杜氏肌营养不良症DMD与遗传学习教案.pptx

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1、会计学1杜氏肌营养不良症杜氏肌营养不良症DMD与遗传与遗传(ychun)第一页，共37页。疾病(jbng)概述第1页/共37页第二页，共37页。Dystrophie musculaire de Duchennen nDMDDMD，杜氏肌营养不良，假肥大型肌营养不良，杜氏肌营养不良，假肥大型肌营养不良n nDystrophineDystrophine（DysDys）抗肌萎缩蛋白抗肌萎缩蛋白(dnbi)(dnbi)缺失缺失n nMaladie monogeniqueMaladie monogeniquen nHtdit:XRHtdit:XRn nDuchenne,un neurologiste f

2、ranais,a donn une description Duchenne,un neurologiste franais,a donn une description complte de 13 maladies attaintscomplte de 13 maladies attaints第2页/共37页第三页，共37页。Phnotype Clinique de la DMDn nLes muscles jumeaux des jambs des garons atteints apparaissent quils Les muscles jumeaux des jambs des ga

3、rons atteints apparaissent quils soient dveloppssoient dveloppsn nMais asthniquesMais asthniquesn n假性肌肥大假性肌肥大(fid)(fid)n nTissu conjonctif et la graisseTissu conjonctif et la graisse第3页/共37页第四页，共37页。Phnotype Clinique de la DMDn n12 ans normal12 ans normaln n3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire

4、3 5 ans dveloppe une faiblesse musculaire n nDs lge de 12 ans confin en chaise roulant Ds lge de 12 ans confin en chaise roulant n nAu-del de lge de 20 ans ne survivraAu-del de lge de 20 ans ne survivran nQI QI 智商智商(zh shn)(zh shn)n n une chute modr denviron 20 points une chute modr denviron 20 poin

5、ts第4页/共37页第五页，共37页。n nLabLabn nCratine kinase(niveau srique)Cratine kinase(niveau srique)血清血清(xuqng)(xuqng)浓度浓度n n 50 100 fois la limite suprieure de la normale 50 100 fois la limite suprieure de la normalen n dans les stades prcoces dans les stades prcoces第5页/共37页第六页，共37页。Dystrophie musculaire de B

6、eckern nle gne de la dystrophie le gne de la dystrophie n nBeaucoup plus attnu Beaucoup plus attnu 缓和缓和 n nAprs lge de 16 ans parvient marcher Aprs lge de 16 ans parvient marcher n n之后之后(zhhu)(zhhu)多年也可行走多年也可行走第6页/共37页第七页，共37页。DMD与BMD的差异(chy)n nDMDDMD致死致死(zh s)(zh s)n nBMDBMD存活率非常高存活率非常高(70%),(70%),

7、易产生易产生 新的突变新的突变第7页/共37页第八页，共37页。遗传(ychun)第8页/共37页第九页，共37页。遗传(ychun)特征n nHtdit:XRHtdit:XR亲代生殖细胞子代XH Xh Y XH XH Xh Y XH XH XH XH Xh Y XH Y Xh 正常女性正常男性女性携带者男性患者第9页/共37页第十页，共37页。遗传(ychun)特征n n（1 1）系谱中常常只有男性）系谱中常常只有男性(nnxng)(nnxng)患者患者n n（2 2）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；）父母都无病时，女儿则不会发病，儿子可能发病；n n（3 3）由于交叉遗传，患者

8、的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者；）由于交叉遗传，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常为本病患者；n n（4 4）由于男性）由于男性(nnxng)(nnxng)患者的子女都正常，故可见隔代遗传；患者的子女都正常，故可见隔代遗传；n n（5 5）女性患者的父亲一定是患者）女性患者的父亲一定是患者,母亲一定是携带者。母亲一定是携带者。第10页/共37页第十一页，共37页。DMD 男女(nnn)差异n n男性致死男性致死n n1/3 nomutation,2/3 mre porteuse1/3 nomutation,2/3 mre porteusen n女性携带者女性携带者 n nMajo

