生物化学课程学习.pptx

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1、会计学1生物化学生物化学第一页，编辑于星期二：四点 二十分。第一章第一章 蛋白质蛋白质uu 本章内容简介本章内容简介uu 掌握内容讲授掌握内容讲授uu 本章要点回顾本章要点回顾uu 本章习题本章习题第1页/共102页第二页，编辑于星期二：四点 二十分。蛋蛋白白质质（Protein，Pr）生生活活细细胞胞内内含含量量最最丰丰富富、功功能能最最复复杂杂、参参与与几几乎所有生命活动过程。即乎所有生命活动过程。即蛋白质蛋白质是是生生命命活活动动的的体体现现者者催催化化功功能能、调调节节功功能能、转转运运功功能能、贮贮存存功功能能、运运动动功功能能、结结构构功功能能、支支架架功功能能、防御和进攻异常功能

2、防御和进攻异常功能第2页/共102页第三页，编辑于星期二：四点 二十分。本章主要介绍了氨基酸（本章主要介绍了氨基酸（AA）、）、Pr的基础知识。的基础知识。重点掌握重点掌握AA、Pr的结构组成、性质的特点及与功的结构组成、性质的特点及与功能之间的依存关系。能之间的依存关系。了解了解常见的常见的活性肽；活性肽；了解了解蛋白质分离纯化的常蛋白质分离纯化的常用方法。用方法。第3页/共102页第四页，编辑于星期二：四点 二十分。第一章第一章 蛋白质蛋白质uu1.1 1.1 氨基酸氨基酸uu1.2 1.2 肽键肽键uu1.3 1.3 生理活性肽生理活性肽uu1.4 Pr1.4 Pr的分离和纯化的分离和纯

3、化uu1.5 Pr1.5 Pr的结构与功能的结构与功能第4页/共102页第五页，编辑于星期二：四点 二十分。第一章第一章 蛋白质蛋白质1.1 1.1 氨基酸氨基酸uu1.1.1 AA1.1.1 AA的构型的构型uu1.1.2 AA1.1.2 AA的酸碱性质与的酸碱性质与p pK K值值uu1.1.3 AA1.1.3 AA的茚三酮反应的茚三酮反应第5页/共102页第六页，编辑于星期二：四点 二十分。氨基酸（氨基酸（Amino acid,AAAmino acid,AA）是蛋）是蛋白质的基本结构单位白质的基本结构单位.构成构成PrPr具具有遗传编码的氨基酸残基有有遗传编码的氨基酸残基有2020种种蛋

4、白质氨基酸蛋白质氨基酸。P2P2图图1-11-1第6页/共102页第七页，编辑于星期二：四点 二十分。Aminoacidsarethebuildingblocksofproteins1919种氨基酸具有种氨基酸具有一级一级氨基氨基(-NH3+)和羧基和羧基(-COO-)结结合到合到C，同时结合到，同时结合到C上的是上的是H和各种侧链和各种侧链R；Pro具有具有二级二级氨基氨基(-NH2+,-亚氨基酸亚氨基酸)第7页/共102页第八页，编辑于星期二：四点 二十分。二十种常见蛋白质二十种常见蛋白质二十种常见蛋白质二十种常见蛋白质AAAA的分类与的分类与的分类与的分类与结构特点结构特点据营据营养学养

5、学分类分类必需必需非必需非必需据据R基团化基团化学结构分类学结构分类脂肪族脂肪族AAAA【中性、含羟基或巯基【中性、含羟基或巯基(一氨基一羧基一氨基一羧基)、酸性、酸性(一氨基一氨基二羧基二羧基)、碱性、碱性(二氨基一羧基二氨基一羧基)】芳香族芳香族AA (PheAA (Phe、TyrTyr、Trp)Trp)杂环杂环AA (HisAA (His、Pro)Pro)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA(种种/9种种)不带电荷不带电荷（种（种/6种种）带电荷：正电荷带电荷：正电荷（种）负电荷（种）（种）负电荷（种）人的必需氨基酸人的必需氨基酸MetTrpLy

6、sValIleLeuPheThr 假假 设设 来来 借借 一一 两两 本本 书书ArgArg、HisHis（半必需（半必需AAAA）第8页/共102页第九页，编辑于星期二：四点 二十分。甘氨酸甘氨酸（Gly,G）丙氨酸丙氨酸（Ala,A）缬氨酸缬氨酸（Val,V）亮氨酸亮氨酸（Leu,L）异亮氨酸异亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸含羟基或硫含羟基或硫(巯基巯基)脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸（Ser,S）苏氨酸苏氨酸（Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸（Met,M）第9页/共102页第十页，编辑于星期二：四点 二

