生物技术及生物产品的检验方法和质量标准.pdf

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1、 规范：生物技术产品及生物制品的测试方法和认可标准规范：生物技术产品及生物制品的测试方法和认可标准 1 引言 11 目的 本指导原则提供了一整套尽可能统一的生物技术产品和生物制品的国际规范，并阐述其制订的背景和理由，以支持新制品的上市申请。12 背景 规范是由一系列试验、有关分析方法和认可的标准组成，它以限度值、范围或其他测试指标予以表示。本文件制订了一套与其用途相适应的原料药、制剂和生产阶段所用的其他材料都应遵循的认可标准。符合规范是指原料药和制剂按所列分析方法测定，符合认可标准。规范是重要的质量标准，它由生产商提出和验证、管理机构批难，并作为批准产品的依据。规范是保证产品质量和一致性总方案

2、的组成部分。其他方面包括开发阶段依据规程对产品进行全面鉴定、按 GMP 要求生产、生产工艺的论证、原材料的测试、生产过程中的检测和稳定性试验等。规范是用以确保原料药和制剂质量的，而不是确定产品的全部特性。因此，规范的制订应着重研究在保证产品安全有效方面有意义的分子结构和生物学特征。13 范围 本指导原则适用于蛋白质、多肽及其衍生物和含有这些成分的产品(如与其形成的结合物)。这些蛋白质和多肽由基因重组或非重组细胞培养表达系统生产，可高度纯化，并可用一套适宜的分析方法予以鉴定。本指导原则也适用于从动物组织或体液中分离的蛋白质和多肽。但其适用性应与有关质量管理机构协商。本指导原则不涵盖抗生素、合成肽

3、和多肽、肝素、维生素、细胞代谢物、DNA 产品、过敏原提取物、常规疫苗、细胞制品、全血和血细胞成分。对于化学物质，ICH 在“规范：新原料药和新制剂的试验方法和认可标准：化学物质”一文中已作介绍。本文件不介绍具体的试验方法和认可标准，也不适用于临床前和/或临床研究的样品。2制订规范的原则 21 鉴定 应制订合适的规范，采用适宜的技术鉴定生物技术产品和生物制品的物理化学性质、生物活性、免疫化学性质、纯度和杂质。认可标准的建立和论证应依据临床前和/或临床研究中所用批次获得的数据、批与批之间一致性的数据、稳定性研究数据和相应的开发资料。在产品的开发阶段，需要对其进行详尽的鉴定工作。产品的工艺如有明显

4、改变，必要时，也需对产品进行详细鉴定。在申报时，如有参比标准品，产品应与其进行比较；如有可能，最好将产品与其自然成分作比较。生产商在申报时应建立经标化的内部参比物，供生物学和物理化学检测用。新的分析技术在不断发展，现有的分析方法在不断改进，应合理采用。211 物理化学性质 211 物理化学性质 对目标产品物理化学性质的鉴定一般包括组分测定、物理性质和一级结构测定。有时合适的物理化学方法可获得更高级结构的资料(可通过其生物学活性推测其可靠程度)。由于蛋白质是由活的生物体生物合成的，因此它会出现固有程度的结构异质性。目标产品可能是预期的翻译后修饰的各种形式的混合体(如：糖蛋白)，这种与预期结构不同

5、的其他形式可能有活性的，其存在也许不会对产品的安全性和有效性产生有害影响(见 214)。申报者应详细说明日标产品异质性的类型，并证明临床前与临床研究所用批次的一致性。如果已证明每批产品异质性的类型是固定的，就不必对异质混合体的每一种形式的活性、有效性和安全性(包括免疫原性)再作评价。原料药和制剂在生产和/或贮存过程中也会产生异质性，产品的异质性与质量有关，因此应鉴定其异质程度和概况，以确保批与批之间的一致性。当目标产品的变异体在活性、有效 性和安全性方面与目标产品相似时，应把它们看做产品的相关物质。当工艺改变或产品降解而导致异质体类型与临床前和临床开发所用产品不一致时，应对这些改变的影响作出评