9、rit Majorit 无任何临床表现，无任何临床表现，70%70%肌酸激酶肌酸激酶(Cratine kinase)(Cratine kinase)增高增高n n8%8%轻微轻微(qngwi)(qngwi)的肌肉症状的肌肉症状,有些还有严重的近心端肌肉障碍。有些还有严重的近心端肌肉障碍。n n女性很少患有女性很少患有DMDDMD第11页/共37页第十二页，共37页。母系(mx)镶嵌n n某男性是家族中某男性是家族中DMDDMD的先证者的先证者n n他的母亲没有携带突变基因他的母亲没有携带突变基因n n遗传位点上发生了新近的突变遗传位点上发生了新近的突变n n大约大约5%-15%5%-15%的这

10、些发生的例子的这些发生的例子(l zi)(l zi)是由于母系生殖镶嵌是由于母系生殖镶嵌第12页/共37页第十三页，共37页。DMD 发 病 率 较 高发 病 率 较 高n nGarons nouveau-nsGarons nouveau-ns：1/33001/3300n nUn taux de mutation Un taux de mutation：1/100001/10000n n每天一个男性每每天一个男性每11-1211-12秒会产生秒会产生(chnshng)1(chnshng)1个新突变的精子（个新突变的精子（8 x 107 par 8 x 107 par jourjour）第13页

11、/共37页第十四页，共37页。基因(jyn)与蛋白第14页/共37页第十五页，共37页。Gne DMDn n人类最大的基因之一，人类最大的基因之一，2300 kb2300 kbn n 位于位于XpXpn n占占X X 染色体全长的染色体全长的1.5%1.5%n n99%99%的序列由内含子组成的序列由内含子组成n n编码区包括编码区包括7979个外显子及个外显子及7 7 个组织特异性的启动子个组织特异性的启动子n n其其mRNA mRNA 序列长序列长114 kb114 kbn n主要主要(zhyo)(zhyo)表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织第15页/

12、共37页第十六页，共37页。7 个组织(zzh)特异性的启动子n n,B(,B(脑皮质脑皮质)、M(M(肌组织肌组织)、P(P(蒲肯野纤维蒲肯野纤维)、R(R(视网膜视网膜)、B3(B3(脑组织脑组织)、S S(施旺细胞施旺细胞)和和G(G(肌组织之外的多种组织器官肌组织之外的多种组织器官(qgun)(qgun)n nB B 型：大脑皮层、海马回神经元型：大脑皮层、海马回神经元n nP P型：小脑蒲肯野细胞型：小脑蒲肯野细胞,在骨骼肌也有极少量的表达在骨骼肌也有极少量的表达n nM M 型：骨骼肌、心肌组织型：骨骼肌、心肌组织,同时在脑神经胶质细胞也有少量表达同时在脑神经胶质细胞也有少量表达第

13、16页/共37页第十七页，共37页。Dystrophin 抗肌萎缩蛋白(dnbi)n n全长型全长型dystrophin dystrophin 是一种是一种427 kDa427 kDa的棒状蛋白的棒状蛋白(dnbi),(dnbi),长约长约150 nm,150 nm,分为分为4 4 个区域，个区域，n n氨基端区域氨基端区域n n中央棒状区中央棒状区n n富含半胱氨酸区域富含半胱氨酸区域n n羧基端区域羧基端区域第17页/共37页第十八页，共37页。n nA.A.位于位于Xp21,Xp21,黑色的竖线代表黑色的竖线代表分布于整个基因上的分布于整个基因上的79 79 个外个外显子显子,黑色箭头指

14、示各组织特黑色箭头指示各组织特异性启动子不同的启动位点异性启动子不同的启动位点,分别以不同的字母缩写来代表分别以不同的字母缩写来代表,B,B(脑皮质脑皮质)、M(M(肌组织肌组织)、P(P(蒲肯野纤维蒲肯野纤维(xinwi)(xinwi)、R(R(视视网膜网膜)、B3(B3(脑组织脑组织)、S(S(施旺施旺细胞细胞)和和G(G(肌组织之外的多种肌组织之外的多种组织器官组织器官)。n nB.B.不同形式的不同形式的dystrophin dystrophin 蛋蛋白及其区域组成白及其区域组成,氨基端、中氨基端、中央棒状区域、富含半胱氨酸区央棒状区域、富含半胱氨酸区域及羧基端区域域及羧基端区域第18

