基金项目湖南省卫生厅重点项目(No 2001 - Z05).pdf

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1、基金项目:湖南省卫生厅重点项目(No.2001-Z05).通讯作者:肖建华,博士,病原生物学研究所教授.E-mail:jhxiao223 .第32卷第3期Vol.32 No.3南华大学学报 医学版Journal of Nanhua University(Medical Edition)2004年7月Jul.2004日本血吸虫新基因BBC1的获得和分析万志刚,肖建华,曾 桥,杨秋林,张愉快,杨 胜(南华大学 病原生物学研究所,湖南 衡阳421001)摘 要:目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新的蛋白基因,为日本血吸虫病的防

2、治提供候选疫苗和药物靶点。方法 构建日本血吸虫成虫cDNA文库,挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA,并进行生物信息学分析和登录。结果 获得了1个日本血吸虫新基因-BBC1基因(AY220747),长623 bp,编码184个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为60.8 kDa,等电点为5.13。结论 步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因。关键词:日本血吸虫;cDNA文库;步移法;生物信息学中图分类号:R383.24 文献标识码:A 文章编号:1672-7444(2004)03-0275-03Acquiring and Sequence Anal

3、ysis of the Breast BasicConserved(BBC1)Gene of Schistosoma JaponicumWAN Zhi-gang,XIAO Jian-hua,ZENGQiao,et al(Institute of Panthogenic Biology,Nanhua University,Hengyang,Hunan421001,China)Abstract:ObjectiveT o acquire and analyze adult stage Schistosoma japonicum(Sj)new genes from anadult Schistosom

4、a japonicum cDNA library and to search new vaccine candidates and drug targets for preventing,controlling and treating Schistosomasis.MethodsA cDNA library was constructed from Shistosoma japonicum(Chinese strain)adult stage.Clones were selected randomly from the cDNA library and were sequenced.Nove

5、lgenes were analyzed in GenBank databases by BLAST programs and other programs.ResultsBBC1 gene,623base pairs and codingfor 184 amino acids,was acquired and was submitted to GenBank(AY220747).The molecu2lar weight is 60.8 kDa and the theoretical pI is 5.13.ConclusionIt is a feasible method to discov

6、er and acquirenovel genes of Schistosoma japonicum by combination of Primer-walking sequencing and Bioinformatics technique.Key words:Schistosoma japonicum;cDNA library;Primer-walking;Bioinformatics 血吸虫病是严重危害人类健康的寄生虫病。由于目前尚无有效的抗病疫苗,而血吸虫病治疗药物的毒副作用较大,并且某些血吸虫株已对当前首选的治疗药物吡喹酮产生了抗药性。因此,寻找新的杀虫药物和开发研制有效抗血吸虫

7、病疫苗已成为刻不容缓的工作,而新的基因的寻找及其功能的研究是其必要的前期工作。本文综合运用步移法测序和生物信息学技术,从日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫cDNA文库中获得1个编码Sj核糖体蛋白的新基因 BBC1基因,572登录号为AY220747,现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 日本血吸虫成虫cDNA文库 本实验室构建保存1。1.1.2载体及宿主菌 载体:pBC sk+(带有2 950 bp、ColE1 f1复制子、T3和T7启动子、amp和lacZ 选择标记)可用于RNA的表达。宿主菌:大肠杆菌DH5supE44LacU169(80

8、Lac ZM15)hsdR17 recA1 end A1 gyr A96 thi-rel A1可以在液体或固体的LB培养基中生长,由本实验室保存。1.1.3主要试剂 胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司;IPTG和X-gal购自上海生工公司;其它均为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1 阳性克隆的分离及测序 制备固体LB琼脂培养基,每个平板中加40L X-gal(20 mgmL)和4L IPTG(200 mgmL),用40L灭菌去离子水稀释10L的原文库,铺于LB培养基上,37 倒置培养过夜。挑取白色菌落,并再次筛选。分别挑取扩增后的阳性菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中摇菌5 h,提取

9、质粒于ABI377型自动测序仪上进行序列测定。1.2.2 序列分析及新基因的获取和登录 将原始测序结果进行编辑,去除序列中载体部分,将剩余序列运用Blast程序通过Internet与NCBI数据库在核酸水平进行nr与EST同源性分析(http:www.ncbi.nhl.govBlast)。根据以上分析结果,对部分序列采用步移法测序,直至获取全长cDNA。进入SWISS-PROT相关站点分析新基因的阅读框架和进行翻译(http:www.ncbi.nhl.govgorf),并对序列的初步功能进行分析。将获取的新基因利用Sequin程序进行登录(http:www.ncbi.nhl.govsequin

