生产菌种选育学习教案.pptx

《生产菌种选育学习教案.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生产菌种选育学习教案.pptx（160页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、会计学1生产生产(shngchn)菌种选育菌种选育第一页，共160页。一、微生物代谢一、微生物代谢(dixi)产物产物（一）初级代谢（一）初级代谢(dixi)产物产物(Primary metabolite)：微生物自身生长繁殖所必需的代谢微生物自身生长繁殖所必需的代谢(dixi)产物。产物。（二）次级代谢产物（二）次级代谢产物(Secondary metabolite)：与菌体的生长繁殖与菌体的生长繁殖(fnzh)无明确关系的代谢产物，既无明确关系的代谢产物，既不参与细胞结构，也不是储存养料。不参与细胞结构，也不是储存养料。抗生素抗生素(antibiotic)、生物碱、生物碱(alkaloid

2、)、色素、色素(pigment)等等氨基酸，核苷酸，脂肪酸，维生素，蛋白质，多糖，低级有机酸，醇等突变菌株：营养缺陷型、抗性变株，基因工程菌等。第一节第一节 微生物的代谢微生物的代谢及调控及调控第2页/共160页第1页/共160页第二页，共160页。1 1、微生物合成、微生物合成、微生物合成、微生物合成(hchng)(hchng)次级代谢产物的基本特征次级代谢产物的基本特征次级代谢产物的基本特征次级代谢产物的基本特征(1)次级代谢产物具有种特异性次级代谢产物具有种特异性(2)分批发酵时，产生分批发酵时，产生(chnshng)菌生长周期三个时期菌生长周期三个时期(3)次级代谢产物不少是结构相似的

3、混合物次级代谢产物不少是结构相似的混合物(4)次级代谢产物的合成受多基因控制次级代谢产物的合成受多基因控制第3页/共160页第2页/共160页第三页，共160页。(1)(1)次级次级次级次级(c j)(c j)代谢产物具有种特异性代谢产物具有种特异性代谢产物具有种特异性代谢产物具有种特异性分类学上相同(xin tn)的菌种能产生不同结构的抗生素 如：灰色链霉菌：链霉素-氨基环醇类 杀假丝菌素-六烯大环内酯类不同的微生物也能产生相同(xin tn)的抗生素 如：头孢菌素C：顶头孢霉和克拉维链霉菌第4页/共160页第3页/共160页第四页，共160页。(2)(2)分批发酵时，产生分批发酵时，产生分

4、批发酵时，产生分批发酵时，产生(ch(ch nshng)nshng)菌生长周期三个时期菌生长周期三个时期菌生长周期三个时期菌生长周期三个时期三个时期三个时期(shq):(shq):菌体生长期菌体生长期 产物合成期产物合成期 菌体自溶期菌体自溶期 第5页/共160页第4页/共160页第五页，共160页。(3)(3)次级代谢产物不少是结构次级代谢产物不少是结构次级代谢产物不少是结构次级代谢产物不少是结构(jigu)(jigu)相似的混合物相似的混合物相似的混合物相似的混合物产黄青霉菌合成具有不同(b tn)生物活性的青霉素(青霉素G、V、O、F、X)，青霉素母核-6-氨基青霉烷酸（6-APA）R=

5、G-C6H5CH2-,X-HOC6H4CH2-,F-CH3(CH2)4-,V-C6H50CH2-第6页/共160页第5页/共160页第六页，共160页。原因原因(yunyn)参与次级代谢产物合成酶系的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，产生菌继续对该产物进行多种化学修饰而同时合成多种衍生物。此种生物合成现象，有时(yush)称为“代谢树”。一种次级代谢产物可由两种或两种以上的代谢途径合成的，这种方式有时(yush)称为“代谢网”。第7页/共160页第6页/共160页第七页，共160页。原利福霉素原利福霉素I利福利福(l f)霉素霉素Y利福利福(l f