7、十分。酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺（Gln,Q）第10页/共102页第十一页，编辑于星期二：四点 二十分。碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸（Lys,K）精氨酸精氨酸（Arg,R）组氨酸组氨酸（His,H）杂环杂环第11页/共102页第十二页，编辑于星期二：四点 二十分。杂环氨基酸杂环氨基酸杂环氨基酸杂环氨基酸组氨酸组氨酸（His,H）脯氨酸脯氨酸（Pro,P）第12页/共102页第十三页，编辑于星期二：四点 二十分。芳香族氨基酸芳香族氨基

8、酸芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸色氨酸（Trp,W）第13页/共102页第十四页，编辑于星期二：四点 二十分。非极性非极性非极性非极性R R R R基团氨基酸基团氨基酸基团氨基酸基团氨基酸(GlyGly-Ala-Val-Leu-Ile-Phe-Met-Pro-Trp-Ala-Val-Leu-Ile-Phe-Met-Pro-Trp疏疏疏疏水性逐渐增大水性逐渐增大水性逐渐增大水性逐渐增大)第14页/共102页第十五页，编辑于星期二：四点 二十分。极性不带电荷极性不带电荷极性不带电荷极性不带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸基团氨基酸基团氨基酸第1

9、5页/共102页第十六页，编辑于星期二：四点 二十分。带电荷带电荷带电荷带电荷R R基团氨基酸基团氨基酸基团氨基酸基团氨基酸Ser-Thr-Asn-Gln-Tyr-Cys-Asp-Glu-His-Lys-Arg极性极性AAAA的的R R基团亲水性逐渐增强基团亲水性逐渐增强第16页/共102页第十七页，编辑于星期二：四点 二十分。二十种氨基酸的结构特点二十种氨基酸的结构特点含支链含支链AA：Val、Leu，Ile含羟基的含羟基的AA：Ser、Thr含硫的含硫的AA：Cys(含巯基含巯基)、Met(含硫甲基含硫甲基)含苯环的含苯环的AA：Phe、Trp、Tyr含胍基的含胍基的AA：Arg含咪唑基的

10、含咪唑基的AA：His亚氨基酸：亚氨基酸：Pro含酰胺的含酰胺的AA：Asn、Gln含吲哚基的含吲哚基的AA：Trp含含-氨基的氨基的AA：Lys第17页/共102页第十八页，编辑于星期二：四点 二十分。1.除除R为为H（Gly）外）外,其其余余AA均具有均具有不对称不对称-碳碳原子原子AA有有D/L-构构型型,但构成但构成Pr的的AA均为均为L-氨基酸氨基酸,在生物界有在生物界有D-氨氨基酸的存在。基酸的存在。2.AA具有具有不对称不对称-碳原碳原子子AA具有具有旋光性旋光性3.各种各种AA的区别的区别在于侧在于侧链链R基基上上AAAA的结构通式的结构通式第18页/共102页第十九页，编辑于

11、星期二：四点 二十分。AA的酸碱性质的酸碱性质 p3-4AA既含有氨基，可接受既含有氨基，可接受H H+，又含有羧基可电，又含有羧基可电离出离出H H+，所以氨基酸具有，所以氨基酸具有酸碱两性性质酸碱两性性质。通常。通常情况下，氨基酸以情况下，氨基酸以偶离子偶离子兼（两）性离子兼（两）性离子的形式的形式存在，如下图所示：存在，如下图所示：第19页/共102页第二十页，编辑于星期二：四点 二十分。AA的的等等电电点点AAAA在在酸酸性性环环境境中中主主要要以以阳阳离离子子H H2 2A A+的的形形式式存存在在,在在碱碱性性环环境境中中主主要要以以阴阴离离子子A A-的的形形式式存存在在.在在某

12、某一一pHpH环环境境下下,以以偶偶离离子子形形式式存存在在,在在电电场场中中既既不不向向阴阴极极也也不不向向阳阳极极移移动动该该AAAA的的等等电电点点(isoelectricpoint，pI)，其其定定义义为为AAAA所所带带正正负电荷相等时的溶液负电荷相等时的溶液pHpH。p3第20页/共102页第二十一页，编辑于星期二：四点 二十分。与茚三酮的反应：除与茚三酮的反应：除Pro外，可与其它外，可与其它AA生成生成蓝紫色蓝紫色化合物。化合物。Pro在此反应在此反应中并不释放中并不释放NH3，直接生成，直接生成黄色黄色化合化合物。在物。在570nm（蓝紫色）或（蓝紫色）或440nm（黄色）定

