3D-自然科学基金2011.pdf

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1、 申请代码 受理部门 收件日期 受理编号 检查保护 国家自然科学基金 国家自然科学基金 申 请 书 申 请 书(2 0 1 1 版)(2 0 1 1 版)资助类别：亚类说明：附注说明：项目名称：申 请 人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：单位电话：电子邮箱：申报日期：2011年3月9日 国家自然科学基金委员会 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：1)如果您是如果您是 Word2000,word XP,word 2003 或以上版本用户，请把或以上版本用户，请把 Word宏的安全性设为宏的安全性设为:中中 方法方

2、法:Word 菜单菜单-工具工具-宏宏-安全性安全性-安全级安全级,设置为设置为中中 (如果您是如果您是 Word97 用户，继续执行以下步骤用户，继续执行以下步骤)(如果您是如果您是 Office2007 用户，点击用户，点击 word 左上角左上角安全警告安全警告处处选项选项中的中的启用此内容启用此内容)2)关闭本文档，重新打开本文档关闭本文档，重新打开本文档 3)点击点击启用宏启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了按钮，即可开始填写本文档或打印了 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.009.886 基本信息基本信息 1UT1hHnD 姓名 韩伟 性别男 出生 年月

3、 1980 年 2 月 民 族 汉族 学位 博士 职称研究员 每年工作时间（月）9 电话 0551-5595100 电子邮箱 传真 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 安徽省合肥市蜀山湖路 350 号 工作单位 中国科学院合肥物质科学研究院/医学物理与技术中心 申 请 人 信 息 申 请 人 信 息 主 要 研 究 领 域 放射医学基础，辐射生物学，细胞生物学 名称 中国科学院合肥物质科学研究院 联系人 詹晓荣 电子邮箱 依托单位信息 依托单位信息 电话 05515591177 网站地址 http:/ 单 位 名 称 中国人民解放军第105医院 合作研究单位信息 合作研究单位信息 在此录

4、入修改 项目名称 辐射诱发三维尺度旁效应信号传递与一氧化碳的调控关系 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 H2201:放射医学 C050604:电离辐射生物物理与放射生物学 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2015 年 12 月 研究属性 基础研究 项 目 基 本 信 息项 目 基 本 信 息 摘 要(限 400 字)：摘 要(限 400 字)：癌症放疗技术的快速发展，可以尽量避免正常组织受到照射或减少受照射剂量。放疗长期生存者中，照射区域外原发性辐射诱导二次癌症的发生，是生存者的健康大敌。辐射旁效应被认为和这种二次癌症的发生密切相关。细胞受到辐射后会释放出旁效应

5、信号，传递到附近及很远距离，导致细胞增殖、遗传物质损伤和基因突变等直至肿瘤形成。CO（低浓度）是机体内重要信号调控分子，有着广阔的临床使用价值。旁效应传递涉及的几个可能信号通路，在其他研究中均已被证实可被 CO 调控。申请人前期研究证实二维培养细胞中，低浓度 CO 可以很好保护旁细胞不受损伤信号影响。旁效应在二维培养细胞和三维组织中的传递存在很多不同之处，三维组织更接近于正常生理状况。本申请将采用三维培养细胞团簇和人工构建皮肤组织模型，研究低浓度 CO 对旁效应在三维尺度的调控作用和规律，及相关机理，为 CO 用于临床放疗中保护未受辐射组织，防范相关二次癌症发生，提供理论依据和指导。关 键 词

6、关 键 词(用分号分开，最多 5 个)二次癌症；辐射旁效应；低浓度一氧化碳；三维尺度；信号调控 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.009.886 项目组主要参与者项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工作时间（月）1 童丽萍1984-1-8 女 博士生 学士 中国科学院合肥物质科学研究院0551-5593096 tong- 细胞遗传损伤突变分析 10 2 刘慧1983-6-13 女 博士生 学士 中国科学院合肥物质科学研究院05515593325 细胞中蛋白表达检测