6、)霉素霉素B利福利福(l f)霉素霉素O利福霉素利福霉素L利福霉素利福霉素W利福霉素利福霉素R利福霉素利福霉素A,C,D,E利福霉素利福霉素G利福霉素利福霉素S2 丙二酸单元丙二酸单元8 甲基丙二酸单元甲基丙二酸单元3-氨基氨基-5-羟基苯甲酸羟基苯甲酸利福平的生物合成（代谢树）利福平的生物合成（代谢树）第8页/共160页第7页/共160页第八页，共160页。红霉素的生物合成红霉素的生物合成红霉素的生物合成红霉素的生物合成(代谢代谢代谢代谢(dixi)(dixi)网网网网)1-1-红霉素红霉素红霉素红霉素A;2-A;2-红霉素红霉素红霉素红霉素B;3-B;3-红霉素红霉素红霉素红霉素C;4-C

7、;4-红霉素红霉素红霉素红霉素D;5-D;5-红霉素红霉素红霉素红霉素E;6-E;6-红霉红霉红霉红霉素素素素F;EB-F;EB-红霉内酯红霉内酯红霉内酯红霉内酯B;EA-B;EA-红霉内酯红霉内酯红霉内酯红霉内酯A;M-A;M-碳霉糖碳霉糖碳霉糖碳霉糖;C-;C-红霉糖红霉糖红霉糖红霉糖;D-;D-脱氧脱氧脱氧脱氧氨基己糖氨基己糖氨基己糖氨基己糖OCODHOOCH3CH3CH3OCH3OOEBEAEBEBOM EAEBOCODOMEAEBODOMODOCEAOCODCH2OHEAODHO123456第9页/共160页第8页/共160页第九页，共160页。(4)次级代谢产物次级代谢产物(chn

8、w)的合成受多基的合成受多基因控制因控制染色体基因簇结构基因；质粒调控基因，抗性基因质粒：（1）天蓝色链霉菌(mjn)生物合成次甲霉素A的4个或5个结构基因在SCPl质粒上 （2）螺旋霉素生物合成中，结构基因编码于复制子上，而调节基因位于质粒上。第10页/共160页第9页/共160页第十页，共160页。初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，而在许多初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，而在许多抗生素产生抗生素产生(chnshng)茵如天蓝色链霉菌、金霉素链霉菌、茵如天蓝色链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌等中发现，抗生灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌

9、等中发现，抗生素的合成同时受到核外遗传物质素的合成同时受到核外遗传物质-质粒的控制，因此，有人质粒的控制，因此，有人将受到质粒控制的代谢产物称为将受到质粒控制的代谢产物称为“质粒产物质粒产物”。第11页/共160页第10页/共160页第十一页，共160页。1 1、次级代谢产物构建单位、次级代谢产物构建单位、次级代谢产物构建单位、次级代谢产物构建单位(dnwi)(dnwi)的生源说和生物合成的生源说和生物合成的生源说和生物合成的生源说和生物合成生源说指的是次级代谢产物分子中构建(u jin)单位的各种原子的起源有机化学。生物合成指的是各构建(u jin)单位在多种酶的作用下合成次级代谢产物的过程

10、生物化学。中间产物：五碳、四碳、三碳、二碳化合物“分叉中间体分叉中间体”：某些：某些(muxi)中间产物，即可用于合中间产物，即可用于合成初级代谢产物，又可用于合成次级代谢产物。成初级代谢产物，又可用于合成次级代谢产物。（三）初级代谢与次级代谢之间的关系（三）初级代谢与次级代谢之间的关系第12页/共160页第11页/共160页第十二页，共160页。特殊特殊(tsh)(tsh)前体前体(一)聚酮体：聚酮体是通过连续的低级羧酸如乙酸、丙酸等在聚酮体合成酶(PKS)作用下脱羧缩合 合成起始单位有乙酰辅酶A(CoA)、丙酰CoA和丁酰CoA等。（1）葡萄糖(或脂肪酸)降解-乙酰CoA（2）丙酸单位可由

11、琥珀酰CoA转化、奇数碳脂肪酸降解、支链氨基酸降解等形成。（3）丁酸单位通常由一个乙酰CoA与一个丙酰CoA缩合形成，还可由亮氨酸经过2-C-异己(yj)酸降解生成。亮氨酸亮氨酸2-C-异已酸异已酸乙酰乙酸乙酰乙酸丁酸丁酸转氨酶转氨酶第13页/共160页第12页/共160页第十三页，共160页。作为作为(zuwi)(zuwi)链的延长单位有丙二酰链的延长单位有丙二酰CoACoA、甲基丙二、甲基丙二酰酰CoACoA、乙基丙二酰、乙基丙二酰CoACoA等。是等。是C2C2、C3C3和和C4C4的供体的供体（4）乙酰）乙酰CoA丙酰丙酰CoA缩合缩合(suh)丁酸丁酸乙基丙二酰乙基丙二酰CoA（3）