13、量测定（黄色）定量测定（0.5-50g/ml）与茚三酮反应与茚三酮反应第21页/共102页第二十二页，编辑于星期二：四点 二十分。第22页/共102页第二十三页，编辑于星期二：四点 二十分。脯氨酸与茚三酮反应的产物：脯氨酸与茚三酮反应的产物：N N+黄色化合物黄色化合物第23页/共102页第二十四页，编辑于星期二：四点 二十分。肽键肽键（peptidebond）：一个：一个AAAA的的-COOH和和相邻的另一个相邻的另一个AAAA的的-NH2脱水形成的脱水形成的共价键共价键。具有具有部分双键部分双键性质性质不能自由旋转不能自由旋转，呈呈平平面面结构结构第24页/共102页第二十五页，编辑于星期

14、二：四点 二十分。N N端端C C端端R RH HH HOOC CC Ca aN NC Ca aC CR ROON NOOC CN NC Ca aC CR ROON NC Ca aH HH HH HH HC Ca aH H肽链中从一个肽链中从一个CC原子到另一个原子到另一个CC原子之间共包含的原子之间共包含的6 6个个原子（原子（CC、C C、O O、N N、H H、CC）在空间共处于）在空间共处于同一同一个平面个平面肽肽/酰胺平面酰胺平面，是蛋白质空间构象的基本，是蛋白质空间构象的基本结构单位结构单位第25页/共102页第二十六页，编辑于星期二：四点 二十分。肽键肽键肽键肽键/酰胺平面与酰胺

15、平面与酰胺平面与酰胺平面与-碳原子的二面角（碳原子的二面角（碳原子的二面角（碳原子的二面角（和和和和 ）二面角二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的两相邻酰胺平面之间，能以共同的C C为定点而为定点而旋转，绕旋转，绕C C-N-N键旋转的角度称键旋转的角度称角，绕角，绕C-CC-C键旋转的键旋转的角度称角度称角。角。和和称作二面角，亦称构象角。称作二面角，亦称构象角。第26页/共102页第二十七页，编辑于星期二：四点 二十分。脑脑啡啡肽肽：为为5 5肽肽，具具有有镇镇痛痛作作用用。有有两两种种类类型型MetMet脑啡肽脑啡肽和和LeuLeu脑啡肽脑啡肽第27页/共102页第二十八页，编辑于星期

16、二：四点 二十分。第一章第一章 蛋白质蛋白质1.4 Pr1.4 Pr的分离和纯化的分离和纯化uu1.4.1 Pr1.4.1 Pr分离、提纯一般程序分离、提纯一般程序uu1.4.2 Pr1.4.2 Pr的溶解度分级沉淀的溶解度分级沉淀uu1.4.3 1.4.3 目的蛋白的精制目的蛋白的精制第28页/共102页第二十九页，编辑于星期二：四点 二十分。一一.分离纯化蛋白质的意义分离纯化蛋白质的意义 1.1.研究蛋白质的结构与功能：研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性要求纯度高，不变性2.2.提取活性的酶或蛋白质：提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态必须保持天然活性状态3.3.作为药物或食

17、品添加剂：作为药物或食品添加剂：纯度达到规定要求纯度达到规定要求二、蛋白质提纯的总目标：二、蛋白质提纯的总目标：增增加加制制品品纯纯度度或或比比活活力力，设设法法除除去去变变性性的的蛋蛋白白质质和和其其他他杂杂蛋白，且希望所得蛋白质的产量达到最高值。蛋白，且希望所得蛋白质的产量达到最高值。第29页/共102页第三十页，编辑于星期二：四点 二十分。蛋白质分离纯化的一般程序（蛋白质分离纯化的一般程序（温和条件温和条件）1.1.前处理前处理 生物组织生物组织 破碎、溶解、离心分离破碎、溶解、离心分离 蛋白质提取液蛋白质提取液2.2.粗分离粗分离 盐析、等电点沉淀、透析、超滤、有机溶剂分级分离盐析、等

18、电点沉淀、透析、超滤、有机溶剂分级分离3.3.细分级细分级 层析、电泳、超速离心层析、电泳、超速离心 精制精制 精制品精制品4.4.结晶结晶 结晶或冻干粉结晶或冻干粉 适宜介质适宜介质第30页/共102页第三十一页，编辑于星期二：四点 二十分。uu选择合适原料：选择合适原料：动物、植物组动物、植物组 织、基因工程表达产物织、基因工程表达产物uu采用不同方法将采用不同方法将细胞破碎细胞破碎uu得到含有得到含有目的蛋白的粗提液目的蛋白的粗提液控制提纯条件以避免控制提纯条件以避免PrPr变性变性第31页/共102页第三十二页，编辑于星期二：四点 二十分。uuPrPrPrPr在水中的溶解度在水中的溶解

