武汉大学液相色谱分析法学习教案.pptx

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1、会计学1武汉大学武汉大学(w hn d xu)液相色谱分析法液相色谱分析法第一页，共76页。1高效高效(o xio)液相液相色谱法与经典液相色谱色谱法与经典液相色谱法法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达高压输液设备，流速最高可达 103cmm

2、in-1.103cmmin-1.例如分例如分离苯的羟基化合物，离苯的羟基化合物，7 7个组分只需个组分只需1min1min就可完成就可完成(wn(wn chng)chng)。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm170cm，柱径，柱径0.9cm0.9cm，流动相速度为，流动相速度为30cm3h-130cm3h-1，需用，需用2020多小多小时才能分离出时才能分离出2020种氨基酸；而用高效液相色谱法，只种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需需lhlh之内即可完成之内即可完成(wn chng)(wn chng)。又如用。又如用25cm0.46cm25cm0.

3、46cm的的LichrosorbLichrosorbODS(5)ODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在的柱，采用梯度洗脱，可在不到不到0.5h0.5h内分离出尿中内分离出尿中104104个组分个组分.第1页/共76页第二页，共76页。2 2高效高效(o xio)(o xio)液相色谱法与气液相色谱法与气相色谱法相色谱法 （l l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的化合物，它们仅占有机物总数的2020。对于占有机物总数。对于占有机物总数近近8080的那些的那些(nxi)(nxi)高沸点、热稳定性差、摩尔质量大高沸点

4、、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。(2)(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了烈竞争。因此，流动相对分离

5、起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。提供了极大方便。第2页/共76页第三页，共76页。(3)(3)气气相相色色谱谱一一般般都都在在较较高高温温度度下下进进行行的的，而而高高效效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。液相色谱法则经常可在室温条件下工作。总总之之，高高效效液液相相色色谱谱法法是是吸吸取取了了气气相相色色谱谱与与经经典典液液相相色色谱谱优优点点，并并用用现现代代化化手手段段加加以以改改进进，因因此此得得到到迅迅猛猛的的发发展展。目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已被被广广泛泛应应

6、用用于于分分析析对对生生物物学学和和医医药药上上有有重重大大意意义义的的大大分分子子物物质质，例例如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类类、植植物物色色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高高效效液液相相色色谱谱法法的的仪仪器器设设备备费费用用昂昂贵贵，操操作作(cozu)(cozu)严格，这是它的主要缺点。严格，这是它的主要缺点。第3页/共76页第四页，共76页。13.2 高效高效(o xio)液相液相色谱仪色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图20-1，一般可分为4个主要部分：高压输液系统(xtng)，进样系统(xtng)，分离系

7、统(xtng)和检测系统(xtng)。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。第4页/共76页第五页，共76页。液相色谱仪液相色谱仪第5页/共76页第六页，共76页。流 程第6页/共76页第七页，共76页。由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配

8、备有高压输液系统。阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是

9、在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化引起阻力变化(binhu)(binhu)无关；恒压泵是指能保持输出压力无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化(binhu)(binhu)，故保，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取留时间的重现性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。复泵两种，应用最多的是机械往复泵。1.

10、1.高压高压(goy)(goy)输液输液系统系统第7页/共76页第八页，共76页。动画演示(ynsh)第8页/共76页第九页，共76页。2进样系统进样系统(xtng)高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5 530cm30cm），所），所以柱外展宽以柱外展宽(zh(zh n kun)n kun)（又称柱外效应）较突出。柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽(zh(zh n kun)n kun)是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽(zh(zh n kun)n kun)，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱，主要包括进样

11、系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽外展宽(zh(zh n kun)n kun)可分柱前和柱后展宽可分柱前和柱后展宽(zh(zh n kun)n kun)。进样系。进样系统是引起往前展宽统是引起往前展宽(zh(zh n kun)n kun)的主要因素，因此高效液相色的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。谱法中对进样技术要求较严。进进样样阀阀第9页/共76页第十页，共76页。动 画第10页/共76页第十一页，共76页。3 分离分离(fnl)系统系统色色谱柱谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃柱管与固定相

12、两部分。柱管材料有玻璃(b(b l)l)、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃的其他金属。玻璃(b l)(b l)管耐压有限，故金管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长属管用得较多。一般色谱柱长5 530cm30cm，内径，内径为为4 45mm5mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径3 312mm12mm，制备往，制备往内径较大，可达内径较大，可达25mm 25mm 以上。一般在分离前备以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱全一样，这样可使淋洗溶剂

