毕赤酵母的基因表达及其初步纯化学习教案.pptx

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1、会计学1毕赤酵母的基因表达及其初步纯化毕赤酵母的基因表达及其初步纯化第一页，编辑于星期日：十六点 四十二分。毕赤氏酵母毕赤氏酵母作为表达载体的优点作为表达载体的优点1、表达效率高，遗传稳定性好2、结构简单，表达调控机理比较清楚3、有Pr加工系统4、培养简单，成本低廉5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的分泌却很少，利于下游的纯化（毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达系统。）第1页/共29页第二页，编辑于星期日：十六点 四十二分。一、实验材料一、实验材料n n DH5、pPICZA、GS115、TOP10、，pQE4A15n npMD18T载体、Pfu高保真酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶.

2、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、羊抗鼠IgG-HRP、增强型HRP-DAB、底物显色试剂盒.第2页/共29页第三页，编辑于星期日：十六点 四十二分。基因在毕赤氏酵母中表达基因在毕赤氏酵母中表达基因在毕赤氏酵母中表达基因在毕赤氏酵母中表达的简单过程的简单过程4A4A 1515基因的获取基因的获取(PCR)(PCR)目的基因的修饰与克隆目的基因的修饰与克隆 表达载体的构建表达载体的构建 毕赤氏酵母毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定的线性化、电转化与鉴定 目的基因在毕赤酵母目的基因在毕赤酵母GS115GS115中的表达中的表达 重组蛋白的鉴定与分析重组蛋白的鉴定与分析 重组重组 4A 15 4A

3、 15 的初步纯化的初步纯化第3页/共29页第四页，编辑于星期日：十六点 四十二分。1、目的基因、目的基因4A15获取取-PCRn n在设计 N 端引物时引入Xho酶切位点及 Kex2 信号肽水解位点，并删除 Kex2后面的 Ste3 位点（Glu-Ala-Glu-Ala）n n在下游引物（5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC 5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3ATA 3）引入终止密码子和Xba酶切位点，第4页/共29页第五页，编辑于星期日：十六点 四十二分。目的基因目的基因4A15获取取-PCRn n以 pQE4A15 为模板

4、，进行 PCR 扩增，n n扩增条件为 943 min，9430 s，5730 s，7250 s，35个循环，72延伸 10 min，4保存.n n1.5%琼脂糖分析 PCR 产物第5页/共29页第六页，编辑于星期日：十六点 四十二分。2、目的基因的修饰与克隆、目的基因的修饰与克隆n nPCR 扩增产物回收后+克隆载体 pMD18Tn n以 1：3（V）的比例通过 T4 连接酶接，n n连接产物转入大肠杆菌 DH5，菌落 PCR。n n分析阳性菌落：挑取 4 个阳性菌落 进行序列分析.序列正确的命名为 p4A15第6页/共29页第七页，编辑于星期日：十六点 四十二分。3、表达载体的构建、表达载

5、体的构建n n 双酶切基因片段p4A15，用试剂盒回收，双酶切质质粒pPICZaA，回收大片段，n n定向连接，连接产物在低盐的LB 平板上培养。n n挑取抗性菌落提取质粒，进行双酶切鉴定。第7页/共29页第八页，编辑于星期日：十六点 四十二分。5、毕赤氏酵母毕赤氏酵母毕赤氏酵母毕赤氏酵母GS115GS115的电转化与鉴定的电转化与鉴定n n1、线性化限制性内切酶 Bst stXI 单酶切表达载体和重组质粒n n2、电转化电激转化毕赤酵母 GSll5 感受态细胞（转化条件：电压 1 500 V，4 ms）.第8页/共29页第九页，编辑于星期日：十六点 四十二分。电转化完成后培养电转化完成后培养

6、n n转化物涂布于Zeocin 100 mg/L 的 YPD 平板上，28恒温培养36 h 左右，抗性平板上生长的菌落相应的命名GS115/pPICZaA 和 GS115/pPICZa4A15.第9页/共29页第十页，编辑于星期日：十六点 四十二分。5、毕赤氏酵母毕赤氏酵母GS115GS115的电转化与鉴定的电转化与鉴定的电转化与鉴定的电转化与鉴定n n提取抗性菌落的基因组DNA,(方法参见Invitrogen 酵母手册).以此基因组 DNA 为模板，pPICZaA 5 Aox1 primer 和 3 Aox1 primer 为引物进行PCR.n n1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析第10页/共29

7、页第十一页，编辑于星期日：十六点 四十二分。6、目的基因在毕赤酵母、目的基因在毕赤酵母GS115GS115中表达中表达n n挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素）的培养基上摇床培养（28 28，250 r/min 250 r/min 培养至培养至 OD OD600600 为为 26 26）n n离心收集菌体，用BMMY重悬，至OD6001继续摇床。第11页/共29页第十二页，编辑于星期日：十六点 四十二分。.n n每 24 h 向培养基中添加无水甲醇（诱导表达产物分泌到培养基中）至终浓度为 1%；每 24 h取样，离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后进行 12%SDS-PAGE