10、)。应用Protscan,Scanprosite和HNN等Internet在线分析软件对获得的新基因进行进一步结构和功能的分析和预测(http:www.expasy.org)。2结 果2.1新基因的核苷酸序列分析 BBC1蛋白基因全长736 bp,其开放阅读框(open read frame,ORF)编码204个氨基酸,3 端含有加尾信号(AATAAA)和polyA尾(见图1)。图1 日本血吸虫BBC1 cDNA序列和蛋白序列AATAAA加尾信号;ATG为起始密码子;3 为终止密码子2.2BBC1基因特征性序列分别与其他生物相应序列的同源性比较 见图2。2.3蛋白质特性分析 使用Protsca

11、n软件对该基因所编码的蛋白质进行分析,推测SjBBC1编码蛋白的理论分子量为60.8 kDa,等电点为5.13。HNN程序二级结构预测该蛋白有51.96%的螺旋,7.35%的延伸链和40.69%的无规则卷曲(见图3)。Scanprosite程序分析SjBBC1蛋白含有2个N-glycosylation位点(103106和112115位核苷酸),1个cAMP和cG MP依赖蛋白激酶磷酸672化位点(144147位核苷酸),2个蛋白激酶C磷酸化位点(6264和8688位核苷酸),2个酪氨酸激酶II磷酸化位点(7679和169172位核苷酸),1个N-myristoylation位点(108113位

12、核苷酸),1个Amidation位点(191194位核苷酸)。1 70-RAGRGFSLQEVRAAG-842 70-RSGRGFSLQEVRAAG-843 71-RAGRGFSLEELK AAG-854 71-RAGRGFSLEELRVAG-855 71-RAGRGFSLEELRVAG-856 71-RAGRGFT LEELK AAG-857 71-RAGRGFNLEELRVAG-85图2BBC1蛋白特征性序列与其他生物相应序列比较3 讨 论人类基因组计划于1990年开始启动1,曼氏血吸虫基因组计划也于1995年启动2,日本血吸虫基因组计划启动较曼氏血吸虫基因组计划滞后37。但随着日本血吸虫

13、基因组计划的不断实施,基因库中日本血吸虫基因序列数据迅速增加,迄今被NCBI的GenBank收录的血吸虫的EST有69 000条左右,但极少部分开展了详细研究,越来越多的基因序列有待鉴定。生物信息学8是一门综合运用生物学、数学、物理学、信息科学及计算机科学等诸多学科的理论、方法的崭新交叉学科。图3SjBBC1二级结构的预测(h=helix,e=strand,c=random coil)它应用先进数据管理技术、数学分析模型和计算机软件对各种生物信息(特别是分子生物学信息)进行获取、处理、存储、分配、分析和解释,以达到理解数据中的生物学含义的目标。利用生物信息学技术对血吸虫未知基因序列进行结构分析

14、已成为鉴定新基因的重要技术策略9。本研究构建了日本血吸虫cDNA文库,为寻找日本血吸虫新基因奠定了基础,随机挑取阳性克隆进行测序和对部分克隆进行步移法测序;获得日本血吸虫BBC1蛋白基因(AY220747)。该基因编码的蛋白含有多个磷酸化位点,可以推测它的活性可能受磷酸化作用调节;含有1个cAMP和cG MP依赖蛋白激酶磷酸化位点,揭示它可能是受磷酸化激活控制、cAMP和cG MP依赖的受体分子。BBC1基因在其他生物中的功能不十分明确,有报道表明BBC1基因在大肠杆菌中表达能提高其对于低温和高渗环境的抵抗力10,而Mo2erland E等人报道BBC1基因可以作为乳腺癌抑制基因11;而目前国

15、内外对于SjBBC1基因的功能研究尚无报道。我们将对该基因及其编码的蛋白进行更深入的研究。总之,步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因,同时利用相关软件或程序及生物信息技术能够快速、有效的研究新基因的功能,并预测基因表达产物的性质,为血吸虫的基因组研究和血吸虫病的防治提供实验基础。参考文献:1Francis S Collins,Michael Morgan,Aristides Patrinos.The human genome project:lessonsfrom large-scale bi2ologyJ.Science,2003,300:286-290.2Franco

16、 GR,Valadao AF,Azevedo V.The Schistosomagene discovery program:state of the artJ.Int J Parasi2tol,2000,30(4):453-463.3Wu ZD,Yu XB.Isolation and identification of expressedSchistosoma japonicum Chinese mainland train genes froma directional cDNA library by EST strategyJ.ChineseJournal of Z oonoses,20

