基于秀丽隐杆线虫的水毒性评估技术研究进展.pdf

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1、中图分类号:114文献标识码:A文章编号:1673 7830(2014)04 0176 05 综述 基于秀丽隐杆线虫的水毒性评估技术研究进展孔庆征高珊【摘要】工业废水与生活饮用水对人类的健康有着巨大的影响，秀丽隐杆线虫是水的毒性研究的一种理想的模式生物。用线虫进行水毒性研究及评价，具操作简单，成本低廉，测试周期较短等诸多优势，现介绍国内外用线虫评价水毒性的一些常用指标及意义，对国内开展线虫毒性研究与评价具有一定的指导意义及参考价值。【关键词】秀丽隐杆线虫;水;毒性;评价指标作者单位:100013，北京市疾病预防控制中心/北京市预防医学研究中心(孔庆征、高珊);首都医科大学(孔庆征)通讯作者:高

2、珊，研究方向:安全性毒理学评价，模式生物毒理学随着工业的飞速发展，环境污染已经成为现代社会一项重要的话题，工业废水与生活饮用水与人们的生活息息相关，对人类的健康有着巨大的影响。秀丽隐杆线虫(C elegans，以下简称线虫)是水的毒性研究一种理想的模式生物:其具有遗传与发育背景简单，生命周期短，易于培养，虫体小且半透明易于观察等特点，操作简单，成本低廉，测试周期较短，有深入的生物学研究基础，有敏感的生物标志物筛选指标等诸多优势1。在水毒性评估的研究中，线虫观察终点和常用指标可被分为两类:致死性(急性毒性)和非致死性指标(亚急性毒性)。致死性指标包括:致死率，最长寿命天数及半数致死天数等;非致死

3、性指标有:生殖、摄食、运动行为和化学趋向性等指标2，在未来，还需建立和健全以线虫为模型动物的水毒性的评估体系。1线虫作为水毒性研究的特点与优势随着科学和工业的飞速发展，环境污染已经成为现代社会亟待解决的难题，这其中，水对环境的污染是人们非常关注的方面，无论是工业废水还是生活用水的排放与处理，都与人们的生活息息相关，对人类的健康有着巨大的影响，因此，水中的毒物及毒物剂量的测定，成为了人们研究的重点。近年来，国内外一系列检测环境污染程度和评价毒物毒性的方法被不断提出。如应用环境化学分析，包括高效液相色谱法、气相色谱法、化学分析法等，被广泛的应用。但是，这些传统的分析方法有很多不足之处，实验周期长，

4、实验代价高，不能广泛地、快速地用于毒物毒性与环境质量的评估，这些都制约着传统方法的进步。基于这种情况，近年来，一些新颖的研究被逐渐的开发出来。在环境科学与毒理学研究方面，线虫、斑马鱼、大型蚤等模式生物，因其操作简单，成本低廉，测试周期较短等诸多优势被广泛应用，其中，线虫以它特殊的生物、生理特性越来越受到学者的青睐。利用秀丽隐杆线虫作为环境科学和毒理学方面研究的模式生物，具有其他模式生物不可比拟的优势，在生态毒理学的研究中，线虫是一种理想的模式生物，它具备以下条件:生活周期短，繁殖快，生长迅速，易于实验室培养。与小鼠相比，线虫的世代时间只有 5 d，而小鼠需要 2 3 个月;线虫的生殖方式为孤雌

5、生殖，不需要雌雄交配;线虫的繁殖量极大，单个产卵周期单个亲体产子代数有 200 300 个，远远超过小鼠的繁殖量;线虫的培养方式为液体或固体培养，生活环境为培养基，食物主要为大肠杆菌，而小鼠需要笼架饲养，还要有专业人员饲养。所以，在所占空间和经济方面的考虑，线虫的价值远远大于小鼠;深入的生物学研究基础，获得了较充分的毒性研究数据。目前，针对线虫的生物学研究非常多，有了初步的基础。到 20 世纪90 年代中期，人们已经建立了完整的线虫从受精卵到成体细胞的谱系图，它揭示了雌雄同体线虫全部1 090个细胞的身世和命运。线虫染色体数目少(2 n=12)，基因组小(8 107bp)，约有 13 500