12、丙酰）丙酰CoA+草酰乙酸草酰乙酸甲基丙二酰甲基丙二酰CoA十丙酮酸十丙酮酸羧基转移酶羧基转移酶（2）丙酰）丙酰CoA+ATP+CO2+H2O甲基丙二酰甲基丙二酰CoA+ADP+Pi丙酰丙酰CoA羧化酶羧化酶（1）乙酰）乙酰CoA+ATP+C02+H2O丙二酰丙二酰CoA+ADP+Pi乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶第14页/共160页第13页/共160页第十四页，共160页。n n-聚酮体链连续而完全的还原反应获得脂肪酸；n n不完全的还原或还原位点的不同可获得变化范围广泛的聚酮体。n n经过重复脱水常得到芳香化合物(如四环类、蒽环类抗生素)n n经过环化作用(zuyng)形成大内酯环(大环内酯类

13、抗生素)，如果形成多个双键的环状化合物，就可能导致多烯大环内酯类抗生素的合成。第15页/共160页第14页/共160页第十五页，共160页。甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物(shngw)(shngw)合成合成合成合成HHHOOOHCOSCoAMeMeCOCH2COSCoAHCH2COSCoAOHOOHHOHSCOAMeOPPHMeHHHOHOOHOHMeOOOHMeOPOOHOPOOHOMeOPPMeHHRS*-CH2COSCoAHMeCOSCoA+-+乙酰乙酰乙酰乙酰-COA硫解酶硫解酶HMGCoA合成酶合成酶H

14、MGCoA还原酶还原酶-HRNADPHNADPH2ATPATP-CO2异构酶异构酶(二二)甲羟戊酸甲羟戊酸(3-甲基甲基-3，5-二羟基二羟基(qingj)戊酸，戊酸，MVA)乙酰乙酰CoA3-羟羟-3-甲甲-戊二酰戊二酰CoA甲羟戊酸甲羟戊酸甲羟戊酸甲羟戊酸-5-焦磷酸焦磷酸异戊二烯焦磷酸异戊二烯焦磷酸异戊二烯类或异戊二烯类或萜类次级代谢萜类次级代谢(dixi)产物产物赤霉素赤霉素生物碱生物碱甾醇甾醇胡萝卜素胡萝卜素第16页/共160页第15页/共160页第十六页，共160页。(三三)糖类糖类(tn li)和和氨基糖氨基糖n nO-糖苷，N-糖苷、S-糖苷、C-糖苷等与次级代谢产物分子中的糖

15、苷配体连接。n n葡萄糖和戊糖是这些糖类和氨基糖的前体。n n葡萄糖的碳架经过异构化、氨基化、脱氧、碳原子重排、氧化还原或脱羧等修饰后并人次级代谢产物的分子中。n n葡萄糖是合成稀有(xyu)戊糖的直接前体。部分稀有(xyu)戊糖是在核苷合成之后直接对核糖部分进行修饰而形成的。第17页/共160页第16页/共160页第十七页，共160页。链霉糖的生物链霉糖的生物链霉糖的生物链霉糖的生物(shngw)(shngw)合成合成合成合成灰色灰色(hus)链霉菌提取物链霉菌提取物NADPH灰色灰色(hus)链霉菌提取物链霉菌提取物二氢链霉糖二氢链霉糖L-鼠李糖鼠李糖NADPH脱氧酰苷脱氧酰苷-5-二磷酸

16、葡萄糖二磷酸葡萄糖第18页/共160页第17页/共160页第十八页，共160页。(四四四四)不常见不常见不常见不常见(chn(chn jin)jin)的氨基酸的氨基酸的氨基酸的氨基酸n n200余种非蛋白质氨基酸(称不常见氨基酸)，如D-氨基酸、N-甲基氨基酸；脱氢的和b-氨基酸、稀有的二氨基酸(如二氨基丁酸)。n nD-氨基酸可能由L-氨基酸通过氨基酸消旋酶催化形成的。n n有的是由正常氨基酸生物合成(hchng)途径合成(hchng)的，如a-氨基己二酸是合成(hchng)头孢菌素的一个构建单位。第19页/共160页第18页/共160页第十九页，共160页。(五五)环多醇和环多醇和(chn