6、价。物理化学性质的分析方法见附录 61，新的分析技术在不断发展，现有的分析方法在不断改进，应合理采用。对于产品的出厂检定，应从产品的鉴定方法中选出一些适宜的方法，并加以验证(见第 4节)。212 生物活性测定 212 生物活性测定 生物学性质的评价是确定产品全面特征的重要步骤。生物活性是反映生物学性质的重要方法，它是表示产品产生特定生物学效应的具体量值。申报者应提供测定生物学活性的有效生物测定方法，生物活性测定包括以下方法：测定产品对生物体产生生物反应的动物试验方法。在细胞水平上测定产品的生化和生理效应的细胞培养检测方法。利用酶反应速率或免疫相互作用诱导的生物反应等方法测定生物活性的生化检测方

7、法。其他如配体/受体结合试验也是可行的。效价(以单位表示)是利用与生物学性质相关的产品属性，对产品的生物活性进行定量测定。而量(以质量表示)则是对蛋白质含量的物理化学测定。模拟与临床相同的生物活性有时是不必要的，但是在药效学和临床研究中，需确立临床反应与生物学检测活性的相关性。生物测定结果应以国际或国家参比标准品的活性单位表示，在没有这种标准品时，应建立内部参考物质，各批次产品的测定结果以内部参考物质的单位表示。对于复杂的分子结构，获得的大量理化资料往往不能确定其高级结构，需从产品生物学活性加以推论。这时，应用可信限范围比较宽的生物学方法并结合具体的定量测定方法也许是可接受的。用物理化学方法取

8、代生物学方法测定产品的生物学活性必须具备以下条件：产品的高级结构可以完全用物理化学方法确立，并能证明与生物活性的相关性；已建立了完整的生产历史档案。当已证实理化方法与生物方法相关，并单独采用理化方法定量生物活性时，其结果应用质量表示。对于产品出厂检验(见第 4 节)，申报者应确定生物和/或理化的定量检测方法，并阐述其合理性。213 免疫化学性质213 免疫化学性质 当产品是抗体时，对其免疫性质应全面鉴定。用抗体与纯化抗原和抗原特定区结合试验来确定亲和力、亲和性和免疫反应性(包括交叉反应性)。如条件许可，应用生化方法确定抗原表位和带有相关抗原表位的靶分子。对于有些原料药和制剂，需用抗体识别蛋白分

9、子不同表位的免疫化学方法(如 ELISA，Western Blot)检测蛋白分子蛋白质的免疫化学性质可用于鉴别、均一性或纯度测定，也可用于定量。如应用免疫化学特性作出厂检验，则应提供抗体有关材料。214 纯度、杂质和污染物214 纯度、杂质和污染物 纯度 测定绝对纯度和相对纯度对于分析方法是有一定挑战性的，且其结果与所用方法密切相关。以往生物制品的相对纯度是用特定活性(每毫克生物制品的生物活性单位)表示的，但其结果亦与所用方法有关。因此，原料药和制剂的纯度一般是用几种方法合并估计的。由于生物技术产品及生物制品的分子特征和独特的生物合成过程，产品可含有几种分子实体或变异体。如这些分子实体来源于所

10、预期的翻译后修饰品，则应作为预期产品的一部分。预期产品在生产和/或储存过程中形成的变异体，如其性质与预期产品相似，应作为产品相关物质，而不是杂质(见 211)。对产品相关物质应分别制订单独的和/或总体的认可标准。i 对于批检验(见 4 节)，只需选用一部分适用的方法并阐明其纯度测定的合理性。杂质 除了对原料药和制剂(可能由预期产品和几种产品相关物质组成)的纯度进行评估外，申请者还应对可能出现的杂质作出评估。杂质可能与工艺有关，亦可能与产品有关。杂质的结构有的已知，有的部分阐明，有的是未知的。如果杂质有一定的数量，应尽可能予以鉴别，如条件许可，还应评估其生物学活性。工艺相关杂质是指生产过程中产生

11、的杂质，如细胞基质(宿主细胞蛋白、宿主细胞 DNA)、细胞培养物(诱导剂、抗生素或培养基成分)或下游工序产生的杂质(见附录 621)。产品相关杂质(如前体、某些降解产物)是在生产和/或贮存过程中产生的分子变异体，这些变异体在活性、有效性及安全性方面与预期产品相比，不占主导地位。制定杂质的认可标准要根据。临床前和临床研究批次的数据及生产一致性批次的数据而定。对产品相关和工艺相关的杂质应分别制订单独的和/或总体的认可标准。在某些情况下，对有些选择性杂质不必制订认可标准(见 23 节)。测定杂质的分析方法举例见盼录 62。新的分析技术在不断发展，现有的分析技术在不断改进，应合理采用。对于批检验(见节