6、个基因，十分适于针对特定的毒理研究开展全基因组筛选。线虫基因组中约有 40%的基因与人基因组同源，提示基于线虫的毒理学研究将很大程度上反映毒物可能导致的对人体的毒害。敏感的生物标志物筛选指标，如行为指标中有运动、摄食等，生理指标包括生长、繁殖、发育等，生化标志物主要包括蛋白、酶活性及 DNA 分子水平的变化，目前，线虫的生化标志物有卵黄原蛋白(Vitellogenin，VTG)、细胞色素450(CytochromeP450)、谷胱甘肽 S-转移酶(GlutathioneS-transferase，GST)、热休克蛋白(Heat Shock Proteins，671首都公共卫生2014 年 8

7、月第 8 卷第 4 期Capital Journal of Public Health，Aug 2014 Vol.8No.4HSP)等。线虫是安全的便于操作的模式生物。线虫生活在土壤中，体长约 1 mm 左右，以细菌为食，对实验人员无伤害性，通体透明，十分利于分析细胞谱系的变化及揭示和追踪毒物的神经毒理1 4。线虫不仅可以生活在土壤中，在水中也能生存，因此可作为分析土壤环境与水环境污染及相关毒理的有价值的模式生物。目前，国内外研究者已经成功地将线虫用于土壤与水环境中毒物毒性评估与毒理学研究5 7。2应用线虫进行水毒性评估的观察终点或常用指标在水毒性评估的研究中，秀丽隐杆线虫扮演着重要的角色。在

8、众多的观察终点和常用指标中，可分为两类:致死性(急性毒性)和非致死性指标(亚急性毒性)。致死性指标包括:致死率(lethality)，最长寿命天数及半数致死天数等;非致死性指标有:生殖、摄食、运动行为和化学趋向性等。下面列举常用于水毒性评估的指标。2.1致死性指标2.1.1致死率的应用与分析:水中的毒物浓度积累到一定程度会导致水中暴露的秀丽线虫死亡，产生致死作用3。在评价毒物的致死效应中，致死率是一个十分重要的指标。在致死率中，常用的参数包括LC10、LC20和 LC50，分别代表导致 10%、20%和 50%动物死亡所需要毒物的浓度。致死率的研究可用于多种方面，评估重金属、有机物及药物的急性

9、毒性和致死效应。在城市废水或工业废水、土壤与淤泥环境中毒物组分毒性评估中均有广泛应用3 8。关于废水中的重金属离子，在柯翎9 的 4 种重金属离子对线虫急性毒性的 研 究 中，实 验 人 员 在 每 个 培 养 皿 中 放 入40 条线虫，置于 25 下染毒，24 h 后观察结果，估算得出各重金属离子的 100%致死浓度和最大耐受浓度，之后，将每个重金属溶液稀释成 6 个浓度梯度，加入 150 250 跳线虫，24 h 后，观察并记录死亡线虫数和存活线虫数，统计死亡率。结果发现:重金属离子中，如 Cu2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+等，浓度越高，毒性越强，线虫死亡率越高。在高浓度组中线虫的中

10、毒反应较迅速，短期内就出现死亡;而在低浓度组，重度反应较缓慢，经较长时间才出现死亡。秀丽线虫致死率的分析方法简单、实验周期短、见效明显，是利用秀丽线虫分析毒物毒性的基本评价参数。线虫致死率常与其他评价参数同时使用，以反映环境毒物的急性毒性10。2.1.2最长寿命(Maximum lifespan)与半数致死天数(Mean lifespan)的应用及分析:生命周期及半数致死率是对受试生物进行毒性分析的首选指标。最长寿命指测试秀丽线虫群体可以生存的最长天数，半数致死天数是测试秀丽线虫群体中活体动物数目占测试动物总数一半时的天数。目前，最长寿命与半数致死天数已被用于评估银、镉、镍、铅、钡、铬、锌、铜

11、等重金属对秀丽线虫寿命的毒性影响7，11 12。该指标同样可被用于评价工业废水中有机化合物的毒性。根据王晓祎等13 研究，PTA 废水，也就是精对苯二甲酸(Purified Terephthalic Acid)中，主要含有对苯二甲酸、甲基苯甲酸、对二甲苯、苯甲酸等。经660 mg/L 浓度的废水暴露后，暴露的线虫生命周期从23 d 缩短到21 d，半数致死天数也从11.5 d缩短到 11 d。无论是线虫生命周期还是半数致死天数，实验组数据跟对照组数据相比差异有统计学意义(P 0.05)，这表明 PTA 废水不仅对线虫生命周期有一定的影响，而且对线虫具有一定的亚急性毒性。而王晓祎3 另一项研究也