7、6 3 胡宗涛1971-8-18 男 副主任医师硕士 中国人民解放军第 105医院 0551-2163294 组织切片及免疫组化 5 4 王宏志1973-3-16 男 副主任医师学士 中国科学院合肥物质科学研究院0551-5595168 组织培养和单束辐射 5 5 吴汝群1985-7-6 女 硕士生 学士 中国科学院合肥物质科学研究院0551-5593096 组织中蛋白表达检测 10 6 在此录入修改 7 在此录入修改 8 在此录入修改 9 在此录入修改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 6 3 2 1 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申

8、请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.009.886 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 一.研究经费 44.7000 1.科研业务费 20.5000 （1）测试/计算/分析费 8.0000单粒子微束装置辐射实验，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜等大型仪器基本使用费用（2）能源/动力费 5.0000实验室消耗电费、水费、煤气费和培养箱用高纯度二氧化碳费用（3）会议费/差旅费 3.0000参加国内专业会议的相关注册费和差旅费 （4）出版物/文献/信息传播费 3.0000国内外论文发表费用

9、 （5）其他 1.5000项目组成员日常办公维持费用 2.实验材料费 20.7000 （1）原材料/试剂/药品购置费 16.0000人工构建皮肤组织，自由基荧光探针,各种蛋白抗体,细胞培养基和各种试剂及试剂盒（2）其他 4.7000细胞培养相关耗材 3.仪器设备费 0.0000 （1）购置 （2）试制 4.实验室改装费 3.5000细胞培养间改造 5.协作费 0.0000 二.国际合作与交流费 二.国际合作与交流费 8.5000 1.项目组成员出国合作交流 4.0000项目负责人参加国际会议或国际交流两次 2.境外专家来华合作交流 4.5000邀请两名境外专家来华合作交流各一次 三.劳务费 三

10、.劳务费 9.5000支付研究生工作补贴 四.管理费 四.管理费 3.3000按规定的 5%管理费用支出 合 计 合 计 66.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写

11、是否规范的评判依据，请遵照要求填写。查看报告正文撰写提纲 报告正文 报告正文 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）1.1 研究意义概述 1.1 研究意义概述 放射治疗中，对目标区域外组织的有效辐射防护至关重要。体外照射可以采用图像引导对病灶区域进行适形和调强照射，并尽可能对靶区外组织进行射线屏蔽；近年来体内近距离照射的快速发展和应用，亦可在图像引导下，将放

12、射性粒子准确置入肿瘤周围使辐射作用范围尽量局限于靶区。辐射区域内，剂量分布和生物学效应都在疗效与风险评估之内。按照传统辐射防护概念，辐射区域附近或更远范围内未受辐射组织都不会受到辐射的作用。但在放疗治愈者中，辐射区域外原发性辐射诱导的二次癌症（radiation-induced secondary cancer）发生，引起科研人员的关注。如前列腺癌患者接受放疗后，10年（及以上）生存者中约有1/70会再次发生癌症，发生部位不仅位于放疗部位附近的膀胱和直肠，还发生在更远距离的肺部1。辐射生物学家认为，辐射区域外这种二次癌症的发生与辐射引发的旁效应（radiation-induced bystan

13、der effect），有着紧密的联系辐射生物学家认为，辐射区域外这种二次癌症的发生与辐射引发的旁效应（radiation-induced bystander effect），有着紧密的联系2,3。研究人员在动物模型中，成功展示了辐射旁效应对肿瘤的诱发效应。如Saran的研究小组仅对小鼠的躯干部进行2 Gy的X-射线辐射后，在受到射线屏蔽保护的小脑部位检测到显著的成神经管细胞瘤（medulloblastoma）发生4。放射治疗中，辐射旁效应对辐射区域外组织有着显著的潜在危害作用放射治疗中，辐射旁效应对辐射区域外组织有着显著的潜在危害作用。研究辐射旁效应的作用规律和机理,对于防范旁效应发生,有效

14、开展辐射防护,是十分必要的。寻找切实有效的旁效应调控方法和调控因子,对于放疗时有效防范未辐射组织中辐射相关二次癌症的潜在发生,有着重要意义。申 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 请人基于前期研究结果，认为低浓度外源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)可能是理想的辐射旁效应调控分子低浓度外源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)可能是理想的辐射旁效应调控分子。1.2 辐射旁效应是目前辐射生物效应研究领域的三大“热点”问题之一 （1）旁效应的危害与癌症发生紧密相关 1.2 辐射旁效应是目前辐射生物效应研究领域的三大“热点”问题之一 （1）旁效应的危害与癌症