13、由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。受影响。第11页/共76页第十二页，共76页。常用常用常用常用(chn(chn ynyn)分离分离分离分离柱柱柱柱 柱体为直型不锈钢管，见下图柱体为直型不锈钢管，见下图 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆）一般采用匀浆(yn jin)填充法装柱，先将填料调成匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆(yn jin)，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有

14、洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。第12页/共76页第十三页，共76页。4检测检测(jin c)系系统统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理(wl)或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理(wl)或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:第13页/共76页第十四页，共76页。（l）紫外检测器）紫外检测器（2）荧光检测器）荧光检测器 (3)示差折光率检测器示差折

15、光率检测器 几乎所有物质都有各自不同几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可是一种通用型检测器。灵敏度可达达10-7gcm-3。主要缺点。主要缺点(qudin)是对温度变化敏感，是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。并且不能用于梯度淋洗。（4）电导检测器）电导检测器 (5)附属系统附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置的附属装置.

16、第14页/共76页第十五页，共76页。紫外可见光、电化学检测器的流通池比较(bjio)第15页/共76页第十六页，共76页。1.紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形特点：灵敏度高；线形特点：灵敏度高；线形特点：灵敏度高；线形(xin xn(xin xn)范围高；流通池可做的很小（范围高；流通池可做的很小（范围高；流通池可做的很小（范围高；流通池可做的很小（1mm 1mm 10mm 10mm，容积，容积，容积，容积 8L 8L）；对流动相的流速和温

17、度变化不敏感；波长可选，易）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。于操作；可用于梯度洗脱。于操作；可用于梯度洗脱。于操作；可用于梯度洗脱。第16页/共76页第十七页，共76页。1a.1a.紫外光电二极管阵列紫外光电二极管阵列(zhn(zhn li)li)检测器检测器 紫外检测器的重要紫外检测器的重要(zhngyo)进展；进展；光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024 个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。个二极管阵列，各检测

18、特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第17页/共76页第十八页，共76页。第18页/共76页第十九页，共76页。光电二极管阵列光电二极管阵列光电二极管阵列光电二极管阵列(zhn li)(zhn li)检测器检测器检测器检测器第19页/共76页第二十页，共76页。紫外普通检测器和光电紫外普通检测器和光电二极管阵列二极管阵列(zhn li)(zhn li)检测器的比较检测器的比较普通普通普通普通(ptng)(ptng)检检检检测器测器测器测器光电二极管阵列光电二极管阵列光电二极管阵列光电二极管阵列(zhn(zhn li)li)检测器检测器检测器检测器第20页/共76页第二十一页，共7

19、6页。2.2.荧光荧光荧光荧光(ynggung)(ynggung)检测器检测器检测器检测器（fluorescence detectorfluorescence detector）高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物(yow)、氨基酸、甾类化合物等有响应.第21页/共76页第二十二页，共76页。3.3.示差折光示差折光示差折光示差折光(zhgung)(zhgung)检测器检测器检测器检测器（differential refractive index detectordifferential refractive index detector）除紫外检测器之

20、外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度(nngd)呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱(x tu)；偏转式、反射式和干涉型三种；第22页/共76页第二十三页，共76页。示差折光示差折光(zhgung)检测器光路检测器光路第23页/共76页第二十四页，共76页。13.3高效液相色谱高效液相色谱(s p)的固定相和的固定相和流动相流动相（）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化和硬胶两

21、大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大是键合固定相，可扩大(kud)应应用范围，它是目前最广泛使用的一用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为力上限为3.5108Pa。固定相按孔。固定相按孔隙深度分

22、类，可分为表面多孔型和隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。全多孔型固定相两类。第24页/共76页第二十五页，共76页。1.1.表面表面表面表面(bi(bi omin)omin)多孔型固定相多孔型固定相多孔型固定相多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换(l z(l z jio hun)jio hun)剂、分剂、分子筛、聚酸胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的子筛、聚酸胺等。表面活性材料为硅胶的固定相如国外的ZpaxZpax，Corasil IC

23、orasil I和和II II，VydacVydac，PellosilPellosil以及上海试剂一厂的薄以及上海试剂一厂的薄壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如壳玻璃珠等；表面活性材料为氧化铝的固定相，如PelluminaPellumina；为聚酰胺的，如；为聚酰胺的，如PellionPellion。这类固定相的多孔层。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量

