迹杂交主要主要(zhyo)步骤：步骤：第45页/共58页第四十六页，共59页。47纯化纯化(chn hu)的待测的待测DNA样品样品 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离(fnl)酶切酶切DNA片段片段 凝胶上凝胶上DNA变性变性(binx

23、ng)中和中和 DNA转印至转印至NC膜膜 预杂交预杂交 限制性内切酶酶切后（限制性内切酶酶切后（EDTA，65灭活限制酶）灭活限制酶）变性液（碱变性）变性液（碱变性）Tris缓冲液缓冲液 高盐下高盐下 烘干、固定烘干、固定 杂交杂交 放射自显影放射自显影 结果分析结果分析 第46页/共58页第四十七页，共59页。48第47页/共58页第四十八页，共59页。49southern印迹印迹(yn j)载体载体(zit)凝胶凝胶吸水纸吸水纸缓冲液缓冲液滤纸滤纸(lzh)固定到载体固定到载体第48页/共58页第四十九页，共59页。502.Northern印迹(yn j)杂交 是一种将RNA从琼脂糖凝胶

24、中转印到NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质印迹(yn j)技术则被称为Western blotting。3.斑点杂交（dot blot）(线状圆形)第49页/共58页第五十页，共59页。514.原位杂交（原位杂交（in situ hybridization）直接用探针与细胞或组织切片中的核直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。酸杂交。应用：应用：1）观察基因在组织中的表达）观察基因在组织中的表达 2）确定）确定(qudng)基因在染色体中基因在染色体中的定位的定位第50页/共58页第五十一页，共59页。525.菌落(jnlu)原位杂交（colony situ hybridization）将

25、细菌从平板(pngbn)转移到NC膜上 裂解(li ji)细菌释出DNA 烘干 杂交 第51页/共58页第五十二页，共59页。53四、核酸杂交的应用四、核酸杂交的应用 在医学研究与实践中，核酸杂交主要用在医学研究与实践中，核酸杂交主要用于基因诊断。于基因诊断。1、遗传病的诊断：例：、遗传病的诊断：例：-地中海性贫血地中海性贫血 的检验的检验 2、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速、病原体的鉴定：例：结合杆菌的快速(kui s)鉴定鉴定3、癌基因点突变分析、癌基因点突变分析4、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定及亲子鉴定第52页/共58页第五十三页，共

26、59页。54蛋白蛋白(dnbi)杂交杂交一、蛋白质的免疫印迹（一、蛋白质的免疫印迹（western)场所：硝酸纤维素膜场所：硝酸纤维素膜待检分子：蛋白待检分子：蛋白探针：抗体探针：抗体(kngt)杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转杂交的方式：经电泳分离不同的蛋白，转印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体印到硝酸纤维素膜上，用特定的抗体(kngt)与蛋白杂交，检测特定的蛋白。与蛋白杂交，检测特定的蛋白。第53页/共58页第五十四页，共59页。55二、所用抗体二、所用抗体(kngt)1、一抗：针对待测分子的抗体、一抗：针对待测分子的抗体(kngt)2、二抗：针对一抗的抗体、二抗：针对一抗的抗体(kng

27、t)，标记，标记有放射性同位素或生物素有放射性同位素或生物素第54页/共58页第五十五页，共59页。56三、操作过程三、操作过程蛋白蛋白(dnbi)的的制备制备SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳分离凝胶电泳分离(fnl)不同的蛋白不同的蛋白质质第55页/共58页第五十六页，共59页。57蛋白蛋白(dnbi)印迹印迹封闭封闭(fngb)+阳极阳极(yngj)-阴极阴极多孔垫片多孔垫片滤纸滤纸凝胶凝胶载体载体第56页/共58页第五十七页，共59页。58杂交（一抗与特定蛋白杂交（一抗与特定蛋白(dnbi)结合）结合）漂洗去除漂洗去除(q ch)多余的一抗多余的一抗二抗与一抗结合二抗与一抗结合(jih)漂洗去多余的二漂洗去多余的二抗抗结果检测结果检测第57页/共58页第五十八页，共59页。59感谢您的观看感谢您的观看(gunkn)。第58页/共58页第五十九页，共59页。