15、发生紧密相关 细胞增殖（加快）和基因突变被普遍认为是决定癌症发生的重要风险因子5。旁效应的观察和机理研究，在二维尺度培养细胞模型，三维尺度培养细胞和组织模型，直至活体生物等水平上开展了大量的工作：直接受到辐射的细胞，会产生损伤信号分子，这些信号分子或被释放到细胞外通过扩散作用到达未受辐射的细胞;或者信号分子通过细胞间隙联结通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)进入相邻未受辐射细胞,诱导产生类似于直接辐射细胞中的遗传性改变6-9。旁效应对受辐射区域以外细胞(或组织)造成的显著作用有细胞增殖（加快）DNA 损伤染色体断裂基因突变细胞转化和

16、肿瘤诱导发生等6-9。由于二维尺度培养细胞模型具有遗传背景清楚、易于操作等优点，便于开展辐射旁效应信号传递的机理探索，所以对机理方面的探索和认识大多基于二维尺度培养细胞模型。在旁效应传递中：一氧化氮（nitric oxide,NO）和氧化性自由基（reactive oxygen species,ROS）的产生对旁效应信号的产生和传递起到了关键作用7;MAPK 信号通路的激活；NF-B/COX-2 炎症相关信号通路的激活等对旁效应传导起到了重要作用 6-8。细胞因子 TGF-1,TNF-或 NO 自由基等会被受辐射细胞释放出来充当细胞间信号分子8-10。（2）三维尺度模型中的旁效应传递显著不同于

17、二维尺度模型 在三维组织和活体动物水平上，旁效应的传递在效应强度、时间和空间效应上，显著区别于二维尺度培养细胞模型（2）三维尺度模型中的旁效应传递显著不同于二维尺度模型 在三维组织和活体动物水平上，旁效应的传递在效应强度、时间和空间效应上，显著区别于二维尺度培养细胞模型。旁效应的强度旁效应的强度在三维尺度模型和活体动物水平上，表现出与二维尺度培养细胞模型很大的差异。在二维尺度模型中，各种生物学终点检测出的旁效应强度均无剂量相关性，且效应强度低于三维尺度研究模型。如在二维尺度培养细胞中，旁效应导致的DNA双链断裂（DNA double strand break,DSB）（利用DSB标志蛋白检测）

18、阳性细胞率仅上升1倍左右，但在人工构建的标准人皮肤组织中，阳性细胞率为对照的4-6倍11;在旁效应致突变作用的研究中，二维尺度培养AL细胞中CD59基因位点突变率上升约3倍12；但在三维尺度AL细胞团簇模型中，突变率上升约14倍（13），且突变率显示出与辐射剂量的显著正相关性15。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 时间效应上时间效应上：在培养的人皮肤成纤维细胞中，旁效应导致的DSB（利用-H2AX蛋白免疫荧光检测）于辐射后1-2小时甚至30分钟即可达到峰值15-17，但在人工构建的标准人皮肤组织模型中，旁效应区域-H2AX表达的峰值则出现在辐射后12小时（上皮细胞层）至48小时

19、（成纤维细胞层）11。空间效应上空间效应上：二维尺度培养细胞中在距离辐射区5毫米甚至更远的区域，仍可显著检测到旁效应诱导的微核(micronucleus，MN)和NO产生等生物学效应18，但在人工构建的标准人皮肤组织中，旁效应导致的微核和凋亡发生仅局限于辐射区域外1毫米范围内19，即便是采用-H2AX蛋白标记检测DSB这种高敏感度的方法，旁效应的传递也仅局限发生在辐射区域外2.5毫米范围内11；然而在纵向半身屏蔽照射小鼠的模型中，由于体内循环系统可能参与了信号传递，在距辐射区域1厘米以外的皮肤组织中检测到显著的DNA损伤和相关蛋白表达20；在仅对小鼠躯干部进行辐射的模型中，由于中枢神经可能参与