15、页/共37页第十九页，共37页。n nDMDDMD患者：患者：60%60%基因突变表现为缺失基因突变表现为缺失n n一般在基因的一般在基因的55端和中央棒区两个区域端和中央棒区两个区域n nBMDBMD患者：可能缺失了一个或者几个基因序列患者：可能缺失了一个或者几个基因序列n ndystrophinedystrophine蛋白的特点蛋白的特点n nDMDDMD患者体内患者体内(t ni)(t ni)很少或者没有很少或者没有n nBMDBMD患者体内患者体内(t ni)(t ni)有表达，但是仍然比正常人少有表达，但是仍然比正常人少第19页/共37页第二十页，共37页。第20页/共37页第二十一

16、页，共37页。临床(ln chun)治疗第21页/共37页第二十二页，共37页。DMD治疗(zhlio)n n目前为止尚无治疗目前为止尚无治疗DMDDMD的有效方法的有效方法n n药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗药物治疗（对症治疗）：糖皮质激素治疗n n短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量和功能，并可能在更长时间内稳定短期口服激素治疗可增强骨骼肌力量和功能，并可能在更长时间内稳定(wndng)(wndng)骨骼骨骼肌力量和功能肌力量和功能n n基因治疗：利用不直接引起人类疾病，免疫原性较小的腺相关病毒（基因治疗：利用不直接引起人类疾病，免疫原性较小的腺相关病毒（AAVAAV）为载体，导）为载体

17、，导入人工剪裁的入人工剪裁的DysDys基因基因n n修正肌肉组织修正肌肉组织(占全身体重占全身体重4040)的基因缺陷遇到各种各样的困难的基因缺陷遇到各种各样的困难n n康复治疗、矫形治疗、社会心理治疗等康复治疗、矫形治疗、社会心理治疗等第22页/共37页第二十三页，共37页。临床(ln chun)检测第23页/共37页第二十四页，共37页。产前诊断和杂合子(hz)诊断n n90%90%携带者孕妇中产前诊断可能有至少携带者孕妇中产前诊断可能有至少95%95%的精确度的精确度n n由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，由于基因突变导致基因的缺失或者多倍体的家庭中，60%-70%60%-

18、70%可以直接可以直接通过通过southernsouthern印迹杂交技术或者印迹杂交技术或者PCRPCR技术来测量胎儿的技术来测量胎儿的DNADNA得到得到n n在其余的基因缺失不能明确诊断出来的家庭中，可以通过键的标记来完成在其余的基因缺失不能明确诊断出来的家庭中，可以通过键的标记来完成产前诊断产前诊断n n与患病男性结婚与患病男性结婚(ji hn)(ji hn)的女性中的女性中n n75%75%的女性：的女性：DNADNA检查、检查、CKCK血清浓度检查血清浓度检查胎儿是否携带胎儿是否携带n n25%25%女性难检测：女性难检测：n n第一，在病程的一些时期，基因缺陷是无法被检查出来的（

19、可能情况就是第一，在病程的一些时期，基因缺陷是无法被检查出来的（可能情况就是等位基因是正常的或者突变的等位基因位于另外一条等位基因是正常的或者突变的等位基因位于另外一条X X染色体上）染色体上）n n第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了第二，一些家庭的一些成员的样本丢失了n n第三，两个标记基因之间的基因重组在第三，两个标记基因之间的基因重组在X X染色体传入下一代之前发生了染色体传入下一代之前发生了（母系镶嵌）（母系镶嵌）第24页/共37页第二十五页，共37页。产前检测(jin c)n n生物化学检查生物化学检查CKCK血清浓度血清浓度(nngd)(nngd)n n基因诊断基因诊断n n多重

20、多重PCRPCRn nSouthern blotSouthern blotn n探针连接多重扩增探针连接多重扩增(MLPA)(MLPA)n n变性高效液相色谱变性高效液相色谱(DHPLC)(DHPLC)n n抗肌萎缩蛋白的免疫组化抗肌萎缩蛋白的免疫组化第25页/共37页第二十六页，共37页。多重PCR方法DMD、BMD相关(xinggun)基因的缺失、重复n n可直接检出可直接检出DMDDMDBMDBMD的缺失型突变的缺失型突变n n6565的患者为基因缺失所致的患者为基因缺失所致n n多重多重PCR:PCR:使用多对引物的使用多对引物的n n针对针对DMDDMD基因的缺失热区，利用多对基因的