19、度在水中的溶解度在水中的溶解度取决于取决于取决于取决于PrPrPrPr的水合度的水合度的水合度的水合度uu常用常用常用常用加入无机盐加入无机盐加入无机盐加入无机盐的方法来控制水合度的方法来控制水合度的方法来控制水合度的方法来控制水合度uu盐溶盐溶盐溶盐溶:当溶液中无机盐的浓度从零增加时当溶液中无机盐的浓度从零增加时当溶液中无机盐的浓度从零增加时当溶液中无机盐的浓度从零增加时,Pr,Pr,Pr,Pr的的的的溶解度有所增加溶解度有所增加溶解度有所增加溶解度有所增加（带电层使（带电层使（带电层使（带电层使PrPrPrPr分子彼此排斥而分子彼此排斥而分子彼此排斥而分子彼此排斥而与水分子间的相互作用加强

20、）与水分子间的相互作用加强）与水分子间的相互作用加强）与水分子间的相互作用加强）uu盐析盐析盐析盐析:当盐浓度继续增加到某一点时当盐浓度继续增加到某一点时当盐浓度继续增加到某一点时当盐浓度继续增加到某一点时,Pr,Pr,Pr,Pr开始开始开始开始沉沉沉沉淀淀淀淀（PrPrPrPr分子表面的水化层被移去溶解盐离子，分子表面的水化层被移去溶解盐离子，分子表面的水化层被移去溶解盐离子，分子表面的水化层被移去溶解盐离子，使使使使PrPrPrPr分子内部的疏水基团暴露出来而聚集沉分子内部的疏水基团暴露出来而聚集沉分子内部的疏水基团暴露出来而聚集沉分子内部的疏水基团暴露出来而聚集沉淀）淀）淀）淀）第32页

21、/共102页第三十三页，编辑于星期二：四点 二十分。uu常用的中性盐为常用的中性盐为硫酸铵硫酸铵uu不同蛋白质不同蛋白质由于所带电荷和由于所带电荷和水化程度不同，盐析时所需水化程度不同，盐析时所需盐盐浓度也不同浓度也不同，因此可以将不同，因此可以将不同蛋白质加以分离蛋白质加以分离uu盐析顺序的先后差异达盐析顺序的先后差异达到分级沉淀到分级沉淀 p7p7图图1-61-6第33页/共102页第三十四页，编辑于星期二：四点 二十分。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化层水化层+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的

22、蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉蛋蛋白白质质溶溶液液等等电电点点沉沉淀淀作作用用示示意意图图第34页/共102页第三十五页，编辑于星期二：四点 二十分。透析与超滤简易装置透析与超滤简易装置第35页/共102页第三十六页，编辑于星期二：四点 二十分。uu层析层析:离子交换层析、凝离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、胶过滤层析、亲和层析、疏水层析疏水层析uu电泳：电泳：SDS-PAGESDS-PAGE电泳、毛电泳、毛细管电泳细管电泳uu超速离心超速离心:密度梯度离心密度梯度离心第36页/共

23、102页第三十七页，编辑于星期二：四点 二十分。离子交换层析：以离子交换树脂为支持物，离子交换层析：以离子交换树脂为支持物，树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙树脂是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。AAAA在树脂上结合的牢固程度即在树脂上结合的牢固程度即AAAA与树脂与树脂间的亲和力间的亲和力，主要决定于它们之间的，主要决定于它们之间的静电静电吸引吸引和和AAAA的的R R基团与树脂基质之间的基团与树脂基质之间的疏水作疏水作用用。第37页/共102页第三十八页，编辑于星期二：四点 二十分。阳离子交换树脂：活性基团是酸性的阳离

24、子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基，如磺酸基-SO3H强酸型强酸型；羧基；羧基-COOH弱酸型弱酸型 阴离子交换树脂：活性基团是碱性的阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如，如OH-第38页/共102页第三十九页，编辑于星期二：四点 二十分。离离子子交交换换原原理理及及流流程程示示意意图图+第39页/共102页第四十页，编辑于星期二：四点 二十分。基本步骤：基本步骤：装柱装柱 上样上样 分步洗脱分步洗脱 分步收集分步收集强酸型阳强酸型阳离子交换离子交换树脂树脂pH23，使所有氨基，使所有氨基酸酸带正正电荷荷，正电正电荷大小顺序：荷大小顺序：碱性碱性AA中性中性AA酸性酸性AA逐步提高逐步提高

25、洗脱洗脱液液pH和离子和离子强度强度分离分离AA混合物经常使用混合物经常使用强酸型阳离子强酸型阳离子交换树脂交换树脂，pH23上柱上柱,此时此时AA主要以主要以阳离子阳离子形式存在形式存在,与树与树脂上的阳离子交换而被脂上的阳离子交换而被“挂挂”在树脂上。在树脂上。第40页/共102页第四十一页，编辑于星期二：四点 二十分。由于由于AA与树脂之间还有与树脂之间还有疏水相互作用疏水相互作用，因此，因此，除除Asn、Gln、Trp外外17种种AA的洗出顺序为：的洗出顺序为：Asp-Thr-Ser-Glu-Pro-Gly-Ala-Cys-Val-Met-Ile-Leu-Tyr-Phe-Lys-His