24、受限较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。制。第25页/共76页第二十六页，共76页。2全多孔型固定全多孔型固定(gdng)相相 它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。如国外的Porasil，Zobbex、Lichrosorb系列，上海试剂一厂的堆积硅珠，青岛海洋化工厂的YWG系列，天津试剂二厂的DG系列等。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，如国外的Lichrosorb ALOXT。这类固定相由于颗粒(kl)很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.第26页/共76页第二十七页，共76页。第27页/共76页第二十八页，共7

25、6页。（二）流动（二）流动(lidng)相相 由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争。因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1 1）溶溶剂剂对对于于待待测测样样品品，必必须须(bx)(bx)具具有有合合适适的的极极性性和和良好的选择性。良好的选择性。（2 2）溶溶剂剂要要与与检检测测器器匹匹配配。对对于于紫紫外外吸吸收收检检测测器器，应应注注意意选选用用检检测测器器波波长长比比溶溶剂剂的的紫紫外外截截

26、止止波波长长要要长长。所所谓谓溶溶剂剂的的紫紫外外截截止止波波长长指指当当小小于于截截止止波波长长的的辐辐射射通通过过溶溶剂剂时时，溶溶剂剂对对此此辐辐射射产产生生强强烈烈吸吸收收，此此时时溶溶剂剂被被看看作作是是光光学学不不透透明明的的，它它严严重重干干扰扰组组分分的的吸吸收收测测量量。表表20-220-2列列出出了了一一些些常常用用溶剂的紫外截止波长。溶剂的紫外截止波长。对对于于折折光光率率检检测测器器，要要求求选选择择与与组组分分折折光光率率有有较较大大差差别别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。第28页/共76页第二十九页，共76页。第29页/共76页第三十

27、页，共76页。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在(cnzi)，将使截止波长值增加50IOOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.第30页/共76页第三十一页，共76页。13.4高效液相色谱法的主要高效液相色谱法的主要(zhyo)类型类型及选择及选择（）液一液分配色谱法（LLPC）在液-液色谱中,流动相和固

28、定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。1分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移(qiny)，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。第31页/共76页第三十二页，共76页。2固定相 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液，一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇

29、，非极性的角鲨烷等。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用(yngyng)最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。第32页/共76页第三十三页，共76页。化学键合固定化学键合固定化学键合固定化学键合固定(gdng)(gdng)相类型相类型相类型相类型 化学键合固定相:目前应用(yngyng)最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅

30、碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用(yngyng)最广；c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN第33页/共76页第三十四页，共76页。化学键合固定化学键合固定化学键合固定化学键合固定(gdng)(gdng)相相相相的特点的特点的特点的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水耐水(nai shu)、耐光、耐有机溶剂，稳定；、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；）选择性好

31、，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配高覆盖率：分配(fnpi)为主；低覆盖率：吸附为主；为主；低覆盖率：吸附为主；第34页/共76页第三十五页，共76页。3流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与(xingy)固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化

32、合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。第35页/共76页第三十六页，共76页。（二）化学键合相色谱（二）化学键合相色谱法法 （CBPC）采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。1键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎(jh)都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一O

33、H)与有机分可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18。）和苯基等（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等.第36页/共76页第三十七页，共76页。2键合固定相的制备（l）硅酸酯（Si一OR）键合固定相,它是最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：Si 0H ROHSi ORH20由于这类键合固定相的有机(yuj)表面是一些单体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适用于不含水或醇的流动相。（2）SiC或Si一

34、N共价键合固定相 制备反应如下 第37页/共76页第三十八页，共76页。共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应(fnyng)不方便；当使用水溶液时，必须限制pH在48范围内.第38页/共76页第三十九页，共76页。（3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相制备反应(fnyng)如下：这类键会固定(gdng)相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，PH=28范围内正常工作，应用较广泛.第39页/共76页第四十页，共76页。3反相反相(fn xin)健合健合相色谱法相色谱法 此此法法的的固固定定相相是是采采用用极极性性较较小小的的键键合合固固定定相相，如如硅硅

35、胶胶一一C18H37C18H37、硅硅胶胶一一苯苯基基等等；流流动动相相是是采采用用极极性性较较强强的的溶溶剂剂，如如甲甲醇醇十十、乙乙睛睛一一水水、水水和和无无机机盐盐的的缓缓冲冲溶溶液液等等。它它多多用用于于分分离离多多环环芳芳烃烃等等低低极极性性化化合合物物；若若采采用用含含一一定定比比例例的的甲甲醇醇或或乙乙睛睛的的水水溶溶液液为为流流动动相相，也也可可用用于于分分离离极极性性化化合合物物；若若采采用用水水和和无无机机盐盐的的缓缓冲冲液液为为流流动动相相，则则可可分分离离一一些些易易离离解解的的样样品品，如如有有机机酸酸、有有机机碱碱、酚酚类类等等。反反相相键键合合相相色色谱谱法法具具