20、旁效应信号传递，受屏蔽保护的小脑部位检测到显著的DSB、细胞凋亡和成神经管细胞瘤发生4。旁效应在三维尺度和活体生物中这些显著的差异性,说明辐射旁效应信号的传递和作用规律,很可能有别于在二维尺度培养细胞模型中已发现的机理和规律。1.3 低浓度 CO 是理想的辐射旁效应调控分子（1）(低浓度的)CO 是机体内重要的信号调节分子 1.3 低浓度 CO 是理想的辐射旁效应调控分子（1）(低浓度的)CO 是机体内重要的信号调节分子 CO 作为一种有毒性气体在数百年前就已被认识。近年来发现低浓度 CO 是机体内一种重要的化学气体信使,调节着从神经、心血管到免疫等几乎所有系统的多种生理功能 21,22。正常

21、机体中CO 的生理浓度非常低,但是当机体受到一些刺激因子的作用后,诱导型血红素氧化酶(heme oxygenase-1,HO-1)的活力或者表达水平会显著上升,产生更多的内源性 CO 发挥其生理作用。热休克、缺血、谷胱苷肽还原酶缺失、低氧、氧中毒、细胞转运障碍及细胞因子等均可刺激细胞中 HO-1的表达。诱导产生的内源性 CO 对机体具有保护作用,例如:保护细胞抵御死亡,抗炎症作用,抵御氧化性损伤,抑制细胞增殖,抑制神经传递,保护细胞免受低氧造成的损伤等 22。由于内源性 CO 大多于刺激作用后才产生，且产生量（或浓度）有限，不能完全达到保护机体的作用，所以在研究和具体应用中，多采用外源性 CO

22、 替代的方法在研究和具体应用中，多采用外源性 CO 替代的方法。外源性 CO 具有与内源性 CO 相同的生理功能，例如：在一些疾病的临床治疗上采用吸入低浓度 CO 气体或使用 CO 释放药物分子(carbon monoxide releasing molecules,CORMs)23的方法,如治疗炎症急性肺损伤心血管损伤哮喘和提高器官移植耐受性等24。低浓度 CO 无副作用作用直接且操控简便可行的优势使得 CO 在很多疾病的临床治疗上低浓度 CO 无副作用作用直接且操控简便可行的优势使得 CO 在很多疾病的临床治疗上 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 有着广阔的应用前景有着广阔

23、的应用前景21,22。CO 的作用机理研究也多采用外源性 CO 开展。机体内很多信号通路的关键蛋白/酶具有血红素结构,CO 很容易与之结合来影响蛋白/酶的活性,从而能够调控各种信号通路:CO 可以通过减少 NO 合成酶表达或降低酶活力来调控 NO 信号通路;CO 可以抑制 NADPH 酶活力来减少超氧阴离子的产生;CO可以抑制一些前期炎症细胞因子(pro-inflammatory cytokine)如 TNF-MIF(migration inhibitory factor)IL-1IL-2 和 IL-10 等的产生,达到抗炎症效果;或者 CO 可以通过削弱NF-B 的激活来抑制炎症反应中的 N

24、F-B/COX-2 信号通路;CO 可以调控 MAPK 信号通路;CO 还可以诱导细胞内 glutathione 合成量上升以利于对抗氧化性胁迫（stress）等21,24,25。鉴于低浓度 CO 对各种信号通路和自由基胁迫的调控作用，以及这些信号通路和自由基胁迫在辐射旁效应传递和产生作用中的重要性，低浓度 CO 是否对旁效应的信号传递具有调控作用，以及是否能够对旁效应的危害有防护作用，这是一个值得关注的问题。(2)外源性CO对辐射旁效应的调控作用研究进展 鉴于低浓度 CO 对各种信号通路和自由基胁迫的调控作用，以及这些信号通路和自由基胁迫在辐射旁效应传递和产生作用中的重要性，低浓度 CO 是

25、否对旁效应的信号传递具有调控作用，以及是否能够对旁效应的危害有防护作用，这是一个值得关注的问题。(2)外源性CO对辐射旁效应的调控作用研究进展 基于 CO 能有效调控诸多可能涉及旁效应传递的信号通路，申请人开展了研究。基于二维尺度培养细胞模型的实验结果发现,低浓度 CO 对辐射旁效应的传递有显著阻断作用 26:在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞系中,低浓度的外源性 CO(14M)可以显著性降低旁细胞中 DSB（标志蛋白 53 BP1 检测）以及微核的产生。随后的机理研究显示：针对 NO 信号通路，低浓度的外源性 CO(14M)并不影响受辐射细胞产生和释放