17、00,16(1):3-5.4Li Y.Generating and analysis of EST of Schistosoma ja2ponicumJ.Endemic Deseases Bulletin,2001,16(1):6-10.(下转第297页)772时相胰岛素分泌是正常的,然后逐渐升高,最后又逐渐降低。2型糖尿病发生的主要病理生理特征:胰岛素对外周组织代谢调节作用受到拮抗而减弱(即胰岛素抵抗)和随着血糖的升高而出现的胰腺细胞功能减退7,8。本实验研究结果表明,喂食高脂高糖饲料后,小型猪的血清胰岛素水平开始有所升高,然后血清胰岛素水平明显降低,6月末达到11.592.88 mumL(

18、P 0.05),可提示小型猪的胰腺细胞受到损伤。结合胰腺组织结构观察,在实验的第6个月时,表现为胰岛萎缩,胰岛及胰岛内细胞数量减少,在胰岛周围有少量淋巴细胞浸润,而且在透射电镜下亦观察到胰岛细胞肿胀,部分结构溶解,细胞呈空泡化,局部结构模糊。综上所述,高脂高糖饲料复制小型猪糖尿病模型,具有与人类2型糖尿病相似的症状,可用于2型糖尿病的相关实验研究。参考文献:1 孙子林,葛祖恺.糖尿病动物模型及进展J.中国糖尿病杂志,1999,7(4):227-228.2Kunjathoor VV,Wilson DL,Leboeuf RC.Increased ath2erosclerosis in strept

19、ozotocin-induced diabetic mice J.Jclin Invest,1996,97(1):767-773.3 王宗保,姚 峰,吴端生,等.高糖高脂致家兔糖尿病的实验模型探讨J.中国实验动物学报,2003,11(2):40-45.4Z orzano A,Munoz P,Camps M,et al.Insulin-inducedredistribution of G LUT4 glucose carrier in muscle fiber:inrearsch of traffticking pathways J.Diabetes,1996,45(supp):170-181.

20、5Lee Y,Hirose H,Zhou YT,et al.Increase lipogenic capac2ity of the islets of obese rats:a role in the pathogenesis ofNIDDMJ.Diabetes,1997,46(2):408-410.6 王宗保,袁中华,余 坚,等.诱发糖尿病饲料致新西兰兔动脉粥样硬化时血糖、血胰岛素和肝、肾、胰组织结构的变化J.中国动脉硬化杂志,2001,9(5):391-393.7Hirose H,Lee Y,Inman LR,et al.Defective fatty acid me2diated B-c

21、ell compensation in Zucker diabetes fatty rats:pathogenic implications for obesity-dependent diabetesJ.J Biol Chem,1996,27(1):653-655.8Weidong Y in,Zhonghua Yuan,Z ongbao Wang,et al.Adiet high insaturated fat and sucrose alters glucoregulationand induces aortic fatty streaks in new Zealand white rab

22、2bitsJ.Experimental Diab Res,2002,3(2):179-184.(收稿日期:2004-03-18)(上接第277页)5Bian GW,Yu XB,Wu ZD.Generation of adult stageSchistosoma japonicum(Chinese strain)EST and discov2ery of new genesJ.Chinese Journal of Z oonoses,2001,17(6):36-39.6Zhang Y,Feng T.Studyon allele frequency in Oncomela2nia from the

23、 mainland of China J.Zhongguo Ji ShengChong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi,1994,12(3):172-177.7Wang X.Analysis of electrophoretic patterns of three enz2ymes of Oncomelania hupensis J.Zhongguo Ji ShengChong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi,1994,12(4):271-274.8Steuer R,Kurths J,Fiehn O.Observing a

24、nd interpretingcorrelations in metabolomic networks J.Bioinformatics,2003,19(8):1019-1026.9Rodrigues NB,Loverde PT,Romanha AJ.Characteriza2tion of new Schistosoma mansoni microsatellite loci in se2quences obtainedfrom public DNA databases and microsa2tellite enriched genomic librariesJ.Mem Inst Oswa

25、ldoCruz,2002,97(Suppl 1):71-75.10Tanaka S,Ikeda K,Miyasaka H.Enhanced toleranceagainst salt-stress and freezing-stress of Escherichiacoli cells expressing algal bbc1 geneJ.Curr Microbi2ol,2001,42(3):173-177.11Moerland E,Breuning MH,Cornelisse CJ.Exclusion ofBBC1 and CMAR as candidate breast tumour-suppressorgenesJ.Br J Cancer,1997,76(12):1550-1553.(收稿日期:2004-03-28)792