36、有有柱柱效效高高，能能获获得得无无拖拖尾色谱峰的优点。尾色谱峰的优点。关关于于反反相相键键合合相相色色谱谱的的分分离离机机理理，可可用用所所谓谓疏疏溶溶剂剂作作用用(zuyng)(zuyng)理理论论来来解解释释。这这种种理理论论把把非非极极性性的的烷烷基基键键合合相相看看作作一一层层键键合合在在硅硅胶胶表表面面上上的的十十八八烷烷基基的的“分分子子毛毛”，这这种种“分分子子毛毛”有有较较强强的的流流水水特特性性。当当用用极极性性溶溶剂剂为为流流动动相相来来分分离离含含有有极极性性官官能能团团的的有有机机化化合合物物时时，一一方方面面，分分子子中中的的非非极极性性部部分分与与固固定定相相表表面

37、面上上的的疏疏水水烷烷基基产产生生缔缔合合作作用用(zuyng)(zuyng)，使使它它保保留留在在固固定定相相中中；而而另另一一方方面面，被被分分离离物物的的极极性性部部分分受受到到极极性性流流动动相相的的作作用用(zuyng)(zuyng)，促促使使它它离离开开固固定定相相，并并减减小小其其保保留留作作用用(zuyng)(zuyng)（见见图图20-420-4）。显显然然，两两种种作作用用(zuyng)(zuyng)力力之之差差，决决定定了了分分子子在在色谱中的保留行为。色谱中的保留行为。第40页/共76页第四十一页，共76页。第41页/共76页第四十二页，共76页。4.4.正相键合相色谱

38、法正相键合相色谱法正相键合相色谱法正相键合相色谱法 此法是以极性的有机基团，CN、NH2双羟基等键合在硅胶表面，作为固定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙晴.等）为流动相，分离极性化合物。此时(c sh)，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，但随流动相极性的增加而降低。这种色谱方法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。第42页/共76页第四十三页，共76页。5.离离子子(lz)性性键键合合相相色色谱法谱法 当当以以薄薄壳壳型型或或全全多多孔孔微微粒粒型型硅硅胶胶为为基基质质，化化学学键键合合各各种种离离子子交交换换基基团

39、团，如如一一SO3H SO3H 一一CH2NH2CH2NH2、C00HC00H、一一CH2NCH2N（CH3CH3）等等时时，就就形形成成了了离离子子性性键键合合相相色色谱谱的的固固定定相相；流流动动相相一一般般采采用用缓缓冲冲溶溶液液。其其分分离原理与离子交换色谱类同。离原理与离子交换色谱类同。以以上上讨讨论论了了各各种种类类型型化化学学键键合合相相色色谱谱法法，归归纳纳键键合合相相色色谱谱的的最最大大优优点点是是：通通过过改改变变流流动动相相的的组组成成和和种种类类，可可有有效效地地分分离离各各种种类类型型化化合合物物（非非极极性性、极极性性和和离离子子型型）。此此外外，由由于于键键合合到

40、到载载体体上上的的基基团团不不易易流流失失，特特别别适适用用于于梯梯度度淋淋洗洗。据据统统计计，在在高高效效液液相相色色谱谱法法中中，约约有有8O8O的的分分离离问问题题(wnt)(wnt)是是用用键键合合相相色色谱谱法法解解决决。此此法法的的最最大大缺缺点点是是不不能能用用于于酸酸、碱碱度度过过大大或或存存在在氧氧化化剂剂的的缓缓冲冲溶溶液液作作流流动动相相的的体体系系。如如何何根根据据样样品品极极性性种种类类来来选选择择化化学学键键合合的的固固定定相相，请请参参看看表表20-320-3。第43页/共76页第四十四页，共76页。第44页/共76页第四十五页，共76页。（三）液一固吸附（三）液

41、一固吸附（三）液一固吸附（三）液一固吸附(xf)(xf)(xf)(xf)色谱法色谱法色谱法色谱法(LSAC)(LSAC)(LSAC)(LSAC)液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在(cnzi)吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。1分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS第45页/共76页第四十六