12、证明，寿命及半数致死率是针对线虫在内诸多受试生物进行毒物分析的首选指标。由上述研究可见，最长寿命、半数致死天数与致死率之间可以结合起来一起考察毒物的毒性。在毒物的短期暴露中所引起的短期效应中，主要参考的是致死率的指标，而在毒物短期暴露的长期效应中，最长寿命和半数致死天数为主要考虑的指标，二者在应用价值上是相互补充的。但是，由于毒物毒性的快速考察和评价的要求相比，最长寿命与半数致死天数的测试实验周期相对略长、工作量大，所以这项研究而更适合对毒物毒理的深入追踪。2.2非致死性指标2.2.1生殖(eproduction)的应用及分析:秀丽线虫的生殖能力可以用以下 3 个指标进行评价:世代时间(Gen

13、eration time)、后代数目(Brood size)及子宫内卵的数目。世代时间主要用于考察秀丽线虫的繁殖能力，而子宫内卵的数目可以同时考察繁殖能力与产卵器的生理功能，用于评估生殖能力的 3 个指标可以适用不同浓度、不同暴露时间毒物毒性的评价。目前生殖能力评价指标已被广泛应用于重金属和工业废水的毒性的分析14 16。当秀丽线虫暴露于重金属溶液后，通常世代时间明显延长，后代数目明显减少。在研究 PTA(精对苯二甲酸)废水对线虫生殖影响过程中，科研人员发现，对照组线虫的产卵时间大约是 64.5 h，而经 PTA 废水暴露后，其产卵时间延迟约771首都公共卫生2014 年 8 月第 8 卷第

14、4 期Capital Journal of Public Health，Aug 2014 Vol.8No.41 h，且之间差异有统计学意义(P 0.05)，由此可见，PTA 废水对线虫的生殖有一定影响。而王晓祎3 对造纸厂废水中酸碱类毒物的研究中，存在有大量毒物的废水，无论是经过酸处理、碱处理还是过滤后的废水，经过暴露后，都能对线虫的生殖能力产生影响，使线虫的产卵个数下降 50%以上。其中，易受酸性影响的毒物对于线虫生殖能力的影响更严重。2.2.2运动行为(Locomotion behavior)的应用及分析:运动行为可以看作反映神经系统功能的指标，秀丽线虫的运动行为包括:身体弯曲频率(Bod

15、y bend)、头部摆动频率(Head thrash)、基本运动能力(Basicmovement)与运动速率(Locomotion rate)。另外，消化能力(Digestive ability)与咽泵运动(Pharyngeal pump)有时也会被用于分析秀丽线虫运动代谢与运动能力状态2。运动行为可以看作反映神经系统功能的指标，已被广泛应用于重金属比如银，镍，铜，钡的神经毒性分析中15 18。在有机农药废水和 PTA 废水的研究中，结果均证明了此项指标的价值。比如在 Anderson的实验中，根据 4 h 的暴露后线虫运动行为的改变，如线虫的头部摆动频率，线虫的身体弯曲频率等指标，来评估一系

16、列的浓度梯度的化学物，包括重金属，杀虫剂，有机溶剂等的毒性大小19。线虫的运动行为的测定有以下特点:操作简单，易于观察，敏感性高，实验周期短，实验成本低，同时，在不同浓度，不同暴露时间毒物毒性评价过程中，该指标也可适用。有研究表明，某些实验已开始着手利用线虫的运动行为建立处于水相的动态检测系统，今后可用这种体系进行远程环境生态监控20。需要注意的是，在分析运动行为时，线虫长时间处于饥饿状态可能会影响实验结果21。综上所述，以上指标均为在水毒性评价研究中常用的观察终点及指标，而其他指标如摄食、记忆行为和化学趋向性行为等，在水毒性研究中涉及不多，故不在讨论范围之内。3基于线虫的水毒性评价国际标准的

