分子发光分析法教学.ppt

《分子发光分析法教学.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子发光分析法教学.ppt（74页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第五章第五章 分子发光分析法分子发光分析法1 12 23 3第五章第五章 分子发光分析法分子发光分析法n n分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理n n荧光分析仪器荧光分析仪器n n分子荧光定量分析分子荧光定量分析n n简介化学发光简介化学发光4 4 5-1 概述概述一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类n n某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以到激发态，以

2、到激发态，以到激发态，以光辐射的形式光辐射的形式光辐射的形式光辐射的形式从激发态回到基态，这从激发态回到基态，这从激发态回到基态，这从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。方法为分子发光分析法。方法为分子发光分析法。方法为分子发光分析法。较高激发态较高激发态基基 态态吸收能量吸收能量受激受激光辐射光辐射退激退激5 5n n根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分根据分子受

3、激时所吸收能源及辐射光的机理不同分根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：为以下几类：为以下几类：为以下几类：光致发光：以光致发光：以光致发光：以光致发光：以光源光源光源光源来激发而发光来激发而发光来激发而发光来激发而发光 生物发光：以生物发光：以生物发光：以生物发光：以生物体释放的能量生物体释放的能量生物体释放的能量生物体释放的能量激发而发光激发而发光激发而发光激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光激发而发光激发而发光化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法荧光荧光荧光分析法荧光

4、分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法6 6二、分子荧光分析法的特点二、分子荧光分析法的特点1.灵敏度高灵敏度高n n荧光强度随激发光强度增强而增强。提高激荧光强度随激发光强度增强而增强。提高激发光强度，可提高荧光强度。发光强度，可提高荧光强度。采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低检测限荧光分析法比分光光度法低24个数量级。个数量级。激发激发发射荧光发射荧光强强强强激发光激发光激发光激发光 物物物物 质质质质7 72.2.选择性好选择性好选择性好选择性好n n不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的不同的物质用不同的光进行激

5、发，选择不同的不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发激发激发激发光波长光波长光波长光波长n n不同的物质发射的荧光不同，选择不同的不同的物质发射的荧光不同，选择不同的不同的物质发射的荧光不同，选择不同的不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光检测荧光检测荧光检测荧光波长波长波长波长n n比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.3.实验方法简单实验方法简单实验方法简单实验方法简单4.4.待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量

6、少；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广n n根据发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机根据发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机根据发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机根据发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。牧产品分析、卫生检疫等领域。牧产品分析、卫生检疫等领域。牧产品分析、卫生检疫等领域。n n荧

7、光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法8 8 5-2 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生n n具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁价电子跃迁价电子跃迁价电子跃迁产生荧光和磷光产生荧光和磷光产生荧光和磷光产生荧光和磷光 基态分子基态分子基态分子基态分子 价电子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态价电

8、子跃迁到激发态价电子跃迁到激发态光照激发光照激发去激发光去激发光 *n基基基基 态态态态n n 在在在在光致激发和去激发光光致激发和去激发光光致激发和去激发光光致激发和去激发光的过程中，分子中的过程中，分子中的过程中，分子中的过程中，分子中的价电子（的价电子（的价电子（的价电子（、n电子）处于不同的自旋状态，电子）处于不同的自旋状态，电子）处于不同的自旋状态，电子）处于不同的自旋状态，通常用电子通常用电子通常用电子通常用电子自旋状态的多重性自旋状态的多重性自旋状态的多重性自旋状态的多重性来描述。来描述。来描述。来描述。9 91.电子自旋状态的多重性电子自旋状态的多重性n n大多数分子含有偶数电

9、子，基态分子每一个轨道大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的中两个电子自旋方向总是相反的中两个电子自旋方向总是相反的中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于，处于，处于，处于基态单基态单基态单基态单重态（重态（重态（重态（2S+1=1)2S+1=1)。用。用。用。用“S“S0 0”表示表示表示表示 ；当物质受光照；当物质受光照；当物质受光照；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，射时，基态分