42、页，共76页。达平衡(pnghng)时,有 其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以(dy)分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。第46页/共76页第四十七页，共76页。2固定固定(gdng)相相 吸吸附附(xf)(xf)色色谱谱所所用用固固定定相相多多是是一一些些吸吸附附(xf)(xf)活活性性强强弱弱不不等等的的吸吸附附(xf)(xf)剂剂，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、聚聚酸酸胶胶等等。由由于于硅硅胶胶的的优优点点较较多多，如如线线性性容容量量较较高高，机机械械性性能能好好，不不溶溶胀胀，与与大大多多数数试试

43、样样不不发发生生化化学学反反应应等等，因因此此，以以硅胶用得最多。硅胶用得最多。在在高高效效液液相相色色谱谱法法中中，表表面面多多孔孔型型和和全全多多孔孔型型都都可可作作吸吸附附(xf)(xf)色色谱谱中中的的固固定定相相，它它们们具具有有填填料料均均匀匀、粒粒度度小小。孔孔穴穴浅浅的的优优点点，能能极极大大地地提提高高柱柱效效。但但表表面面多多孔孔型型由由于于试试样样容容量量较较小小，目目前前最最广广泛泛使使用用的的还还是是全全多多孔孔型型微微粒填料。粒填料。第47页/共76页第四十八页，共76页。3流动流动(lidng)相相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往

44、采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数(cnsh)（0）来衡量。0越大，表示洗脱剂的极性越强。表20-4列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，数值可换算（0硅胶=0770氧化铝）。第48页/共76页第四十九页，共76页。第49页/共76页第五十页，共76页。(四）离子交换四）离子交换(l z jio hun)色色谱法（谱法（IEC）此法是利用离子交换原理和液相色谱技术(jsh)的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分

45、离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。第50页/共76页第五十一页，共76页。1离子交换原理 离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团(j tun)和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换(jiohun)：一般(ybn)形式：R一AB RBA第51页/共76页第五十二页，共76页。达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应子交换反应(fnyng)

46、的选择系数）：的选择系数）：式中式中ArAr，Br Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子（分别代表树脂相中洗脱剂离子（A A）和试样离子）和试样离子（B B）的浓度，）的浓度，AA、BB则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子的选择性系数见从表示试样离子B B对于对于A A型树脂亲和力的大小：型树脂亲和力的大小：KB/AKB/A越大，说明越大，说明B B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B B离子电荷越大，水合离子电荷越大，水合(shuh)(shuh)离子半径越小，离子半径

47、越小，KB/AKB/A值就越大。值就越大。第52页/共76页第五十三页，共76页。对对于于典典型型的的磺磺酸酸型型阳阳离离子子交交换换树树脂脂(shzh)(shzh)，一一价价离离子子的的KB/AKB/A值按以下顺序：值按以下顺序：Cs+Cs+Rb+Rb+K+K+NH4+NH4+Na+Na+H+H+Li+Li+二价离子的顺序为：二价离子的顺序为：Ba2+Ba2+Pb2+Pb2+Sr2+Sr2+Ca2+Ca2+Cd2+Cd2+Cu2+Cu2+，Zn2+Zn2+Mg2+Mg2+对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：对于季铝型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：ClO4-Cl

48、O4-I-I-HS04-HS04-SCN-SCN-NO2-NO2-Br-Br-CN-CN-Cl-Cl-BrO3-BrO3-OH-OH-HCO3-HCO3-H2P04-H2P04-IO3-IO3-CH3COOCH3COOF F2 2固定相固定相 作作为为固固定定相相的的离离子子交交换换剂剂，其其基基质质大大致致有有三三大大类类：合合成成树树脂脂(shzh)(shzh)（聚聚苯苯乙乙烯烯）、纤纤维维素素和和硅硅胶胶。而而离离子子交交换换剂剂又又有有阳阳离离子子和和阴阴离离子子之之分分。再再根根据据官官能能基基的的离离解解度度大小还有强弱之分（见表大小还有强弱之分（见表20-520-5）第53页/共

49、76页第五十四页，共76页。第54页/共76页第五十五页，共76页。常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种(j(j zh zh n n)：（l l）多孔型离子交换树脂）多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为5 520m20m，有微孔型和大孔型之分，有微孔型和大孔型之分 见图见图20-620-6中（中（a a）和（）和（b b）。）。（2 2）薄膜型离子交换树脂）薄膜型离子交换树脂 它是在直径约对它是在直径约对30m30m的固体情性核上，凝聚的固体情性核上，凝聚1 12m2m厚的

50、树脂层，厚的树脂层，如图如图20-620-6中（中（c c）。）。（3 3）表面多孔型离子交换树脂）表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂，如图薄的离子交换树脂，如图20-620-6中（中（d d）所示。）所示。（4 4）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型