26、-ArgpH3时，时，AA与树脂之间的静电吸引大小顺序为：与树脂之间的静电吸引大小顺序为：碱性碱性AA2+中性中性AA+酸性酸性AA0因此因此AA的洗出顺的洗出顺序为序为酸性酸性AA中性中性AA碱性碱性AA。第41页/共102页第四十二页，编辑于星期二：四点 二十分。凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理第42页/共102页第四十三页，编辑于星期二：四点 二十分。亲和层析法亲和层析法第43页/共102页第四十四页，编辑于星期二：四点 二十分。n n由于蛋白质分子中氨基酸残基由于蛋白质分子中氨基酸残基的的侧链侧链上存在游离的上存在游离的氨基氨基和游和游离的离的羧基羧基，因此蛋白质与氨基，因此蛋白质与氨

27、基酸一样具有两性解离的性质，酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的因而也具有特定的等电点等电点（pIpI）。蛋白质的两性解离与等电点蛋白质的两性解离与等电点pH=pI净电荷净电荷=0pHpI净电荷为负净电荷为负PrCOOHNH3+H+OH-+H+OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+第44页/共102页第四十五页，编辑于星期二：四点 二十分。+5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电通电+电泳现象电泳现象电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同分子大小不同的蛋的蛋白质所带白质所带净电荷密度不同净电荷密度不同，迁移率即不同

28、迁移率即不同，在电泳时可以，在电泳时可以分开。分开。第45页/共102页第四十六页，编辑于星期二：四点 二十分。纸电泳（醋酸纤维薄膜电泳法）纸电泳（醋酸纤维薄膜电泳法）第46页/共102页第四十七页，编辑于星期二：四点 二十分。SDS-PAGE凝胶电泳法凝胶电泳法低浓度浓缩胶低浓度浓缩胶高浓度分离胶高浓度分离胶第47页/共102页第四十八页，编辑于星期二：四点 二十分。第一章第一章 蛋白质蛋白质1.5 Pr1.5 Pr的结构和功能的结构和功能uu1.5.1 Pr1.5.1 Pr的结构的结构uu1.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法uu1.5.3 Pr1.5.3 Pr的变性

29、与复性的变性与复性第48页/共102页第四十九页，编辑于星期二：四点 二十分。1.5.1 Pr1.5.1 Pr的结构的结构uu、PrPr结构的一般概结构的一般概念念uu、PrPr的一级结构的一级结构uu、PrPr的二级结构的二级结构uu、PrPr的超二级结构的超二级结构和结构域和结构域uu、PrPr的三级结构的三级结构uu、PrPr的四级结构和的四级结构和PrPr体系体系uu、维持维持PrPr空间结构空间结构的作用力的作用力第49页/共102页第五十页，编辑于星期二：四点 二十分。第50页/共102页第五十一页，编辑于星期二：四点 二十分。蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构（primarystr

30、ucture）共价共价/初级结构，包括组成蛋白质的多肽链的初级结构，包括组成蛋白质的多肽链的数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链链内或链间二硫键的数目和位置。内或链间二硫键的数目和位置。肽键肽键是主要是主要连接键，多肽链是一级结构的主体。连接键，多肽链是一级结构的主体。其中最重其中最重要是要是AAAA在肽链中的排列顺序在肽链中的排列顺序，如改变不仅影，如改变不仅影响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其生理响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其生理功能。功能。第51页/共102页第五十二页，编辑于星期二：四点 二十分。肽（链肽（链）（）（peptidechain

31、）1 1）2/32/3个个AA组成的肽叫组成的肽叫二二/三肽三肽；多个；多个AA组成的肽叫组成的肽叫多肽多肽；AAAA借肽键连成长链称为借肽键连成长链称为肽链肽链2 2）肽链两端有自由）肽链两端有自由-NH-NH2 2称为称为N-N-末端末端（氨基末端（氨基末端,H H）和自由）和自由-COOH端称为端称为C-C-末端末端（羧基末端（羧基末端,OH）；有）；有开链肽开链肽和和环链肽环链肽；3 3）构成肽链的）构成肽链的AA已残缺不全，称为已残缺不全，称为氨基酸残基氨基酸残基；4 4）肽链中的）肽链中的AA排列顺序一般排列顺序一般-NH2端开始，由端开始，由N N指向指向C C，即，即多多肽链有