17、h)氨基环多醇氨基环多醇n n环多醇是带有一些羟基环多醇是带有一些羟基(qi(qi ngj)ngj)的环碳化合物。的环碳化合物。n n氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基(qi(qi ngj)ngj)被氨基取代的衍生物。被氨基取代的衍生物。n n氨基环醇类抗生素氨基环醇类抗生素(如链霉素、庆大霉素、卡那霉素如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等等)的分子中最常见的环多醇部分是由葡萄糖衍生来的分子中最常见的环多醇部分是由葡萄糖衍生来的，如的，如-脱氧链霉胺、链霉胍都是葡萄糖经过磷酸化、脱氧链霉胺、链霉胍都是葡萄糖经过磷酸化、环化等反应形成环多醇，继续经过氨基化

18、等反应衍环化等反应形成环多醇，继续经过氨基化等反应衍生来的。生来的。第20页/共160页第19页/共160页第二十页，共160页。比较比较比较比较(b(b jio)jio)源自源自源自源自D-D-葡萄糖的链霉胍，葡萄糖的链霉胍，葡萄糖的链霉胍，葡萄糖的链霉胍，2-2-脱氧链霉胺和脱氧链霉胺和脱氧链霉胺和脱氧链霉胺和ActinamineActinamine的标记模式的标记模式的标记模式的标记模式共同共同(gngtng)的中间体的中间体（X,Y=H or OH）第21页/共160页第20页/共160页第二十一页，共160页。(六六六六)非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的生物非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的生物非核酸

19、的嘌呤碱和嘧啶碱的生物非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的生物(shngw)(shngw)合成合成合成合成 在次级代谢产物中出现的非核酸嘌呤碱基和嘧啶碱基是由合成(hchng)核酸用的嘌岭和嘧啶经过化学修饰而形成的。(七七)芳香芳香(fngxing)中间体中间体（八）甲基（八）甲基S-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)第22页/共160页第21页/共160页第二十二页，共160页。次级代谢产物次级代谢产物(chnw)生物合成的基本过程生物合成的基本过程（一）构建单位的聚合（一）构建单位的聚合(jh)如柱晶白霉素由如柱晶白霉素由5个乙酰单位，个乙酰单位，1个丙酸单

20、位，个丙酸单位，1个个丁酸单位，丁酸单位，1个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩合而成。个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩合而成。第23页/共160页第22页/共160页第二十三页，共160页。新生新生新生新生(xnshng)(xnshng)霉素生源说霉素生源说霉素生源说霉素生源说（）来自甲硫氨酸；）来自甲硫氨酸；）来自甲硫氨酸；）来自甲硫氨酸；*来自葡萄糖来自葡萄糖来自葡萄糖来自葡萄糖 来自(li z)酪氨酸来自甲羟戊酸来自莽草酸OHCOOOOHNH(CH3)来自谷氨酰胺OOOHOCNH2OO(H3C)CH3(H3C)*第24页/共160页第23页/共160页第二十四页，共160页。（二）次级代谢产物的最

21、终（二）次级代谢产物的最终(zuzhn)修饰修饰四环素四环素土霉素土霉素脱氢四环素脱氢四环素C4氧化反应及氨化反应氧化反应及氨化反应C6羟化反应羟化反应C4-NH2甲基化反应甲基化反应四环素环四环素环四环素环四环素环C7氯化反应金霉素氯化反应金霉素O HO HN(CH3)2O HCONH2OOR1R3R2R4OHHH12345678910111211a12a第25页/共160页第24页/共160页第二十五页，共160页。二、微生物代谢的调节二、微生物代谢的调节(tioji)及控制及控制2、酶合成、酶合成(hchng)的调节（即酶量的调节）的调节（即酶量的调节）3、能荷调节、能荷调节(tioji