10、子吸收光能产生电子能级跃迁，由由由由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，变，变，变，净自旋净自旋净自旋净自旋=0=0 ，这种跃迁是符合光谱选律的。，这种跃迁是符合光谱选律的。，这种跃迁是符合光谱选律的。，这种跃迁是符合光谱选律的。基态单重态基态单重态 S S0 0第一激发单重态第一激发单重态 S S1 1S S0 0,S,S1 1,S,S2 2,S,S3 3分别代表基态分别代表基态分别代表基态分别代表基态,第一第一第一第一,二二二二,三激发单重态三激发单重态三

11、激发单重态三激发单重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-81010n n若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由由由由基态单重态基态单重态基态单重态基态单重态激发三重态激发三重态激发三重态激发三重态，净自旋，净自旋，净自旋，净自旋 0 0。这种跃。这种跃。这种跃。这种跃迁为禁阻跃迁迁为禁阻跃迁迁为禁阻跃迁迁为禁阻跃迁 T T1 1、T T2 2、T T3 3分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二

12、、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态 基态单重态基态单重态 S S0 0第一激发三重态第一激发三重态 T T1 1自旋平行自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-410S1111传递途径辐射跃迁无辐射跃迁荧光延迟荧光磷光振动弛豫内部转移系间窜跃外部转移n n分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或的分子

13、是不稳定的，去激返回到较低激发态或的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：基态时有两种方式：基态时有两种方式：基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激无辐射去激和辐射去激无辐射去激和辐射去激无辐射去激和辐射去激.12122.无辐射去激无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以辐射去激，体系内的多余的能量以热热的形式的形式释放。包括：释放。包括：n n振动驰豫振动驰豫n n内部转换内部转换n n系间窜跃系间窜跃n n外部转移外部转移1313T1S0振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（振动驰豫（VRVR）同一电子能级中，从较同一电子能级中，从

14、较同一电子能级中，从较同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程高振动能级到较低振动能级的过程高振动能级到较低振动能级的过程高振动能级到较低振动能级的过程内部转换内部转换内部转换内部转换IC相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换 S-S S-S吸光吸光 吸光吸光S0S1S2系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（系间窜跃（ISCISC）不同的多重不同的多重不同的多重不同的多重态之间的转换态之间的转换态之间的转换态之间的转换 S-T S-T 1414n n发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，S1T1间进行，间进行，比内部转换困难。比内部

15、转换困难。n n外部转移外部转移指激发态分子与溶剂分子或溶指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭。光强度减弱或消灭。15153.荧光和磷光光谱的产生荧光和磷光光谱的产生辐射去激辐射去激n n处于处于处于处于S S1 1或或或或T T1 1态的电子返回态的电子返回态的电子返回态的电子返回S S0 0态时，伴随有发光现态时，伴随有发光现态时，伴随有发光现态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射去激象，这种过程叫辐射去激象，这种过程叫辐射去激象，这种过程叫辐射去激 S S1 1或或或或T T1 1 S S0 0 发光发光（1

16、）荧光：）荧光：n 当电子从当电子从第一激第一激发单重态发单重态S1的最低的最低振动能级回到振动能级回到基态基态S0各振动能级所产各振动能级所产生的光辐射叫荧光生的光辐射叫荧光VRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光S0S1S21616T1S0VRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 图图7-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃1717n n荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，速度快，10-910-6s，又叫快速荧光或瞬，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部

17、光源停止照射，荧光马上时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭。熄灭。n n 无论开始电子被激发至什么高能级，它无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到都经过无辐射去激消耗能量后到S1的最的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。发光波长长。荧荧 激激1818（2）磷磷 光光n n当当当当受激电子降到受激电子降到受激电子降到受激电子降到S S1 1的最低振动能级后，未发射荧的最低振动能级后，未发射荧的最低振动能级后，未发射荧的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到光，而是经过系间窜跃到光，而是经过系间窜跃到光，而是经过系间窜

18、跃到T T1 1振动能级，经振动驰振动能级，经振动驰振动能级，经振动驰振动能级，经振动驰豫到豫到豫到豫到 T T1 1最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从最低振动能级，从T T1 1最低振动能级回到基最低振动能级回到基最低振动能级回到基最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光。态的各个振动能级所发射的光叫磷光。态的各个振动能级所发射的光叫磷光。态的各个振动能级所发射的光叫磷光。T1S0VRICS0S1S2ISC1919T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR

19、：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VR2020n n从从从从T T1 1 S S1 1要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为 1010-4-4 10s 10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间，光照停止后，磷光仍可持续一段时间，光照停止后，磷光仍可持续一段时间，光照停止后，磷光仍可持续一段时间n n分子相互碰撞的无辐射能量损耗大，所以磷光的分子相互碰撞的无辐射能量损耗大，所以磷光的分子相互碰撞的无辐射能量损耗大，所以磷光的分子相互碰撞的无辐射能量损耗大，所以磷光的波长更

20、长。波长更长。波长更长。波长更长。n n 磷磷磷磷 荧荧荧荧 激激激激 *易产生荧光易产生荧光易产生荧光易产生荧光 n n *易产生磷光易产生磷光易产生磷光易产生磷光2121二、荧光、磷光与分子结构的关系二、荧光、磷光与分子结构的关系n n了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征

21、以便更好地运用荧光分析技术，采取一些什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体。成荧光体，弱荧光体变成强荧光体。成荧光体，弱荧光体变成强荧光体。成荧光体，弱荧光体变成强荧光体。（一）荧光效率（一）荧光效率（一）荧光效率（一）荧光效率荧光量子效率；量子产率荧光量子效率；量子产率荧光量子效率；量子产率荧光量

22、子效率；量子产率 n n荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率 f f 来描述来描述来描述来描述 荧光量子效率荧光量子效率荧光量子效率荧光量子效率 f f=发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数 f f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，发射荧光的能力，发射荧光的能力，发射荧光的能力，f f 越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在

23、0101之间之间之间之间2222n n若以各种跃迁速率常数来表示若以各种跃迁速率常数来表示n nKf 为荧光发射过程的速率常数为荧光发射过程的速率常数取决于取决于物质的化学结构。物质的化学结构。n nKi 为为非辐射跃迁非辐射跃迁的速率常数之和的速率常数之和主要主要取决于化学环境，也与化学结构有关。取决于化学环境，也与化学结构有关。n n分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在率在0.11之间。之间。2323n n至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描至今对激发态分

24、子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系述荧光与分子结构之间的关系述荧光与分子结构之间的关系述荧光与分子结构之间的关系n n一般情况，一般情况，一般情况，一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物是是是是最强最有用的荧光体最强最有用的荧光体最强最有用的荧光体最强最有用的荧光体（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系1.1.跃迁类型跃迁类型跃迁类型跃迁类型n n大多数荧光物质首先吸收紫外可见光大多数荧光物质首先吸收紫外可见光大多数荧光物质首先吸收紫外可见

25、光大多数荧光物质首先吸收紫外可见光,产生产生产生产生 *，n n *跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生 *n n跃迁产生荧光。跃迁产生荧光。跃迁产生荧光。跃迁产生荧光。n n *与与与与n n *跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大10102 210103 3倍，寿命短。倍，寿命短。倍，寿命短。倍，寿命短。n n *跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧光，n n *跃迁产生的跃迁产生的跃迁产生的

26、跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。24242.2.共轭效应共轭效应共轭效应共轭效应有较强的荧光有较强的荧光有较强的荧光有较强的荧光n n具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭程电子共轭程电子共轭程电子共轭程度越大，越易产生荧光度越大，越易产生荧光度越大，越易产生荧光度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大，环越多，共轭程度越大，环越多，共轭程度越大，环越

27、多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强 f ex ex/nm/nm emem/nm/nm 0.11 205 278苯苯 0.29 286 310萘萘0.46 365 400蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状线状环结构比非线状结构的荧光波长长结构的荧光波长长2525 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光。数能发生荧光。多多环环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定测定例：例：3，4-苯并苯

28、并芘芘是强致癌物是强致癌物 ex ex=386 nm=386 nm emem=430 nm=430 nm26263.刚性平面结构较稳定的平面结构n n具有强荧光的分子多数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质2727例 1，2-二苯乙烯二苯乙烯反式：平面构型反式：平面构型 强荧光体强荧光体顺式：非平面构型顺式：非平面构型 非荧光体非荧光体28284.取