32、方向性肽链有方向性，N N端为头，端为头，C C端为尾；端为尾；5 5）-S-S-S-S-键键也包括在也包括在一级结构一级结构中，是连接多肽中，是连接多肽链内和链间链内和链间的的主要桥键；二硫键数目越多主要桥键；二硫键数目越多PrPr结构的稳定性越强。结构的稳定性越强。第52页/共102页第五十三页，编辑于星期二：四点 二十分。N N 末端：多肽链中有自由氨基的一端末端：多肽链中有自由氨基的一端C C 末端：多肽链中有自由羧基的一端末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端多肽链有两端氨基酸的顺序是氨基酸的顺序是N 端端C 端的端的排列顺序。如上述五肽可表示排列顺序。如上述五肽可表示为：为：S

33、er-Val-Tyr-Asp-Glu 丝氨酰酰缬氨酰酰酪氨酰酰天冬氨酰酰谷氨酸酸COOH第53页/共102页第五十四页，编辑于星期二：四点 二十分。常见二级结构构象单元有常见二级结构构象单元有3 3类：规则的二级结类：规则的二级结构（构（-螺旋、螺旋、-折叠）、部分规则的二级折叠）、部分规则的二级结构（结构（-转角）、无规则的二级结构（无规卷转角）、无规则的二级结构（无规卷曲）等曲）等PrPr二级结构的概念：二级结构的概念：secondarystructure,多肽链多肽链骨架的局部空间结构即骨架的局部空间结构即主链主链折叠形成由折叠形成由氢键氢键维系的维系的有规则的构象。有规则的构象。第54

34、页/共102页第五十五页，编辑于星期二：四点 二十分。-螺旋螺旋（-Helix）:是最常见最典型含是最常见最典型含量最丰富的二级结构元件量最丰富的二级结构元件（secondarystructrueelement）A:多个肽键平面通过多个肽键平面通过-碳原子碳原子旋转旋转,主链绕一条主链绕一条固定轴形成固定轴形成右手螺旋右手螺旋,每隔每隔3.63.6个个AA残基螺旋残基螺旋上升一圈上升一圈,螺距为螺距为0.54nm,每个每个AA沿轴上升沿轴上升0.15nm,上升时每个上升时每个AA沿轴旋转沿轴旋转100,100,AAAA侧侧链链R R分布在螺旋外侧分布在螺旋外侧第55页/共102页第五十六页，编

35、辑于星期二：四点 二十分。第56页/共102页第五十七页，编辑于星期二：四点 二十分。B:氢键氢键（hydrogenbond）相邻螺圈之间借肽键相邻螺圈之间借肽键中中CO和和N-H形成许多形成许多链内氢健链内氢健，即第，即第n n个个AA残基残基中的中的CO 和后面第和后面第n+4n+4个个AA残基的残基的N-H之间形成氢之间形成氢键，这是键，这是稳定稳定-螺旋的主要键螺旋的主要键CnC(NHCCO)3NCn+4OHHR3.63.613 13 (n ns s)n n表示螺旋上升一圈的表示螺旋上升一圈的AAAA残基数目残基数目S S表示形成一对氢键封闭环内共价结构的表示形成一对氢键封闭环内共价结

36、构的原子数目原子数目第57页/共102页第五十八页，编辑于星期二：四点 二十分。第58页/共102页第五十九页，编辑于星期二：四点 二十分。-折叠折叠(-pleated sheets)(-pleated sheets)，又又称称-片层片层,是肽链比是肽链比-螺旋伸展的螺旋伸展的重复性结构重复性结构,其主要作用力也是其主要作用力也是氢键氢键，氢键可以在不同肽链之间形成氢键可以在不同肽链之间形成,也也可以在同一肽链的不同肽段之间形可以在同一肽链的不同肽段之间形成；按成；按-折叠的走向分为折叠的走向分为平行式平行式和和反平行式反平行式两种。两种。第59页/共102页第六十页，编辑于星期二：四点 二十

37、分。C C端端第60页/共102页第六十一页，编辑于星期二：四点 二十分。第61页/共102页第六十二页，编辑于星期二：四点 二十分。N1CHCC2CHNHO=C3CHNC4CHNRRHOHRROHO-转角经常出现转角经常出现在连接反平行在连接反平行-折叠片的端头。折叠片的端头。-转角转角(-turn):指指Pr的多肽链在形成空间构象的多肽链在形成空间构象时经常会出现时经常会出现180180的回折的回折，回折处的结构的，回折处的结构的柔性介于规则与无规则结构之间。柔性介于规则与无规则结构之间。第62页/共102页第六十三页，编辑于星期二：四点 二十分。细胞色素细胞色素C的三级结构的三级结构无规