21、缺失热区，利用多对PCRPCR引物在一个引物在一个PCRPCR管中同时扩增多个外显管中同时扩增多个外显子，通过子，通过(tnggu)(tnggu)和正常对照相比较而判断外显子的缺失情况和正常对照相比较而判断外显子的缺失情况第26页/共37页第二十七页，共37页。多重PCR方法(fngf)n n优点：优点：n n1 1、具有敏感、特异性强和可重复性好的优点、具有敏感、特异性强和可重复性好的优点n n2 2、需要的、需要的DNADNA量少、操作简单量少、操作简单n n局限性局限性:n n1.1.女性携带者女性携带者正常正常x x染色体的屏蔽效应，无法检出染色体的屏蔽效应，无法检出n n2.2.多重

22、多重PCRPCR体系内，由于引物之间的相互竞争，有时也会出现个别片段体系内，由于引物之间的相互竞争，有时也会出现个别片段(pin dun)(pin dun)扩增的假阴性结果。（对初次扩增呈阴性结果的片段扩增的假阴性结果。（对初次扩增呈阴性结果的片段(pin(pin dun)dun)进行再次扩增，以验证结果的准确性）进行再次扩增，以验证结果的准确性）第27页/共37页第二十八页，共37页。Southern blot方法DMD、BMD相关(xinggun)基因的缺失、重复n n是一种常用的是一种常用的DNADNA定量的分子生物学方法定量的分子生物学方法n n原理原理n n将待测的将待测的DNADN

23、A样品固定在固相载体样品固定在固相载体(zit)(zit)(硝酸纤维膜或尼龙膜硝酸纤维膜或尼龙膜)上上n n与同位素标记的核酸探针进行杂交与同位素标记的核酸探针进行杂交n n在与探针有同源序列的固相在与探针有同源序列的固相DNADNA的位置上显示出杂交信号的位置上显示出杂交信号n n通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数第28页/共37页第二十九页，共37页。Southern blot方法(fngf)n n优点：优点：SouthernSouthern杂交准确性高、特异性强杂交准确性高、特异性强n

24、n缺点：缺点：n n1 1、不经过靶片段的扩增、不经过靶片段的扩增(PCR)(PCR)，一般每个电泳通道需要，一般每个电泳通道需要1030g1030g的的DNADNA，在，在实际操作中就需较大量的实际操作中就需较大量的DNADNA样品样品(yngpn)(yngpn)n n2 2、SoutllemSoutllem杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变杂交不能确定缺失的准确外显子范围，对检测女性重复突变(duplication)(duplication)或三重重复或三重重复(triplication)(triplication)携带者存在困难携带者存在困难n n3 3、由于、由于DM

25、DDMD基因很大，需要基因很大，需要6 6到到8 8个个cDNAcDNA探针，杂交反应才能覆盖整个探针，杂交反应才能覆盖整个DMDDMD基因，要基因，要1 12 2周时间用来分析，劳动量大周时间用来分析，劳动量大n n4 4、需要使用放射性同位素作为示踪物，会对工作环境带来污染、需要使用放射性同位素作为示踪物，会对工作环境带来污染第29页/共37页第三十页，共37页。多 重 探 针多 重 探 针(t n z h n)(t n z h n)连 接 依 赖 性 扩 增 技 术连 接 依 赖 性 扩 增 技 术 M L P A M L P An nmultiplex probe ligation d

26、ependent amplificationmultiplex probe ligation dependent amplificationn n原理原理n n针对所有需要检测突变的针对所有需要检测突变的DNADNA序列，设计多对特异探针序列，设计多对特异探针n n固定在尼龙膜上固定在尼龙膜上n n和待测样品和待测样品(yngpn)DNA(yngpn)DNA杂交然后洗膜（正常序列和探针杂交后不被洗脱）杂交然后洗膜（正常序列和探针杂交后不被洗脱）n n利用连接酶把探针连接起来利用连接酶把探针连接起来n n使用一套通用引物进行使用一套通用引物进行PCRPCR扩增扩增n nPCRPCR产物用产物用P