22、)1、酶活性的调节、酶活性的调节酶活性的激活酶活性的激活酶活性的抑制酶活性的抑制协同反馈抑制协同反馈抑制累积反馈抑制累积反馈抑制增效反馈抑制增效反馈抑制顺序反馈抑制顺序反馈抑制（一）微生物代谢的自我调节机制（一）微生物代谢的自我调节机制第26页/共160页第25页/共160页第二十六页，共160页。反馈抑制反馈抑制(yzh)模式模式 -协同反馈抑制协同反馈抑制(yzh)n n分支途径的几种末端分支途径的几种末端(m dun)(m dun)产物同时过量时产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性才抑制共同途径中的第一个酶活性ABCDEFG第27页/共160页第26页/共160页第二十七页，共1

23、60页。反馈抑制反馈抑制反馈抑制反馈抑制(yzh)(yzh)模式模式模式模式 -累积反馈抑制累积反馈抑制累积反馈抑制累积反馈抑制(yzh)(yzh)n n每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同(gngtng)途径中第一个酶活性ABCDEFG58%40%30%第28页/共160页第27页/共160页第二十八页，共160页。反馈反馈(fnku)抑制模式抑制模式 -增效反馈增效反馈(fnku)抑制抑制 n n代谢途径(tjng)中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径(tjng)中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和ABCDEFG20%15%

24、90%第29页/共160页第28页/共160页第二十九页，共160页。反馈反馈(fnku)抑制模式抑制模式 -顺序反馈顺序反馈(fnku)抑制抑制 n n每个分支末端产物(chnw)抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用BACDEFGHIJK第30页/共160页第29页/共160页第三十页，共160页。2 2、酶合成、酶合成、酶合成、酶合成(hchng)(hchng)的调节的调节的调节的调节-诱导与阻诱导与阻诱导与阻诱导与阻遏遏遏遏（2）酶合成的阻遏）酶合成的阻遏降解酶类由诱导作用和分解代谢产物来调节活性降解酶类由诱导作用和分解代谢产物来调节活性合成酶主要由反馈抑制和反馈阻遏（指代谢的终产物达

25、到一合成酶主要由反馈抑制和反馈阻遏（指代谢的终产物达到一定浓定浓度时，阻遏该代谢途径中的一种酶或几种度时，阻遏该代谢途径中的一种酶或几种(jzhn)酶的生物合成）酶的生物合成）调节。调节。（1）酶合成的诱导）酶合成的诱导组成酶：有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在。组成酶：有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在。诱导酶：只有在它们催化的底物诱导酶：只有在它们催化的底物(或底物的结构或底物的结构(jigu)类似物类似物)存在时才能合成的酶。存在时才能合成的酶。第31页/共160页第30页/共160页第三十一页，共160页。3、能荷调节、能荷调节(tioji)1.1.能荷指细胞中ATP、ADP、AM

26、P系统中可供利用的高能磷酸键的量度。2.2.能荷调节(或称腺苷酸调节)指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例(bl)来调节其代谢活动。RUU-ATP利用利用(lyng)体系的酶体系的酶R-ATP合成体系的酶合成体系的酶第32页/共160页第31页/共160页第三十二页，共160页。放线菌（链霉素四放线菌（链霉素四环素；红霉素等）环素；红霉素等）真菌真菌(zhnjn)（青霉素、头孢（青霉素、头孢等）等）一些一些(yxi)产芽孢产芽孢的细菌的细菌植物植物(zhw)或或动物来源动物来源（一）抗生素生产有关的微生物（一）抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目抗生

27、素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：前发现的生物来源如下：一、常见的工业微生物一、常见的工业微生物一、常见的工业微生物一、常见的工业微生物第二节第二节生产菌种的选育方法生产菌种的选育方法第33页/共160页第32页/共160页第三十三页，共160页。（二）氨基酸生产（二）氨基酸生产(shngchn)有关有关的微生物的微生物氨基酸生产氨基酸生产(shngchn)菌的要求：菌的要求：代谢代谢(dixi)途径比较清楚，途径比较清楚，代谢代谢(dixi)途径比较简单途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节

28、杆菌属棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌第34页/共160页第33页/共160页第三十四页，共160页。（三）食品（三）食品(shpn)酶制剂生产有关的微生物酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国(mi u)需要得到需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。于生产食品用酶。a-淀粉酶