29、代基效应取代基效应n n取代基对荧光物质的荧光特征和强度也取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：有很大影响。分成三类：（1 1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 有有有有-OH-OH、-OR-OR、-NH-NH2 2、-NHR-NHR、-NR-NR2 2等等等等给电子基团。给电子基团。给电子基团。给电子基团。n n由于基团的由于基团的由于基团的由于基团的 n n 电子（孤对电子）的电子云与苯环上电子（孤对电子）的电子云与苯环上电子（孤对电子）的电子云与苯环上电子（孤对电子）的电子云与苯环上的的的的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了

30、共轭 电子，扩大了共轭体电子，扩大了共轭体电子，扩大了共轭体电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。系，使荧光波长长移，荧光强度增强。系，使荧光波长长移，荧光强度增强。系，使荧光波长长移，荧光强度增强。2929（2 2 2 2）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH -COOH、-NO-NO2 2 、-COOR-COOR、-NO-NO、-SH-SH 吸电子基团吸电子基团吸电子基团吸电子基团,使荧光波长短使荧光波长短使荧光波长短使荧光波长短移，荧光强度减弱移，荧光强度减弱移，荧光强度减弱移，荧光强度减弱芳环上被芳环上被芳环上被芳环上被F F

31、、ClCl、BrBr、I I 取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。效应。效应。效应。（3 3 3 3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH -NH3

32、 3+、-R-R、-SOSO3 3HH等等等等-取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱30305.电子跃迁类型n n含含含含N N、OO、S S杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的孤对酮类物质都含有未键合的孤对酮类物质都含有未键合的孤对酮类物质都含有未键合的孤对n n电子，电子跃迁多电子，电子跃迁多电子，电子跃迁多电子，电子跃迁多为为为为n n *，系间窜跃强烈

33、，荧光很弱或不发荧光。，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。n n不含不含不含不含N N、OO、S S杂原子的有机荧光体多发生杂原子的有机荧光体多发生杂原子的有机荧光体多发生杂原子的有机荧光体多发生 *类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为10104 4，荧光强。，荧光强。，荧光强。，荧光强。3131（三）金属螯合物的荧光（三）金属螯合物的荧光n n大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某大多

34、数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定。离子的测定。离子的测定。离子的测定。n n不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与MMn+n+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或形成螯

35、合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光。产生荧光。产生荧光。产生荧光。n n例：例：例：例：8-8-羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与MMn+n+Al Al3+3+、MgMg2+2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强3232三、环境对荧光、磷光的影响三、环境对荧光、磷光的影响 1.1.溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同一荧光物质在不同

36、的溶剂中可能表现出不同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质同的荧光性质同的荧光性质同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大荧光强度增大荧光强度增大荧光强度增大2.2.温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧大多数荧光

37、物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。光强度减弱。光强度减弱。光强度减弱。温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大33333.pH的影响的影响n n大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液性质受溶液性质受溶液性质受溶液pHpH的影响很大的影响很大的影响很大的影响很大n n共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有共轭酸碱

38、对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。各自的荧光效率和荧光波长。各自的荧光效率和荧光波长。各自的荧光效率和荧光波长。6pH1pH1有荧光有荧光有荧光有荧光pH13 pH13 无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光有荧光有荧光有荧光有荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性3434四、荧光强度与荧光物质浓度的关系四、荧光强度与荧光物质浓度的关系n n用强度为用强度为用强度为用强度为I I0 0的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质时，

39、产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度I If f 用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度I If f 与浓度与浓度与浓度与浓度有下面的关系。有下面的关系。有下面的关系。有下面的关系。I Ia a为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度I I0 0为入射光强度为入射光强度为入射光强度为入射光强度荧光池荧光池I I0 0I II If f荧光荧光强度强度检测器

40、检测器n n I If f=f f（I I0 0-I-I0 01010-A-A ）=f f I I0 0 （1 1-10-10-A-A ）I=I=I I0 01010-A-A将上式展开I If f=f f I Ia a=f f（I I0 0-I-I）3535当当当当A A 0.050.05时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化n n I If f=2.3 =2.3 f f I I0 0A A =2.3 =2.3 f f I I