12、 4)，只需从中选出一部分适用的方法，并阐明其合理性。污染物 产品污染物是指带入的外源性物质而不是生产工艺的一部分，如化学及生化物质(微生物蛋白酶)和/或微生物。应严格避免污染物，并用合适的认可标准或内控限值来控制其限度(见 23 节)。对外源性病毒和支原体污染，不宜采用内控限值的概念，而应考虑采用 ICH两个指导原则提出的原则，即“生物技术产品及生物制品质量：来源于人或动物细胞系生物 技术产品的病毒安全性评价”和“生物技术产品及生物制品量：用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和和鉴定”。215 含量 215 含量 含量一般用蛋白质测定表示，它对生物技术产品及生物制品至关重要。通常选

13、择合适的物理化学方法测定。有时还要证明所得量值直接与生物测定值相关。如已证实相关性，在生产过程中可测定含量而不测定生物活性。22 分析方法的有关问题 221 参比标准品和参考物质221 参比标准品和参考物质 新的分子实体作为药品申报，一般不可能获得国际标准品或国家标准品作对比。申报考应建立经鉴定的内部一级参考品，该参考品应用产品的代表性批次釉临床样品作为原料制备而成。用于产品批检验的内部工作参考品应用一统参考品标化。如能获得国际标准品或国家标准品，则应尽可能用其标化参考物质。进行生物学测定和物理化学检测用一种参考品是比较理想的，但有时也需要用各自的参考品。另外，对产品相关物质、产品相关杂质和工

14、艺相 关杂质有时亦需分别建立参考品。申报时应提供参考品制造和咸纯化的方法、参考品鉴定、贮存条件和稳定剂处方等有关资料。222 分析方法的认证222 分析方法的认证 申报者在向管理部门申报资料时，除用于生物技术产品和生物制品特有检测方法的特殊问题外，还应按 ICH 指导原则中的“分析方法的确证：定义与命多”和“分析方法的确证：方法学”的内容，对规范中的分析方法进行验证。23 工艺控制 231 与工艺有关的问题 231 与工艺有关的问题 完善的工艺设计和对生产能力的认识是开发一个可控的并能重复生产工艺的重要部分，它是生产出符合规范的原料药和制剂的保证。应根据从开发初期到生产规模生产的整个过程中所积

15、累的关键资料去调整各种合理的限度。对于某些杂质，通过研究证明其在工艺中可有效控制或去除，并达到可接受的水平，就不必再对原料药或制剂中的这些杂质进行检测，也不必收载到规范中去。依据地方管理规定，这种检测手段应在规模化生产时进行验证，如果在申报时还没有达到规模化生产，只能提供少量的验证数据，则这些工作可在产品批准上市后，依据地方管理规定进行。232 生产过程认可标准及内控限值 232 生产过程认可标准及内控限值 生产过程的测试应考虑原料药或制剂生产过程中起关键作用的步骤及确定工艺一致性数据的步骤及生产过程检测的结果可作为内控限值或认可标准。生产过程测试过的项目，在以后原料药或制剂的质控时就可免做(

16、231 节)。例如，在细胞培养末期，根据建立的认可标准，对生产过程的外源因子检测。用内控限值评估非关键工艺步骤的一致性也很重要。在开发和验证中获得的资料，可为建立生产过程的临时内控限值提供依据。制定这些限度是生产企业的责任，它可用于调查研究或为进一步采取行动的根据。当产品批准后，这些数据可进一步提炼，作为生产中的经验。233 原材料和赋形剂规范 233 原材料和赋形剂规范 用于原料药或制剂生产的原材料质量应符合与其用途相适应的标准。生物原材料或试剂应重点检测内源性或外源性有害因子。生产工艺采用亲和层析(如应用于单克隆抗体)时，应有适宜的措施以保证在生产和应用时，工艺相关杂质或潜在的污染物不致影

17、响产品的质量和安全性。所用抗体有关资料亦应提供。用于制剂(有时原料药)的赋形剂质量和容器确由系统应尽量符合药典标准。对药典没有收载的赋形剂亦应建立合适的认可标准。24 药典规范 药典的某些分析方法和认可标准，在认为合适时可作为原料药或制剂质控的一部分。适用于生物技术产品和生物制品的药典通则主要有无菌试验、“内毒素测定、微生物限度、容器容积、计量单位的均匀度和微粒物质检查。关于药典方法和认对标准的采用，在指导原则中亦体现了与药典分析方法的协调。药典有责任建立相同的或方法学上等价的试验方法和认可标准。25 出厂限度与货架寿命限度 可以采用“出厂限度对货架寿命限度”这一概念。这一概念是指原料药与制剂