17、介绍(ISO10872 Water quality-Determination of the toxic effectof sediment and soil samples on growth，fertility andreproduction of Caenorhabditis elegans)近年来，随着线虫的环境毒物毒性评估研究体系的不断完善，ISO 在此基础上颁布了一系列的标准化指南，为线虫的毒理学研究提供了非常宝贵的参考。早在 2001 年，ASTM(美国材料与试验协会)就颁布了将线虫用于土壤毒理学评价的标准化指南。ISO 在2007 年颁布，并于 2010 年再次修订了利用秀丽隐

18、杆线虫进行土壤和水质评估的标准。现将此标准介绍如下。此标准的主要实验过程是:线虫食物(大肠杆菌)准备工作。根据需求将 50 ml 的无菌 LB 培养基注入 250 ml 的瓶中，瓶中装有 20 l 大肠杆菌，每个瓶子需要在 37 的摇床上培养 17 h。调整孵化后细菌的密度，以 1 10 加入 LB 缓冲液使细菌悬浮液并且测定在 600 nm 处 的 光 密 度。在 ISO 7027 的 FAU(Formazine absorption units)中细菌悬浮液的浑浊度有着明确的标准。OD600 通常大于 200 FAU。经过离心(20 min，2 000 r/min)后，去除上浮物质，在 M

19、9 缓冲液中再悬浮。之后重复。当检测水质时，用 M9 缓冲液将细菌密度调整至(1 000 50)FAU。实验组和对照组的准备。每种实验物质准备 4 个平行样和 4 个对照。在实验开始之前，向每个样品中加入 0.5 ml 的食物介质，搅拌使之均匀。正式实验。实验开始后，用毛细管将 10 只处于 F1 期的线虫幼虫取出，加入到有实验物质和食物的实验组中。不能加入不能活动的线虫。之后，用粘合剂将多空板封住，置于黑暗中，培养环境为 25 左右。96 h 后，加入 0.5 ml oseBengal 溶液使线虫外皮得到染色。结束时，在 80 的箱子中加热10 min。这样处理的好处是虫子容易被测量。这种样

20、品在(8 2)的环境下可以保存 8 周。此标准中实验的指标主要是以下 4 个:复苏率、雄性出现的概率、繁殖力、单个生产能力。复苏率:计数暴露后复苏的线虫的个数，除以总的线虫数目，得到复苏率。雄性出现的概率。雄性线虫出现的概率很低。计数每组中雄性的数量，在身长测定和繁殖力测定中可以排除雄性的干扰，因为雄性线虫体长远远小于雌雄同体的线虫，并且不会产卵。记录雄性的个数以及雄性出现的概率。繁殖力。经过实验暴露的线虫从培养皿中取出。在显微镜下(100 倍)测量线虫的身长并且观察线虫身体中是否有卵存在。如果线虫体内有超过一个卵即可认为存在生殖能力。计算每组线虫的平均体长备用。记录每组中的身体中存在卵的线虫

21、的个数，除以实验加入的线虫数即可得到繁殖力的数据。单个线虫生产能力。用显微镜记录线虫产生后代的数量，除以最初线虫的数量，得到每个线虫产生后代的个数。在实验的结果判定时，还有实验有效性标准的限定，满足下列条件后的实验才能被认定有效:实验组871首都公共卫生2014 年 8 月第 8 卷第 4 期Capital Journal of Public Health，Aug 2014 Vol.8No.4的平均复苏率为对照组的 80%120%范围内。对照组中雄性出现率在 10%以下;单个实验组中雄性出现率在 20%以下。对照组中平均繁殖率超过 80%。对照组中平均单个线虫生产能力 30。此标准的实验周期约

22、为9 h。实验参考日程如下:实验前第 4 天:准备有细菌铺板的琼脂培养皿。实验前第 3 天:将线虫加入上述的培养皿中。实验前第 2天:测定实验物质和对照物质的干重。实验第 1 天:食物媒介的准备，把食物加入实验物质和对照物质中，线虫同步化，将线虫加入实验材料中，测量最初的身长。实验第 4 天:加入 ose Bengal 溶液，终止实验，在分析前储藏在(8 2)的环境中。4展望作为一种新型的模式生物，国际上对线虫的研究越来越多。而在国内生命科学相关领域，对线虫的研究也有了诸多的进展。目前，线虫已经应用于急性毒性试验、慢性毒性试验、环境风险评价、环境污染物生物累积试验。但是，对于线虫更敏感生物标志