29、：黑曲霉、米曲霉、米根酶、淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌枯草牙孢杆菌(gnjn)和地衣牙孢杆和地衣牙孢杆菌菌(gnjn)FDA-FoodandDrugAdministration(美国美国)食品及药物管理局食品及药物管理局：generallyrecognizedassafe/一般认为安全一般认为安全GRAS第35页/共160页第34页/共160页第三十五页，共160页。工业化菌种的要求工业化菌种的要求(yoqi)1.1.生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；2.2.能够利用廉价的原料，简单(jindn)的培养基，大量高效地合成产物；3.3.有关合成产物的途径

30、尽能地简单(jindn)，或者说菌种改造的可操作性要强；4.4.遗传性能要相对稳定；5.5.不易感染它种微生物或噬菌体；6.6.生产特性要符合工艺要求。第36页/共160页第35页/共160页第三十六页，共160页。二、新菌种的分离二、新菌种的分离二、新菌种的分离二、新菌种的分离(fnl)(separation)(fnl)(separation)与筛选与筛选与筛选与筛选(sereeing)(sereeing)1.1.样品采集；2.2.预处理；3.3.富集培养；4.4.初筛；5.5.复筛；6.6.性能(xngnng)鉴定；7.7.保藏第37页/共160页第36页/共160页第三十七页，共160页

31、。实例：实例：碱性碱性(jin xn)纤维素酶产生菌的筛选纤维素酶产生菌的筛选采样采样(ci yn)（造纸厂）（造纸厂）8030分钟处理分钟处理(chl)文献文献:产生菌为中性芽孢杆菌，产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌嗜碱性芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型constitutiveexpressioninducibleexpression第38页/共160页

32、第37页/共160页第三十八页，共160页。一）采样一）采样(ci yn)时要注意的时要注意的问题问题气候气候(qhu)、水分、空、水分、空气气 来源来源(liyun)要广要广结合产品的特点结合产品的特点标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等第39页/共160页第38页/共160页第三十九页，共160页。富集的三种富集的三种(sn zhn)方方案：案：定向培养定向培养(dn xin pi yn):采用特定的有利于目的微生物采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养；富集的条件，进行培养；二）富集培养二）富集培养(piyng)富集的目的：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛

33、选变得让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。可能。当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑；类学中考虑；不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能时只能通过随机分离的办法。通过随机分离的办法。第40页/共160页第39页/共160页第四十页，共160页。定向培养定向培养(dn xin pi yn)的富集方法的富集方法1、底物、底物(d w)(Substrate)2、pH条条件件(tiojin)3、培养时间、培养时间4、培养温度、培养温度一切能提高目的微生物相对一切能提高目的微生物相对生长速度的手

34、段，培养生长速度的手段，培养(固体、固体、液体；分批连续液体；分批连续)后使目的微生物后使目的微生物在种群中占优势。在种群中占优势。第41页/共160页第40页/共160页第四十一页，共160页。案例分析案例分析工业工业(gngy)乳酸发酵的菌乳酸发酵的菌种选育种选育n n符合(fh)工业生产的菌种的标准：n n经济性能好，能高效生产乳酸；n n同型发酵，即只生产单一的一种乳酸分子而无其他有机酸副产物；n n具有在较高浓度的乳酸环境中生存的能力；n n具有较高的耐热性；n n菌种的营养要求相对简单；n n选择抗噬菌体菌株。Lactic acid bacteria,LAB第42页/共160页第4

35、1页/共160页第四十二页，共160页。乳酸菌菌株乳酸菌菌株能否能否(nn fu)在葡萄糖在葡萄糖上生长上生长是否是否(sh fu)同型发同型发酵酵耐乳酸耐乳酸(r sun)钠试验钠试验产物的立体结构专一性产物的立体结构专一性第二阶段筛选第二阶段筛选NN弃去弃去弃去弃去第一阶段流程第一阶段流程第43页/共160页第42页/共160页第四十三页，共160页。有希望有希望(xwng)的的菌株菌株生长温度筛选生长温度筛选(shixun)，驯化，驯化生物生物(shngw)反应反应器分批发酵器分批发酵细胞细胞-发酵液分离特性发酵液分离特性耐产物驯化耐产物驯化第二阶段流程第二阶段流程有希望的菌株有希望的菌