18、的出厂限度要比货架寿命限度更严。例如效价和降解产物的限度指标就适用这一概念。有些地区，出厂限度仅指内控限度，不指管理部门批淮的货架寿命限度。26 统计学概念 应对定量的数据进行适宜的统计分析，并详尽明确地叙述所用统计分析方法的理由和原理，以便能对申报的具体数据进行独立运算。3规范制订理由 原料药及制剂所制订的规范是全面质量控制的重要部分，其他方面还包括原材料和赋形剂质控、生产过程的测试、工艺评估或验证、执行 GMP 的情况、稳定性试验、批问的一致性测试。综合这些全部要素，才能保证产品质量。必须明确，规范是保证产品质量的，而不是鉴定产品的。因此，生产商应提供采用或不采用特定质量属性的测试方法的理

19、由和难则。在制定科学合理的规范时，应考虑以下要点。规范与生产工艺有关 证明生产一致性批次的数据，是制订规范的基础。将规范与生产工艺相联系是至关重要的，特别是产品相关物质、产品和工艺相关杂质都与工艺有关。工艺改变及贮存过程中产生的降解产物可能导致临床前及临床研究中样品的异质性。要对这种改变的影响加以评价。规范应说明原料药和制剂的稳定性 在制定规范时，应考虑在贮藏过程中原料药和制剂可能发生降解。由于这些产品内在复杂性，很难用一种稳定性指标的检测方法或参数反映其稳定性全貌。因此，生产商要建议一种代表稳定性的指标，以确保产品质量改变时，在代表稳定性指标的结果上可反映出来。确定哪些试验适用于稳定性试验要

20、依据产品的特点而定。生产商可参考 ICH 指导原则中的“生物技术产品及生物制品的稳定性试验”。规范与临床前及临床研究相联系 应采用临床前及临床研究中所用批次的数据作为制订规范的依据。生产规模生产的样品质量应与临床前及临床研究时所用样品一致。规范与分析方法相联系 关键的质量属性，包括效价、产品相关物质、产品和工艺相关杂质的性质及含量等项目。这些项目可用多种方法进行测定，每种方法所的结果可能不尽相同。另外，在产品开发过程中，往往在开发时所得的数据是否与申报上市时的数据一致。4 规范 在规范中选用哪些试验项目是根据产品特点而定的。对建立的认可标准的限度范围要阐述其理由。认可标准的制订需根据临床前和/

21、或临床研究是个批样品的数据、用于证明生产一致性批次的数据、稳定性研究数据和有关开发的数据等资料。某些情况下，在生产阶段而不是在原料药或制剂阶段进行检验也是允许的。这是试验结果应视为再生产过程中的认可标准，并应根据地方药品管理部门的要求，将认可标准载入原料药和制剂的地方标准要求中去。41 原料药规范 一般情况下，原料药应考虑采用下列检验项目和认可标准（分析方法见 222）。有时，原料药也可采用药典的试验方法（如内毒素检测），也可建立其他原料药特殊的认可标准。411 外观状态 411 外观状态 定性叙述原料药的物理性状及色泽（如固体、液体）。412 鉴别 412 鉴别 原料药的鉴别试验方法应专一性

22、强，它是以原料药的特有分子结构和其他特性为基础的。鉴别一般需用(物理化学的、生物学的和/或免疫化学)一种以上的试验方法。鉴别试验只要求定性。在 21 节和附录 61 中介绍的应用于产品鉴定的某些方法，可以直接采用或修改后成为合适的鉴别方法。413 纯度和杂质 413 纯度和杂质 生物技术产品和生物制品的绝对纯度难以测得，并且所得结果与所用方法有关(见214)。因此，原料药的纯度一般应采用几种方法综合评估。分析方法的选择和优化主要 应考虑的因素是预期产品与产品相关物质和产品杂质的分离。杂质分为生产工艺相关杂质和产品相关杂质两类。原料药中的生产工艺相关杂质(见 214)包括细胞培养基、宿主细胞蛋白