23、物的寻找，以及技术方法改进还亟待深入。对于水毒性的研究，未来可能的研究方向有以下几个方面:逐步研究并开发更多的以线虫为模型动物的水的毒性的评估指标;针对水中可能的有害物质，选择适当的敏感的评估指标;形成一系列基于线虫的水的毒性的评估体系，并验证此体系的实用性、准确性、敏感性。当然，以线虫为模式生物做毒理学评价仍然有以下不足:由于环境中水污染物的种类、性质具多样性和复杂性，而目前的研究多关注于线虫对于单一污染物的毒理学评价。与所有动物实验一样，种属差异是研究及结果判定中需要解决并深入思考的问题。各种生物标志物的应用及基因技术的加入将会完善线虫在水毒性评价中的应用，但线虫的生物标志物研究大多方法复

24、杂，还需要进一步优化检测方法，以便应用。综上，把线虫作为模式生物来研究水毒性评价的研究方法日趋成熟。其中线虫的致死率，最长寿命与半数致死天数，可以作为急性毒性的观察指标。生殖，运动行为等指标，可作为亚急性毒性观察终点。目前，基于线虫的水安全性毒理学评价在国际上已广泛的开展，国内基于线虫的毒理研究也在逐步深入并完善。全世界的线虫研究者始终坚持材料、资源、信息和数据的无偿共享，使这一领域的研究得以飞速发展。未来，线虫将在水安全性毒理学评价及研究领域做出更大贡献。参考文献1 秦峰松，杨崇林 小线虫，大发现:Caenorhabditis elegans在生命科学研究中的重要贡献 生命科学，2006，1

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30、9 2147 15 Swain SC，Keusekotten K，Baumeister B，et al C elegans971首都公共卫生2014 年 8 月第 8 卷第 4 期Capital Journal of Public Health，Aug 2014 Vol.8No.4metallothioneins:new insights into the phenotypic effects ofcamium toxicosis J Mol Biol，2004，341(4):951 59 16 蔡克周，刘雪兰，郭巧芝，等 空气负离子暴露对秀丽线虫(Caenorhabditis elegans

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32、aenorhabditis elegans Environ Toxicol Chem，2000，19(12):3061 3067 19 Anderson GL，Cole D，Williams PL Assessing behavioraltoxicitywithCaenorhabditiselegansEnvironToxicolChem，2004，23(5):1235 40 20 Gerhardt A，Schmidt S，Hoss S Measurement of movementpatterns of Caenorhabditis edegans(Nematoda)with theMult

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34、d fractionsEnvironToxicol Chem，2003，22(5):1100 1106(收稿日期:2014 02 23)中国食品卫生杂志 2015 年征稿征订启事中国食品卫生杂志 创刊于 1989 年，由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会主管，中华预防医学会、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所主办，国内公开发行。为中文核心期刊、中国科技核心期刊。被中国知网(CNKI)中国期刊全文数据库收录。2011 年版影响因子 1.031，在预防医学领域影响因子连续 8 年排前 7名。是中国食品卫生专业唯一的核心期刊。该杂志于 2003 2004、2005 2006 和 2007 20

35、08 年度连续获得中华预防医学会优秀期刊一等奖;获得卫生部首届医药卫生优秀期刊三等奖。所设栏目:专家述评、论著、研究报告、实验技术与方法、监督管理、调查研究、食品安全标准、风险评估、风险交流、食物中毒、综述等，及时报道食品卫生领域的最新科研动向、食品安全监管、事件处理以及国内、国际有关食品卫生的政策、法律法规和标准等最新信息。刊发周期:审稿通过后 3 个月左右能刊出。对具有创新性的优秀论文开绿色通道，加急审稿、优先发表。欢迎投稿、欢迎订阅。在线投稿:http:/www zgspws com订阅:由北京报刊发行局发行，邮发代号为82 450。双月刊，每期定价28 元，全年168 元。可汇款到编辑部订阅过刊(免费邮寄、挂号加收 3 元)。地址:北京市朝阳区潘家园南里 7 号 行政楼 208 室 中国食品卫生杂志 编辑部电话/传真:010 67791542邮政编码:100021E mail:spws462163 com081首都公共卫生2014 年 8 月第 8 卷第 4 期Capital Journal of Public Health，Aug 2014 Vol.8No.4