38、卷曲无规卷曲randomcoil:有些多肽区段具有些多肽区段具有比部分规则结构更有比部分规则结构更大的柔性大的柔性,形成形成没有没有一定规律的松散肽链一定规律的松散肽链结构结构.但此结构也但此结构也不是随机出现的不是随机出现的,具有特定生物功能具有特定生物功能.无规则卷曲无规则卷曲第63页/共102页第六十四页，编辑于星期二：四点 二十分。超二级结构（模体超二级结构（模体/花式）花式）Super-secondarystructure,由由2 2个或几个结个或几个结构单元被连接起来，进一步组合成有特殊几何构单元被连接起来，进一步组合成有特殊几何排列的局域空间结构。在结构层次上高于二级排列的局域空

39、间结构。在结构层次上高于二级结构结构,但但不具有蛋白质的功能不具有蛋白质的功能。常见组合方式有：。常见组合方式有：、。第64页/共102页第六十五页，编辑于星期二：四点 二十分。超二级结构类型超二级结构类型第65页/共102页第六十六页，编辑于星期二：四点 二十分。结构域结构域（structuraldomain）多肽链在二级或超二多肽链在二级或超二级结构基础上形成三级结构的级结构基础上形成三级结构的局部折叠区局部折叠区，是是相对独立的紧密球状实体相对独立的紧密球状实体，称为结构域。其对，称为结构域。其对于一些简单的球状蛋白质分子来说，还是一个于一些简单的球状蛋白质分子来说，还是一个独立的功能单

40、位或功能域（独立的功能单位或功能域（fuctionaldomain）第66页/共102页第六十七页，编辑于星期二：四点 二十分。第67页/共102页第六十八页，编辑于星期二：四点 二十分。第68页/共102页第六十九页，编辑于星期二：四点 二十分。多肽链在二级、超二级结构和结构域的多肽链在二级、超二级结构和结构域的基础再进一步折叠，形成基础再进一步折叠，形成包括主、侧链包括主、侧链在内的专一排布在内的专一排布称为三级结构。此时分子称为三级结构。此时分子内能降低结构内能降低结构更稳定更稳定。折叠时的趋势是大。折叠时的趋势是大多数的多数的亲水的亲水的R侧基侧基分布于球形结构的分布于球形结构的表面表

41、面，而而疏水的疏水的R侧基侧基分布于球形结构的分布于球形结构的内部内部，形成形成疏水的核心疏水的核心。PrPr的三级结构的三级结构（tertiarystructure）第69页/共102页第七十页，编辑于星期二：四点 二十分。肌肌肌肌红红红红蛋蛋蛋蛋白白白白三三三三级级级级结结结结构构构构第70页/共102页第七十一页，编辑于星期二：四点 二十分。Mb的结构的结构第71页/共102页第七十二页，编辑于星期二：四点 二十分。二条或二条以上具有独立的三级结构的多肽链二条或二条以上具有独立的三级结构的多肽链(亚亚基，基，subunit)彼此借彼此借非共价键（次级键）非共价键（次级键）相结合形成相结合

42、形成四级结构。四级结构。四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。亚亚基可以相同（均一四级结构），亦可以不同（非均一四级基可以相同（均一四级结构），亦可以不同（非均一四级结构）结构）亚基单独存在时没有完整的生物活性，亚基单独存在时没有完整的生物活性，只有形成完只有形成完整四级结构的寡聚体才有生物功能。整四级结构的寡聚体才有生物功能。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构（quaternarystructure）以血红蛋白以血红蛋白(hemoglobin)为例：为例：第72页/共102页第七十三页，编辑于星期二：四点 二十分。第73页/共102页第七十四页，编辑于星期

43、二：四点 二十分。HbHb的四级结构的四级结构第74页/共102页第七十五页，编辑于星期二：四点 二十分。血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)第75页/共102页第七十六页，编辑于星期二：四点 二十分。共价键共价键次级键次级键化学键化学键 肽键肽键一级结构一级结构氢键氢键二硫键二硫键二、三、四级结构二、三、四级结构疏水作用疏水作用盐键盐键范德华力范德华力三、四级结构三、四级结构蛋白质分子中重要的化学键蛋白质分子中重要的化学键共价键与次级键共价键与次级键第76页/共102页第七十七页，编辑于星期二：四点 二十分。维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力离子键离子键氢键氢键范德华力

44、范德华力疏水相互作用疏水相互作用第77页/共102页第七十八页，编辑于星期二：四点 二十分。维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力维持蛋白质空间结构的作用力多肽链多肽链第78页/共102页第七十九页，编辑于星期二：四点 二十分。1.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法uu1 1 1 1、PrPrPrPr分子中多肽链数目的确定分子中多肽链数目的确定分子中多肽链数目的确定分子中多肽链数目的确定uu2 2 2 2、多肽链的分离：肽链的拆开、多肽链的分离：肽链的拆开、多肽链的分离：肽链的拆开、多肽链的分离：肽链的拆开、末端分析、氨基酸组成分析