26、NO 的能力，但是外源性 CO 使得旁细胞对细胞间信号分子（NO）的应答能力下降，且旁细胞中 NADP(H)酶所产生 ROS 的量也被 CO 降至本底水平27。1.4 本项申请的意义 1.4 本项申请的意义 先前开展的研究在二维尺度模型上，证实了 CO 可以有效调控辐射旁效应的信号传导。本申请将延续此项研究,在三维培养细胞团簇模型(3-D cultured multicell cluster model)和人工构建皮肤组织块模型（reconstructed normal human skin tissue）中，探讨低浓度的外源性 CO 对辐射旁效应信号在三维尺度传递的调控作用，以及作用规律和可

27、能的机理。针对辐射旁效应所导致的 DNA（和染色体）断裂、细胞增殖和凋亡、炎症信号通路启动和基因突变这几个与癌症诱发紧密相关的方面探讨低浓度的外源性 CO 对辐射旁效应信号在三维尺度传递的调控作用，以及作用规律和可能的机理。针对辐射旁效应所导致的 DNA（和染色体）断裂、细胞增殖和凋亡、炎症信号通路启动和基因突变这几个与癌症诱发紧密相关的方面，分析：（1）不同浓度 CO 对辐射旁效应信号传递的影响和作用规律；（2）通过是否调控细胞间隙通信联结（GJIC）,细胞内 ROS 的产生，细胞间（或细胞内）NO 信号通路或 NF-B/COX-2 炎症信号通路的激活等方面，研究 CO 的作用机理。这些研究

28、结果将对于今后开展活体哺乳动物和人体实验提供理 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 论依据和指导，对于将 CO 应用于临床放疗的辐射保护中，调控辐射诱发细胞间损伤信号的传递，减少辐射的非直接作用对癌症的诱发，有着重要的意义。参考文献：参考文献：1.Secondary cancer after radiotherapy for prostate cancer:should we be more aware of the risk?Bostrom PJ,Soloway MS,Euro Urology,52,973-982,2007.2.Emerging role of radiati

29、on induced bystander effects:Cell communications and carcinogenesis.Baskar R,Genome Integrity,13,2-8,2010.3.Radiation Induced Bystander Effect in vivo,Chai Y and Hei TK，Acta Med Nagasaki.53,S65-S69,2008.4.Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum.Mancuso M,Pasqua

30、li E,Leonardi S,Tanori M,Rebessi S,Di Majo V,Pazzaglia S,Toni MP,Pimpinella M,Covelli V and Saran A.PNAS,105,12445-12450,2008.5.Cell Proliferation as a Major Risk Factor for Cancer:A Concept of Doubtful Validity,Emmanuel Farber and Butterworth BE,Cancer Res,55.3759-3762,1995.6.Stress signaling from

31、irradiated to non-irradiated cells.Azzam EI and Little JB,Curr.Cancer Drug Targets,4,53-64,2004.7.Mechanism of radiation-induced bystander effect:Role of the cyclooxygenase-2 signaling pathway.Zhou H,Ivanov VN,Gillespie J,Geard CR,Amundson SA,Brenner DJ,Yu Z,Lieberman HB and Hei TK,PNAS,102,14641-14

32、646,2005.8.Mitochondrial function and nuclear factor-B-mediated signaling in radiation-induced bystander effects.Zhou H,Ivanov VN,Lien YC,Davidson M and Hei TK,Cancer Res,68,2233-2240,2008.9.Role of TGF-1 and nitric oxide in the bystander response of irradiated glioma cells.Shao C,Folkard M and Pris

33、e KM,Oncogene,27,434-440,2008.10.Constitutive nitric oxide acting as a possible intercellular signaling molecule in the initiation of radiation-induced DNA double strand breaks in non-irradiated bystander cells.Han W,Wu LJ,Chen SP,Bao LZ,Zhang LL,Jiang EK,Zhao Y,Xu A,Hei TK and Yu ZL,Oncogene,26,233