23、、DNA、单克隆抗体或层析介质、溶剂和缓冲液成分。应采用合适的生产工艺使这些杂质降到最低含量。原料药中的产品相关杂质(见 214)是在生产和减贮存过程中产生、其性质与预期产品不同的分子变异体。对杂质而言，分析方法的选择和优化主要应考虑将预期产品和产品相关物质与杂质分开。在某些情况下，对有些选择性杂质不必制订认可标准(见 23)。414 效价 414 效价 有效的生物效价测定(见 212)是生物技术或生物原料药和/或制剂规范的组成部分。当制剂采用一种效价测定方法时(见 424)，其原料药可用另一种方法(物理化学或生物学方法)定量测定。在某些情况下，特殊活性测定的结果能提供额外的有用信息。415

24、含量 415 含量 应采用适宜的检测方法测定原料药的含量；一般采用蛋白质含量测定(质量)。含量测定往往不需要参比标准品或参考物质。在产品以效价表示时，不必另测含量。42 制剂规格 一般情况下，制剂可考虑应用下列检测项目和认可标准。421425 节中的每一节都可参考原料药项 411415 节。药典对各剂型的要求也适用于相关的剂型，如无菌、内毒素、微生物限度、容器容积、微粒物、剂量单位的均匀度、冻干制剂的水分含量等。有时，剂量单位的均匀度试验可作为生产过程的质控，并制订相应的认可标准。421 外观和性状 421 外观和性状 定性叙述制剂的物理性状(如固体、液体)、色泽、澄清度。422 鉴别 422

25、 鉴别 制剂的鉴别试验方法应专一性强，它是以制剂特有分子结构和其他特性为基础的。鉴别试验只要求能够定性，因此大多数情况下，一种试验方法就可满足要求，但对某些产品来说，需用一种以上的试验方法(如物理化学的、生物学的和/或免疫化学的)。在 2 1 节和附录 6 1中介绍应用于产品鉴定的某些方法，可以直接采用或修改后成为合适的鉴别方法。423 纯度和杂质 423 纯度和杂质 杂质可以在制剂生产和/或储存过程中产生或增加，与原料药所述相同，这些杂质有些与生产工艺有关，有些则只是在制剂制作或贮存过程中产生的降解产物。如果杂质在质和量上(即相对含量和/或浓度)与原料药一致，则不必再进行测试。如杂质是在制剂

26、生产过程和或储存过程中产生的，则应测定 杂质水平，并制定认可标准。应根据以往对该制剂的经验，制定认可标准和分析方法，以测定在制剂生产和/或储存过程中原料药的变化。分析方法的选择及优化应主要考虑将预期产品和产品相关物质与杂质(包括降解物质)分开，还应考虑与赋形剂分开。424 效价 424 效价 有效的效价测定(见 212)是生物技术和生物原料药和/或制剂规范的组成部分。当原料药采用一种效价测定方法时，其制剂可用另一种方法(物理化学的和/或生物学的)测定。但应提供选择方法的依据。425 含量 425 含量 应采用适宜的检测方法，测定制剂中原料药的含量，一般采用蛋白质的含量测定。在产品以效价表示时，

27、不必另测含量。426 常规试验 426 常规试验 物理性状及其他质量属性的测定对评价制剂质量亦很重要，如 pH 和渗透压。427 特殊剂型的额外测试 427 特殊剂型的额外测试 除以上所述的试验项目外，某些独特的剂型需增加另外的测试项目。5术语 认可标准认可标准 原料、制剂或生产阶段的其他材料应符合所认可的分析结果的数值限度、范围或其他适宜的测量值。内控限值内控限值 用于评价不太关键步骤的一致性的内部值。生物活性生物活性 产品达到规定生物效力的特有能力或含量，效价是生物活性的定量值。污染物污染物 引入的任何外源性物质(如化学、生化物质或微生物)，而不是原料或制剂生产过程的一部分。降解产物降解产