41、0 0 cLcL当当A 0.05时，时，I If f与与与与 f f、I I0 0、和和和和c c 有关，对一给有关，对一给有关，对一给有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，定物质，当激发光波长和强度一定时，定物质，当激发光波长和强度一定时，定物质，当激发光波长和强度一定时，f f、I I0 0、和和和和L L为常数，合并为为常数，合并为为常数，合并为为常数，合并为KK If=Kc Ip=Kc定量分析依据定量分析依据定量分析依据定量分析依据3636n n荧光强度与物质浓度呈线性关系，荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=Kc只只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微有在浓度低时使用，荧光物

42、质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。量或痕量组分，灵敏度高。n n浓度高时，浓度高时，If与与c不呈线性关系，有时不呈线性关系，有时c增大，增大，If反而降低。因为公式反而降低。因为公式 中后面影响，有中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。时发生荧光猝灭效应。If=Kc3737n n荧光猝灭荧光猝灭荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或或荧光效率荧光效率 f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。n n使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂Qn n氧分子及产生重原子效应的

43、溴化物、碘化氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等物等都是常见的荧光猝灭剂。都是常见的荧光猝灭剂。n n碰撞猝灭碰撞猝灭*M+激激 M*M*+Q MQ+热热n n自熄灭自熄灭荧光物质发射的荧光被荧光物荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。质的基态分子所吸收，即自吸收现象。3838（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器主要由主要由主要由主要由光源、单色器、光源、单色器、光源、单色器、光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个

44、单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角五、荧光和磷光分析仪器五、荧光和磷光分析仪器光源第一单色器液池检测器第二单色器放大器及记录器 ex ex ememI I0 0I I检测器检测器3939荧 光 分光光度计 示 意 图光源光源第一单色器第一单色器样品池样品池第二单色器第二单色器光电倍增管光电倍增管显示器显示器40401、光源、光源n n激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽发射强度；适用波长范围宽发射强度；适用波长范围

45、宽发射强度；适用波长范围宽n n荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源n n荧光光度计中常用高压汞灯和荧光光度计中常用高压汞灯和荧光光度计中常用高压汞灯和荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯氙弧灯氙弧灯氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm、405 nm405 nm、436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强

46、的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源41412、单色器n n荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。分析，不能获得光谱。分析，不能获得光谱。分析，不能获得光谱。n n大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，

47、较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。又可获得荧光光谱。又可获得荧光光谱。又可获得荧光光谱。n n第一单色器作用第一单色器作用第一单色器作用第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择：分离出所需要的激发光，选择：分离出所需要的激发光，选择：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长最佳激发波长最佳激发波长最佳激发波长 ex ex ，用此激发光，用此激发光，用此激发光，用此激发光 ex ex激发液池内的激发液池内的激发液池内的激发液池内的荧光物质。（荧光物质。（荧光物质。（荧光物质。（VB

48、VB2 2 ex ex为为为为471nm471nm）n n第二单色器作用第二单色器作用第二单色器作用第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射：滤掉一些杂散光和杂质所发射：滤掉一些杂散光和杂质所发射：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长的干扰光，用来选择测定用的荧光波长的干扰光，用来选择测定用的荧光波长的干扰光，用来选择测定用的荧光波长 em em。在选在选在选在选定的定的定的定的 em em 下测定荧光强度，定量分析。下测定荧光强度，定量分析。下测定荧光强度，定量分析。下测定荧光强度，定量分析。（VBVB2 2 em em为为为为525nm525nm）42423 3、

49、样品池、样品池、样品池、样品池n n盛放测定溶液盛放测定溶液盛放测定溶液盛放测定溶液.通常是石英材料的方形池，四面都通常是石英材料的方形池，四面都通常是石英材料的方形池，四面都通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边4 4、检测器、检测器、检测器、检测器n n把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号,放大放大放大放大,直接转成荧光强度直接转成荧光强度直接转成荧光强度直接转成荧光强度n n荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏荧光的强度一般较弱，要求检测器有较

50、高的灵敏荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。度，荧光光度计采用光电倍增管。度，荧光光度计采用光电倍增管。度，荧光光度计采用光电倍增管。5 5、读出装置、读出装置、读出装置、读出装置n n记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱。和发射光谱。和发射光谱。和发射光谱。n n荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是荧光分析比吸收光度法具有高得多