34、0-2339,2007.11.DNA double-strand breaks form in bystander cells after microbeam irradiation of three-dimensional human tissue models.Sedelnikova OA,Nakamura A,Kovalchuk O,Koturbash I,Mitchell SA,Marino SA,Brenner DJ and Bonner WM.Cancer Res,67,4295-4302,2007.12.Induction of a bystander mutagenic eff

35、ect of alpha particles in mammalian cells.Zhou H,Randers-Pehrson G,Waldren CA,Vannais D,Hall EJ and Hei TK,PNAS,97,2099-2104,2000.13.Assessment of low linear energy transfer radiation-induced bystander mutagenesis in a three-dimensional culture model.Persaud R,Zhou H,Baker SE,Hei TK and Hall EJ.Canc

36、er Res,65,9876-9882,2005.14.Demonstration of a radiation-induced bystander eVect for low dose low LET beta-particles.Persaud R,Zhou H,Hei TK,and Hall EJ，Radiat Environ Biophys,46,395-400.2007.15.Ionizing radiation induces DNA double-strand breaks in bystander primary human fibroblasts.Sokolov MV,Smi

37、lenov LB,Hall EJ,Panyutin IG,Bonner WM and Sedelnikova OA,Oncogene,24,7257-7265,2005.16.The time dependence of bystander responses induced by iron-ion radiation in normal human skin fibroblasts.Yang H,Anzenberg V and Held KD,Radiat Res,168,292-298,2007.17.The time and spatial effects of bystander re

38、sponse in mammalian cells induced by low dose radiation.Hu B,Wu L,Han W,Zhang L,Chen S,Xu A,Hei TK and Yu Z,Carcinogenesis,27,245-251,2006.18.Targeted cytoplasmic irradiation induces bystander responses.Shao C,Folkard M,Michael BD and Prise KM,PNAS,101,13495-13500,2005.19.Biological effects in unirr

39、adiated human tissue induced by radiation damage up to 1 mm away.Belyakov OV,Mitchell 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 SA,Parikh D,Randers-Pehrson G,Marino SA,Amundson SA,Geard CR and Brenner DJ,PNAS,102,14203-14208,2005.20.Irradiation induces DNA damage and modulates epigenetic effectors in distant bystan

40、der tissue in vivo.Koturbash I,Rugo RE,Hendricks CA,Loree J,Thibault B,Kutanzi K,Pogribny I,Yanch J C,Engelward BP and Kovalchuk O,Oncogene,25,4267-4275,2006.21.Carbon monoxide:endogenous production,physiological functions,and pharmacological applications.Pharmaco Rew,Wu L and Wang R,57,585-630,2005

41、.22.Heme oxygenase-1/carbon monoxide:from basic science to therapeutic applications.Ryter SW,Alarm J and Choi AM,Physiol Rev,86,583-650,2006.23.Carbon monoxide-releasing molecules:characterization of biochemical and vascular activities.Motterlini R,Clark JE,Foresti R,Sarathchandra P,Mann BE and Gree

42、n CJ,Circ Res,90,e17-e24,2002.24.Carbon monoxide has anti-inflammatory effects involving the mitogen-activated protein kinase pathway.Otterbein LE,Bach FH.,Alam J,Soares M,Lu HT,Wysk M,Davis RJ,Flavell RA and Choi AM,Nature Med,6,422-428,2000.25.Carbon monoxide produced by heme oxygenase-1 in respon

43、se to nitrosative stress induces expression of glutamate-cysteine ligase in PC12 cells via activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Nrf2 signaling.Li MH,Jang JH,Na HK,Cha YN and Surh YJ,JBC,282,28577-28586,2007.26.Exogenous carbon monoxide protects the bystander Chinese hamster ovary cells in

44、 mixed co-culture system after alpha-particle irradiation.Han W,Wu L,Chen S and Yu KN,Carcinogenesis,31,275-280,2010.27.Mechanism of protection of bystander cells by exogenous carbon monoxide:impaired response to damage signal of radiation-induced bystander effect.Han W,Yu KN,Wu L,Wu Y and Wang H,Mu