45、（离末端分析、氨基酸组成分析（离末端分析、氨基酸组成分析（离末端分析、氨基酸组成分析（离 子交换层析子交换层析子交换层析子交换层析自动分析仪）自动分析仪）自动分析仪）自动分析仪）uu3 3 3 3、多肽链的降解多肽链的降解多肽链的降解多肽链的降解 4 4 4 4、肽段的分离肽段的分离肽段的分离肽段的分离uu5 5 5 5、肽段氨基酸序列测定肽段氨基酸序列测定肽段氨基酸序列测定肽段氨基酸序列测定uu6 6 6 6、肽段在多肽链中次序的测定肽段在多肽链中次序的测定肽段在多肽链中次序的测定肽段在多肽链中次序的测定uu7 7 7 7、二硫键定位二硫键定位二硫键定位二硫键定位第79页/共102页第八十页

46、，编辑于星期二：四点 二十分。1.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法 根据根据根据根据PrPrPrPr的摩尔数和其的摩尔数和其N/C-N/C-N/C-N/C-末端末端的摩尔数相比来确定：一条的摩尔数相比来确定：一条多肽链、多条相同多肽链、多肽链、多条相同多肽链、多条不同多肽链多条不同多肽链p18p18p18p18第80页/共102页第八十一页，编辑于星期二：四点 二十分。1.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法 经末端的分析，若该经末端的分析，若该Pr含有含有两条以上的肽链，而且肽链两条以上的肽链，而且肽链之间是通过之间是通过非共价键非共价键连接，连接

47、，使用使用Pr变性剂变性剂（如（如8M尿素、尿素、6M盐酸胍）将其盐酸胍）将其变性后分变性后分开开；若；若Pr肽链之间通过肽链之间通过共价共价键键（如二硫键）相连，则可（如二硫键）相连，则可采取采取过甲酸氧化法过甲酸氧化法或或巯基乙巯基乙醇还原法醇还原法将其分开将其分开p18第81页/共102页第八十二页，编辑于星期二：四点 二十分。二硫键可被二硫键可被氧化剂（过甲酸）氧化剂（过甲酸）或或还原剂还原剂（巯基化合物（巯基化合物巯基乙醇）巯基乙醇）打开。打开。磺基丙氨酸磺基丙氨酸第82页/共102页第八十三页，编辑于星期二：四点 二十分。1.5.2 Pr1.5.2 Pr结构的研究方法结构的研究方法

48、n n鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-和和C-末端残基末端残基:n nN-末端分析：末端分析：丹磺酰氯法丹磺酰氯法、2，4二硝基氟苯法、二硝基氟苯法、Edman降解法、氨肽酶法；降解法、氨肽酶法；n nC-末端分析：末端分析：肼解法肼解法、羧肽酶法羧肽酶法；p18第83页/共102页第八十四页，编辑于星期二：四点 二十分。H2NCHCOOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-5-二甲氨基萘磺二甲氨基萘磺(丹丹磺磺)酰氯（酰氯（DNS-ClDNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨基酸氨基酸(具荧光性具荧光性)与与丹磺酰氯丹磺酰氯反应反应灵敏度高的灵敏度高的

49、酰基化酰基化反应，反应，常用于测定蛋白质常用于测定蛋白质N端端AA+HCl第84页/共102页第八十五页，编辑于星期二：四点 二十分。与与与与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)反应反应反应反应sangersanger反应，反应，反应，反应，测定测定测定测定PrPr的的的的N N端端端端AAAA种类种类种类种类烃基化反应烃基化反应烃基化反应烃基化反应DNFBDNFBDNP-AA(黄色黄色)+HF弱碱弱碱中中氨基酸氨基酸第85页/共102页第八十六页，编辑于星期二：四点 二十分。肼解法肼解法：Pr/多肽多肽+NH2NH2氨基酸氨基酸肼化物肼化物C-

50、C-末端末端AAAA苯甲醛苯甲醛非水溶性二苯基衍生物非水溶性二苯基衍生物水溶性水溶性C-C-末端末端AAAA在上清液中在上清液中离心法离心法 C-C-末端末端AA+DNFBAA+DNFBDNP-AADNP-AA乙醚乙醚提取提取层析层析鉴定鉴定GlnGln、AsnAsn、CysCys等被等被破坏不易测出，破坏不易测出，ArgArg转变为转变为OrnOrn。第86页/共102页第八十七页，编辑于星期二：四点 二十分。羧羧 肽肽 酶酶 法法 羧肽酶羧肽酶（carboxypeptidase）是肽链外切酶，专一性）是肽链外切酶，专一性地从地从C-末端开始逐个向里切，被末端开始逐个向里切，被释放的释放的A