27、CRPCR仪进行分析，仪进行分析，DNADNA片段的缺失重复以及拷贝数以测序仪得到信号的有片段的缺失重复以及拷贝数以测序仪得到信号的有无及信号的峰高或面积进行计算无及信号的峰高或面积进行计算第30页/共37页第三十一页，共37页。n n优点：优点：n n可以在可以在1 1个个PCRPCR管中完成多达管中完成多达4040个外显子的缺失重复检测个外显子的缺失重复检测n n专门用于专门用于DMDDMD缺失重复检测的试剂盒，通过缺失重复检测的试剂盒，通过2 2个个PCRPCR反应就可以完成反应就可以完成7979个个外显子及其非翻译序列的缺失重复突变筛查外显子及其非翻译序列的缺失重复突变筛查n n灵敏度

28、高、操作灵敏度高、操作(cozu)(cozu)简单、可重复性好、经济快捷简单、可重复性好、经济快捷第31页/共37页第三十二页，共37页。D M DD M D 患 者患 者(h u n z h )(A)(h u n z h )(A)及 其 母 亲及 其 母 亲(B)(B)的的 2 0-4 72 0-4 7 号 外号 外显 子 的显 子 的 M L P AM L P A 检 测 结 果检 测 结 果第32页/共37页第三十三页，共37页。变性(binxng)高效液相色谱 DHPLCn ndenaturing high performance liquid chromatographydenatu

29、ring high performance liquid chromatographyn n原理原理n n用离子对逆向层析法分离并检测异源双链用离子对逆向层析法分离并检测异源双链n n通过三乙基醋酸钠（通过三乙基醋酸钠（TEAA)TEAA)作为桥分子，带正电的氨基与核酸分子带负电作为桥分子，带正电的氨基与核酸分子带负电电荷的磷酸基相互作用，烷基端与色谱柱基质表面的疏水基团相连电荷的磷酸基相互作用，烷基端与色谱柱基质表面的疏水基团相连n n不同大小的不同大小的DNADNA片段所含的磷酸根数目不同，与固定相的结合力不同片段所含的磷酸根数目不同，与固定相的结合力不同n n随着流动随着流动(lidng

30、)(lidng)相中乙腈浓度相中乙腈浓度(离子对洗脱液的比值离子对洗脱液的比值)的增加，的增加，DNADNATEAATEAA与柱基质的疏水作用力逐渐减弱，最终被洗脱下来与柱基质的疏水作用力逐渐减弱，最终被洗脱下来n n检测柱洗脱液在检测柱洗脱液在260 nm260 nm处的吸光度，样品中各成分在色谱图中显示为不处的吸光度，样品中各成分在色谱图中显示为不同的吸收峰同的吸收峰n n优点优点:灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析灵敏度高、分析快捷以及可以进行半自动化分析第33页/共37页第三十四页，共37页。第34页/共37页第三十五页，共37页。Merci de votre attentio

31、n!第35页/共37页第三十六页，共37页。参考文献n nDMDDMDBMDBMD基因诊断研究进展，徐晓雪基因诊断研究进展，徐晓雪 张朝东张朝东 李嘉姝李嘉姝n nDMD DMD 患者骨骼肌抗肌萎缩蛋白表达与临床病理改变，陈琳患者骨骼肌抗肌萎缩蛋白表达与临床病理改变，陈琳 郭玉璞郭玉璞 邹丽萍邹丽萍 赵燕环赵燕环 任海涛任海涛n nDMD DMD 基因突变及突变检测技术基因突变及突变检测技术(jsh)(jsh)研究进展，朱海燕研究进展，朱海燕,邬玲仟邬玲仟*,*,梁德生梁德生,夏家辉夏家辉n n免疫荧光检测抗肌萎缩蛋白诊断肌营养不良症的临床应用，王训免疫荧光检测抗肌萎缩蛋白诊断肌营养不良症的临床应用，王训 谢有梅谢有梅 张成张成 刘焯刘焯霖霖n n假肥大型肌营养不良症产前基因诊断的临床应用，杨元假肥大型肌营养不良症产前基因诊断的临床应用，杨元 林立林立 王军王军 孔祥东孔祥东 张思仲张思仲n n抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合体与抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合体与Duchenne Duchenne 型肌营养不良症，张文娟型肌营养不良症，张文娟 孙新刚孙新刚 尹小尹小玲玲第36页/共37页第三十七页，共37页。