36、株第44页/共160页第43页/共160页第四十四页，共160页。菌种分离的一般菌种分离的一般(ybn)过程过程样品样品(yngpn)的的采取采取 预处理预处理 培养培养(piyng)菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定使隔离使隔离,使孤立使孤立,使绝缘使绝缘,离析离析ScreenIsolate屏屏,银幕银幕,筛子筛子,掩蔽物掩蔽物,屏风，掩蔽屏风，掩蔽,包庇包庇,放映放映,拍摄拍摄ing高通量筛选高通量筛选第45页/共160页第44页/共160页第四十五页，共160页。三、菌种改良三、菌种改良(giling)及工程菌构及工程菌构建建第46页/共160页第45页/共160页第四十六页，共

37、160页。第三节第三节第三节第三节 微生物代谢微生物代谢微生物代谢微生物代谢(dixi)(dixi)控制育种控制育种控制育种控制育种的措施的措施的措施的措施一、营养缺陷型初级代谢产物高产菌株的筛选（1）降低终产物浓度 筛选终产物营养缺陷型(auxotrophic mutant)筛选细胞膜透性改变的菌株（2）筛选抗反馈突变菌株 筛选结构(jigu)类似物抗性突变株 利用回复突变筛选抗反馈突变株 第47页/共160页第46页/共160页第四十七页，共160页。第48页/共160页第47页/共160页第四十八页，共160页。2 2、次级代谢、次级代谢、次级代谢、次级代谢(dixi)(dixi)产物高

38、产菌株的筛选产物高产菌株的筛选产物高产菌株的筛选产物高产菌株的筛选（1）利用营养缺陷）利用营养缺陷(quxin)型筛选型筛选磷酸磷酸(lnsun)烯醇式丙酮酸烯醇式丙酮酸4磷酸磷酸(lnsun)赤藓糖赤藓糖7磷酸阿拉伯庚酮糖磷酸阿拉伯庚酮糖莽草酸莽草酸分枝酸分枝酸对氨基苯酸对氨基苯酸氯霉素氯霉素苯丙氨酸（营养物）苯丙氨酸（营养物）酪氨酸（营养物）酪氨酸（营养物）色氨酸（营养物）色氨酸（营养物）反馈调节反馈调节第49页/共160页第48页/共160页第四十九页，共160页。产黄青霉生物合成产黄青霉生物合成产黄青霉生物合成产黄青霉生物合成(hchng)(hchng)赖氨酸和青霉素的分枝赖氨酸和青霉

39、素的分枝赖氨酸和青霉素的分枝赖氨酸和青霉素的分枝途径途径途径途径a-a-酮戊二酸酮戊二酸+乙酰辅酶乙酰辅酶(f(f mi)A mi)A高柠檬酸高柠檬酸赖氨酸赖氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G反馈反馈(fnku)抑制抑制a a-氨基己二酸氨基己二酸同型柠檬酸合成酶同型柠檬酸合成酶第50页/共160页第49页/共160页第五十页，共160页。渗漏渗漏渗漏渗漏(shn lu)(shn lu)缺陷型缺陷型缺陷型缺陷型(leaky mutant)(leaky mutant)n n 所谓渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营 养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量(shol

40、ing)地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量(sholing)地生长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间代谢物的积累。第51页/共160页第50页/共160页第五十一页，共160页。二、抗反馈抑制二、抗反馈抑制二、抗反馈抑制二、抗反馈抑制(yzh)(yzh)突变株突变株突变株突变株筛选筛选(shixun)氨基酸结构类似物抗性突变株氨基酸结构类似物抗性突变株a-a-酮戊二酸乙酰辅酶酮戊二酸乙酰辅酶(f(f mi)A mi)A高柠檬酸合成酶高柠檬酸合成酶反馈调节反馈调节a a-氨基已二酸氨基已二酸高柠檬酸高柠檬酸结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸异青霉素异青霉素N

41、青霉素青霉素表表2-1一些用来筛选抗性突变株的结果类似物一些用来筛选抗性突变株的结果类似物第52页/共160页第51页/共160页第五十二页，共160页。三、其他类型三、其他类型(lixng)的突变株的突变株第53页/共160页第52页/共160页第五十三页，共160页。工业菌种改良工业菌种改良工业菌种改良工业菌种改良(giling)(giling)(giling)(giling)方法方法方法方法(1)解除或绕过代谢(dixi)途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢(dixi)途径中引伸出新的代谢(dixi)步骤，由此提供一个旁路代谢(di