28、物 是指预期产品或产品相关物质长时间放置和或受光、温度、pH、水的作用或与赋形剂、直接接触的容器密闭系统发生反应而产生的分子变异体。在生产和/或贮藏过程中也可能发生这些变化(如脱酰胺、氧化、凝集、蛋白水解)。降解产物可能是产品相关物质，亦可能是产品相关杂质。预期产品预期产品 具有期望结构的蛋白质，或该蛋白质来源于所期望的 DNA 序列和预期的翻译后修饰形式(包括糖基化)及通过预期的下游修饰产生的有活性的生物分子。制剂制剂(剂型；最终产品剂型；最终产品)是含有原料药并通常与赋形剂放在一起的一种药品类型。原料药原料药 原料药是指与赋形剂制成制剂的物质。它由预期产品、产品相关物质、产品和工艺相关杂质

29、组成。它也可能含包括其他成分的赋形剂，如缓冲剂。赋形剂赋形剂 有意加入原料药中的、在所使用量时不应有药理作用的成分。杂质杂质 存在于原料药或制剂中的非预期产品、非产品相关物质或非缓冲剂的任何组分，它的存在与工艺或产品有关”。内部一级参考物质内部一级参考物质 生产企业用代表性批号制备的已鉴定的物质，用于各批产品的生物学检测和物理化学试验，并标定内部工作参考物质。内部工作参考物质内部工作参考物质 制备方法与一级参考物质相似，一般用一级参考物质标定而得。它用于对各批产品中某一需考察的物质进行评价和质控。效价效价 根据产品与生物学性质胡关的属性，用合适的定量生物测定方法(也称生物测定或效价测定)测得的

30、具有生物活性的量值。与工艺有关的杂质与工艺有关的杂质 从生产过程中产生的杂质，可能来源于细胞基质(如宿主细胞蛋白、宿主细胞 DNA)、细胞培养物(如诱导剂、抗生素或培养基成分)或下游工艺(如处理试剂或柱子滤出物)。产品相关杂质产品相关杂质 预期产品的分子变异体(如：前体，某些在生产和/或贮藏中出现的分解产物)，它们的性质在活性、效能和安全性方面与预期产品不同。产品相关物质产品相关物质 在生产和/或贮藏中形成的预期产品的分子变异体，它们具有一定活性但对制剂的安全性和有效性无有害影响。变异体有类似预期产品的属性，不列为杂质。参比标准品参比标准品 指国际或国家标准品。规范规范 规范是由一系列试验项目

31、、供参考的分析方法和适宜的认可标准(如数值限度、范围或试验的其他标准)组成。原料、制剂或生产阶段的其他材料都应建立；套与其使用目的相符合的标准。“符合标准”是指原料药或制剂在按照所列的分析方法进行试验的符合认可标准。规范是由生产企业提出和论证并由药品管理部门同意的作为批准条件的关键质量标准。6 附录 61 物理化学特性附录 此附录对预期产品、原料药和/或制剂，列举了对其进行结构鉴定及确证的技术方法和物理化学性质的测定方法。要根据不同的产品使用不同的技术方法。除本附录中所列方法外，其他方法在许多情况下也同样适用。新的分析技术在不断发展，现有的分析方法在不断改进，应合理采用。611 结构鉴定和确证

32、 611 结构鉴定和确证 (a)氨基酸序列氨基酸序列 预期产品的氨基酸序列测定在很大程度上可应用如(b)(e)款项中提到的测定方法，随后与预期产品基因推导的氨基酸序列进行比较。(b)氨基酸组成氨基酸组成 氨基酸组成是先用各种水解及分析方法测定，然后再与预期产品或天然品(如认为必要)基因推导的氨基酸组成进行对比。在大部分情况下，氨基酸组成分析对多肽和小分子蛋白质 可提供某些有用的结构资料，但对大分子蛋白很难确定。在大多数情况下，氨基酸定量分析也可用于确定蛋白质含量。(c)末端氨基酸序列末端氨基酸序列 末端氨基酸序列分析是用以鉴别多肮或蛋白质的氨基端和羧基端的性质及均一性的。如发现预期产品的氨基酸

33、末端是异质的，应用适宜分析方法测定变异体的相对含量。侧得末端氨基酸的序列应与预期产品基因推导的序列作比较。(d)肽图肽图 用酶或化学物选择性地将产品切成片段，切成的片段用 HPLC 或其他适宜方法进行分析，还要尽可能用如氨基酸组成分析、N末端测序或质谱等技术进行鉴定。验证的方法测得的原料药或制剂的肽图，可作为批检验中确证预期产品结构的方法。(e)巯基和二硫键巯基和二硫键 根据预期产品基因序列推导出半肮氨酸残基，采用肽图制备(还原和不还原情况下)、质谱或其他适宜的技术，测定游离 SH 基和/或二硫键的数目和位置。(f)糖结构糖结构 对于糖蛋白，要测定糖含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。另外，应尽可