45、tat Res,in press.2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）2.1 研究内容 2.1 研究内容 本项目将重点研究：低浓度外源性 CO（来自 CO 释放药物 CORMs）对辐射诱发的细胞间（旁效应）信号，在三维培养细胞团簇模型(3-D cultured multicell cluster model)和人工构建皮肤组织块模型中传递的调控作用、作用规律和相关机理。研究方案的设计原则为：在细胞团簇模型中开展大量的作用规律和机理方面研究，研究结果放在三维组织模型中进行验证，并挖掘与细胞团簇模型中的

46、不同之处在细胞团簇模型中开展大量的作用规律和机理方面研究，研究结果放在三维组织模型中进行验证，并挖掘与细胞团簇模型中的不同之处。（1）三维培养细胞团簇模型中 CO 对辐射旁效应的调控作用研究：（1）三维培养细胞团簇模型中 CO 对辐射旁效应的调控作用研究：三维培养细胞团簇模型系由单层培养的细胞酶解后制成细胞悬液，然后通过离心的方法形成。形成的多细胞团簇（multicell cluster）可以模拟组织中的微环境，细胞间可以形成正常的间隙通讯联结。多细胞团簇可以选择遗传背景清晰，具有各种操作优势的培养细胞制成。所以利用多细胞团簇，既便于利用二维培养细胞中各种成熟的研究方法和相关基础，又可以模拟三

47、维尺度组织，开展深入的 CO 作用规律和相关机理研究利用多细胞团簇，既便于利用二维培养细胞中各种成熟的研究方法和相关基础，又可以模拟三维尺度组织，开展深入的 CO 作用规律和相关机理研究。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 在具体研究中，针对 DNA（和染色体）断裂、细胞增殖和基因位点突变这几个与癌症诱发紧密相关的方面，开展调控作用和作用规律的研究。通过对比有无 CO 处理时，旁效应引发这些生物学终点的变化情况，确定不同浓度 CO 对旁效应的调控作用效果。（2）人工构建皮肤组织模型中 CO 对辐射旁效应的调控作用研究：（2）人工构建皮肤组织模型中 CO 对辐射旁效应的调控作用研

48、究：人工构建皮肤组织具备皮肤微结构，具有保留体内分化模式，可释放细胞因子等特点。在人工构建皮肤组织中，将验证于多细胞团簇中得到的结果，使相关研究结果更加接近于正常生理状况。在具体研究中，针对 DNA（和染色体）断裂和细胞凋亡这些旁效应引发的生物效应，将三维培养细胞团簇模型中得到的研究结果，放入人工构建皮肤组织模型中进行验证，对比两者在调控作用规律上有无异同。（3）CO 对辐射旁效应三维尺度传递的调控机理研究（3）CO 对辐射旁效应三维尺度传递的调控机理研究 机理研究首先在三维培养细胞团簇模型中大量开展，瞄准目前已发现的辐射旁效应信号传递的通道和信号通路，如 GJIC,细胞内 ROS 的产生，细

49、胞间（或细胞内）NO 信号通路，MAPK 信号通路以及 NF-B/COX-2 炎症信号通路等，探讨 CO 是否是通过调控其中的一个或几个通路，阻断了辐射旁效应的传递，以及 CO 在可调控通路中的关键作用位点。得到的相关结果可以为 CO 在三维组织模型中的作用研究提供坚实的基础，并廓清具体研究的范围。2.2 研究目标 2.2 研究目标（1）摸清低浓度外源性 CO 在三维细胞团簇和人工构建皮肤组织模型中，对辐射旁效应信号是否具有调控作用，以及作用规律；（2）探索 CO 对辐射旁效应信号调控的作用机理，寻找 CO 在可调控通路中的关键作用位点。评估低浓度外源性 CO 在电离辐射非直接效应（旁效应）中

50、的保护作用，为降低放射治疗后非辐射区域原发性二次癌症的发生率，寻找突破口。2.3 拟解决的关键科学问题 2.3 拟解决的关键科学问题（1）外源性 CO 在三维尺度模型中，对旁效应信号的调控以及对旁细胞的保护作用，是否类似于在二维培养细胞模型中的作用，有何具体差异；国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 （2）阐明 CO 调控旁效应信号三维尺度传递的作用机制和关键作用位点，为 CO 作为新型辐射防护药物的探索提供新的理论基础和实验依据。3.拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）3.1 研究方案（1）三维培养细胞