8、 分析.对 GS115 和 GS115/pPICZaA 作同样的处理，以便于下游 SDS PAGE的分析第12页/共29页第十三页，编辑于星期日：十六点 四十二分。6 6、重组蛋白的鉴定与分析重组蛋白的鉴定与分析6.1 Western blotting6.1 Western blotting将丙酮沉淀后上清12%聚丙烯酰凝胶电泳转移至硝酸纤维膜1%BSA 封闭硝酸纤维膜依次加入一抗（A42 抗体）和二抗（羊抗小鼠 HRP 标记 IgG），n nTBST 洗涤 5 次，HRP-DAB 底物显色试剂盒显色.第13页/共29页第十四页，编辑于星期日：十六点 四十二分。Western Blot 原理原

9、理 an nWestern Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。第14页/共29页第十五页，编辑于星期日：十六点 四十二分。Western Blot 原理原理 b bn n经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。第15页/共29页第十六页，编辑于星期日：十六点 四十二分。Western Blot 原理原理 cn n以固相载体上的蛋白质或多肽

10、作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。第16页/共29页第十七页，编辑于星期日：十六点 四十二分。Western Blot操作步骤操作步骤n n1、蛋白样品制备n n2、蛋白含量的测定n n3、SDSPAGE电泳n n4、转膜n n5、免疫反应n n6、化学发光，显影，定影n n7、凝胶图象分析第17页/共29页第十八页，编辑于星期日：十六点 四十二分。6、重组蛋白的鉴定与分析重组蛋白的鉴定与分析6.2 6.2 质谱分析质谱分析质谱分析质谱分析n n从考染

11、（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白带，进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析.第18页/共29页第十九页，编辑于星期日：十六点 四十二分。7、重组重组 4A15 的初步纯化的初步纯化n n挑取阳性克隆单菌落接种于挑取阳性克隆单菌落接种于 BMGY BMGY 培养基培养基中（中（28 28，250 r/min 250 r/min 培养至培养至 OD OD600600 为为 2626），），离心收集菌体，用离心收集菌体，用 BMMY BMMY 重悬，重悬，至至ODOD600600 1 1继续摇床。继续摇床。每每24 h 24 h 向培养基中添加无水

12、甲醇至终浓度为向培养基中添加无水甲醇至终浓度为 1%1%；培养；培养 48 h 48 h。离心收集上清液，分别加入固体硫酸铵至其饱和度 30%40%50%60%70%。n n离心收集沉淀，取适量沉淀进行12%SDS-PAGE 分析。n n 并用Band Scan 软件进行蛋白质纯度分析.第19页/共29页第二十页，编辑于星期日：十六点 四十二分。蛋白质的分离纯化方法 Alade第20页/共29页第二十一页，编辑于星期日：十六点 四十二分。四种分离纯化方法四种分离纯化方法n n1、根据分子大小不同进行分离纯化n n2、根据溶解度不同进行分离纯化n n3、根据电荷不同进行分离纯化n n4、利用对配

13、体的特异亲和力进行分离纯化第21页/共29页第二十二页，编辑于星期日：十六点 四十二分。1、根据根据分子大小不同分子大小不同进行分离纯化进行分离纯化n n主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法，它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，除去无机盐。第22页/共29页第二十三页，编辑于星期日：十六点 四十二分。2、根据根据溶解度不同溶解度不同进行分离纯化进行分离纯化n n 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等n n常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。第23页/共29页第

14、二十四页，编辑于星期日：十六点 四十二分。3、根据根据电荷不同电荷不同进行分离纯化进行分离纯化n n根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳电泳和和离子离子交换层析交换层析两类。两类。n n离子交换层析离子交换层析(IEC)(IEC)是以离子交换剂为固定相是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法种层析方法。n n阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质阴离子交换基质结合带有负

15、电荷的蛋白质,被留在层析柱上被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度通过提高洗脱液中的盐浓度,将将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来n n另外另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取第24页/共29页第二十五页，编辑于星期日：十六点 四十二分。4、利用利用对配体的特异亲和力对配体的特异亲和力进行分离纯化进行分离纯化n n亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。n n亲亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应

16、用也相当广泛。和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。第25页/共29页第二十六页，编辑于星期日：十六点 四十二分。.n n利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428BAEEmg71 428BAEEmg-1-1,纯化回收率纯化回收率达到达到625%625%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。第26页/共29页第二十七页，编辑于星期日：十六点 四十二分。第27页/共29页第二十八页，编辑于星期日：十六点 四十二分。第28页/共29页第二十九页，编辑于星期日：十六点 四十二分。