34、能分析多肽链的糖链结构、寡糖类型(触角形状)和糖基化位点.612 物理化学性质 612 物理化学性质 (a)分子量及分子大小分子量及分子大小 采用分子排阻色谱、SDS聚丙烯胺凝胶电泳(还原及不还原条件下)、质谱及其他技术，测定分子量及其分子大小。(b)异构体异构体 用等电聚焦或其他适宜的技术测定。(c)消光系数消光系数(克分子吸收系数)一般应在特定的紫外/可见光波长(如 280nm)条件下测定预期产品的消光系数。消光系数是用已知蛋白质量(用氨基酸组分分析或定氮法测得)的产品溶液，用紫外/可见分光光度计测定。如产品用紫外/可见分光光度测定其蛋白质含量，则必须采用消光系数法。(d)电泳图谱电泳图谱

35、 产品的电泳图及其鉴别、同质性和纯度的资料，可用聚丙烯胺凝胶电泳、等电聚焦、SDS聚丙烯胺凝胶电泳、Western Blot、毛细管电泳或其他适宜的方法测得。(e)液相色谱图液相色谱图 产品的色谱图及产品的鉴别、同质性和纯度的资料，可用分子排阻色谱、反向液相色谱、离子交换液相色谱、亲和层析或其他适宜的技术方法测定。(f)光谱图光谱图 可测定产品的紫外和可见光吸收谱。对于产品的高级结构需用圆二色性、磁共振和其他适宜的技术测定。62 杂质附录 此附录列举了潜在杂质、它们的来源和检测的有关分析方法。杂质测定方法应随产品的不同有所选择。除本附录中所列 方法外，在许多情况下，其他方法也同样适用。新的分析

36、技术 在不断发展，现有的分析方法在不断改进，应合理采用。621 生产工艺相关杂质和污染物 621 生产工艺相关杂质和污染物 这些杂质在生产过程中产生，可分为三大类：来源于细胞基质的杂质、来源于细胞培养基的杂质和下游杂质。(a)来源于细胞基质的杂质包括(但不仅限于这些)宿主蛋白、核酸(宿主基因组、质粒或总 DNA)。对宿主细胞蛋白，通常选用对蛋白质杂质检测范围较宽、又较灵敏的方法进行，如免疫分析法。如采用免疫分析法进行检测，该法中所使用的多克隆抗体应是用无编码产品的基因和融合组分的生产细胞或用其他符合要求的细胞免疫动物后制备所得。宿主细胞DNA 水平可以用直接分析产品的方法(如杂交技术)而测得。

37、清除研究(包括实验室规模的叠加实验)可用以证明来源于细胞基质的杂质(如核酸、宿主细胞蛋白)是否清除，有时也可说明无须对此杂质建立认可标准。(b)来源于细胞培养基的杂质包括(但不仅限于这些)：诱导剂、抗生素、血清、其他培养基成分。(c)下游的杂质包括(但不仅限于这些)：酶、化学和生化处理试剂(如溴化氰、胍、氧化还原剂)、无机盐(如重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(如单克隆抗体)和其他可沥出物。在 ICH 指导原则“来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价”中提到，应证明其生产工艺有能力清除和/或灭活人为加入的内源和外源性病毒。622 产品相关杂质 622 产品相关杂质 以下是最

38、经常遇到的预期产品的分子变异体及其有关的测定技术。为确定这些修饰产物的类型，须尽可能将其分离和鉴定。大批量生产和/或贮藏工程中产生的降解产物，应根据认可标准，进行监控和测试。（a）截短形式：水解酶或化学试剂可催化肽键断裂。这可用 HPLC 或 SDS-PAGE 方法检测。亦可根据变异体性质不同而选用肽图。（b）其他修饰形式：去酰胺化、异构化、S-S 错联、氧化形式或其他结合物的改变（如糖基化、磷酸化）等。这些可通过色谱、电泳和/或其他相关的分析方法（如 HPLC毛细管电泳、质谱、圆二色性）监测和鉴定。（c）聚合体：包括与其产品的二聚体、多聚体。一般将它们从与其产品或产品相关物质中分离出来并采用如排阻层析、毛细管电泳等定量分析方法。