42、xi)途径。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢(dixi)途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢(dixi)产品的反馈抑制。如诱导代谢(dixi)产品的结构类似物抗性。第54页/共160页第53页/共160页第五十四页，共160页。Overview of tetrapyrrole biosynthesisGlutamate-1-semiadenhydeGlutamyl-tRNAHemAHemL5-aminolevulinic acidglycineSuccinyl-CoA

43、+HemC,DUroporphyrinogen IIICoproporphyrinigen IIIPrecorrin-2Protoporphyrin IXProtoheam IXHemYHemHCobAVitamin B12siroheamheamd1PorphobilinogenHemBHemE0.00.51.01.52.02.5024487296120Time(h)ConcentrationofCPIII(mg/L)pPK705pKHEM04(hemA)pKHEM05(hemA,B)pKHEM06(hemB)Piao Y,KiatpapanP,YamashitaM.et al.,Effec

44、tsofexpressionofhemAandhemBgenesonproductionofporphyrinin Propionibacterium freudenreichii.ApplEnvironMicrobiol2004,70:7561-7566第55页/共160页第54页/共160页第五十五页，共160页。第四节第四节菌种的扩大菌种的扩大(kud)培养及保藏培养及保藏菌菌种种扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面(ximin)活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种

45、子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养,最最终终获获得得一一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、菌种的扩大一、菌种的扩大(kud)培养培养:第56页/共160页第55页/共160页第五十六页，共160页。种子种子(zhng zi)扩培扩培的目的的目的 接种接种(jizhng)量量的需要的需要 菌种的驯化菌种的驯化(xnhu)l 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移

46、种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染无杂菌污染第57页/共160页第56页/共160页第五十七页，共160页。菌种扩大培养菌种扩大培养(piyng)的基本过程的基本过程实验室阶段：不用种子罐，所用实验室阶段：不用种子罐，所用(su yn)的设备为培养箱、的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归为生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归为发酵发酵(f

47、jio)车间管理，因此称这些培养过程为生产车车间管理，因此称这些培养过程为生产车间阶段。间阶段。第58页/共160页第57页/共160页第五十八页，共160页。1）实验室阶段）实验室阶段(jidun)培养物选择培养物选择(xunz)的原则的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据目的：种子扩培到一定的量和质，根据(gnj)菌种的特点最终的培养物可分为两类：菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽胞的微生物对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定

48、数量和质量的菌体，如谷氨酸的种培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。子培养。（一）实验室种子的制备（一）实验室种子的制备第59页/共160页第58页/共160页第五十九页，共160页。获得一定数量和质量获得一定数量和质量(zhling)的孢子的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易菌丝体培养步骤少，因而更容易(rngy)获得量和获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。质稳定的种子，但操作繁琐。对于对于(duy)产孢子的微生物产孢子的微生物 获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。第60页/共160页第59页/共160页

49、第六十页，共160页。2）培养基选择）培养基选择(xunz)的原则的原则培养基的选择应该培养基的选择应该(ynggi)是有利于菌体的生长，是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该对孢子培养基应该(ynggi)是有利于孢子的生长。是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量因此为了保证培养基的质量(zhling)，培养基的原，培养基的原料一般都比较精细。料一般都比较精细。第61页/共160页第60页/共160页第六十一页，共160页。3）起始）起始(q sh)接种物的传代问题接种物的传代问题 细菌细菌(x

50、jn)保藏保藏 活化活化(huhu)斜面斜面 产孢子产孢子保藏保藏 母斜面母斜面 子斜面子斜面要求：使菌种的传代次数尽可能的少。要求：使菌种的传代次数尽可能的少。第62页/共160页第61页/共160页第六十二页，共160页。（二）生产车间种子（二）生产车间种子(zhng zi)制制备备（1）培养物的选择）培养物的选择(xunz)原则原则在生产车间在生产车间(chjin)阶段，最终一般都是阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。获得一定数量的菌丝体。缩短发酵时间缩短发酵时间 有利于获得良好的发酵结果有利于获得良好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：第63页/共160页第62页/共