第二章菌种的选育保存和复苏.ppt

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1、第二章菌种的第二章菌种的选育保育保存和复存和复苏第一节第一节 菌种的分离菌种的分离一、菌种的来源一、菌种的来源l根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或菌种保藏部门索取或购买；或菌种保藏部门索取或购买；l从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。l新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。l实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染

2、了了杂杂菌菌，也也必必须重新进行分离纯化。须重新进行分离纯化。l有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。理先进的设备与之配合。l从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选选育育的的重重要要和和基础的步骤。基础的步骤。l到到目目前前为为止止，还还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。个试样中所包含的所有微生物总数和种类。l在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程

3、程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以以与与各各种种不不同同类类型型的的生生长长和和代代谢谢之之微生物相适应。微生物相适应。l因因此此，建建立立一一更更为为科科学学的的和和针针对对性性不不强强的的分分离离方方法是必要的。法是必要的。二、分离思路二、分离思路（一）成功的分离培养方法（一）成功的分离培养方法(1)(1)认真考虑所需产品的特征和生产过程；认真考虑所需产品的特征和生产过程；(2)(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。（二）培养分离中要解决的问题（二）培养分离中要解决的问题1 1、“分离什么

4、和从哪里分离出分离什么和从哪里分离出?”?”2 2、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生、必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生 长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定 性及遗传操作的难易程度等。性及遗传操作的难易程度等。3 3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。、选择适宜的培养分离方法和检测方法。（三）将生态学方法用于培养分离的（三）将生态学方法用于培养分离的一般思路要点一般思路要点1 1、罗列出所要分离的微生物类群；、罗列出所要分离的微生物类群；2 2、根据所采集样本的各种

5、生态参数，描述所要分、根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分 离的微生物之生态系统或栖息地：离的微生物之生态系统或栖息地：3 3、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各、将若干样本分成若干类型，如植物和植物各 部，土壤部，土壤(类型和土层类型和土层)、岩石、水、昆虫和发、岩石、水、昆虫和发 酵食品等；酵食品等；4 4、罗列出所要考察和测量的环境参数，如、罗列出所要考察和测量的环境参数，如pHpH、盐、盐 分、水分、氧化还原电势及温度等；分、水分、氧化还原电势及温度等；5 5、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤、列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤 中的几丁质、葡萄表皮的果胶；中的几

6、丁质、葡萄表皮的果胶；6 6、根据上述、根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方项中所获得的数据，设计分离方 法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然 浸出汁和培养条件；浸出汁和培养条件；7 7、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；、用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8 8、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；、根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9 9、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选、运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选 意义的微生物类群。意义的微生物类群。l定定方方案案：首首先先要要查查阅阅资资料料，了了解

7、解所所需需菌菌种种的的生生长长培养特性。培养特性。l采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。l增增殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培条条件件，使使所所需需菌菌种增殖培养后，在数量上占优势。种增殖培养后，在数量上占优势。l分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。l发发酵酵性性能能测测定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受受最最高高温温度度、生生长和发酵最适温度、最适长和发酵最适温度、最适pHpH值、提取

8、工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤（一）采样（一）采样1 1、采样对象、采样对象 以以采采集集土土壤壤为为主主。一一般般园园田田土土和和耕耕作作过过的的沼沼泽泽土土中中，以以细细菌菌和和放放线线菌菌为为主主，富富含含碳碳水水化化合合物物的的土土壤壤和和沼沼泽泽地地中中，酵酵母母和和霉霉菌菌较较多多，如如一一些些野野果果生生长长区区和和果果园园内内。采采样样的的对对象象也也可可以以是植物，腐败物品，某些水域等。是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选2、采样季节：、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采

9、土方式：、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地 面面5-15cm处的土约处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的 数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。以便及时分离。（二）增殖培养（二）增殖培养 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数

10、量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培养基，选择一定的培养条件来控制。培养基，选择一定的培养条件来控制。例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对对下下阶阶段段的纯种分离就会顺利得多。的纯种分离就会顺利得多。厌厌氧氧或或好好氧氧、酸酸碱碱度度的的选选择择、特特殊殊的的生生理理特特性、添加特殊的抑制剂性、添加特

11、殊的抑制剂（三）培养分离（三）培养分离 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点，好好一一点点。纯纯种种分分离离的的方方法法有有划划线线分分离离法法、稀稀释释分分离离法法。（四）筛（四）筛 选选l 这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求得适合于工业

12、生产用菌种。求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验（五）毒性试验l 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生生物物作作为为食食用用，均均需需通通过过两两年年以以上上的的毒毒性试验。性试验。(一一一一)采样和采集方法采样和采集方法采样和采集

13、方法采样和采集方法l为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。l样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑塑料料袋袋和塑料瓶等。和塑料瓶等。四、实例四、实例自然界中细菌的分离自然界中细菌的分离采样的注意事项采样的注意事项1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本

14、必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；等；4 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于存于44下，但贮存时间不宜过长。这是因为下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了一旦采样结束，

15、试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。化，微生物群体之间就会出现消长。1土样采集方法土样采集方法l森森林林、旱旱地地，草草地地可可先先掘掘洞洞，由由土土壤壤下下层层向向上上层层顺序采集；顺序采集；l水水田田等等浸浸水水土土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆圆筒筒采采集集。如如果果层层次次要要求求不不严严格格，可可取取离离地地面面5 515cm15cm处处的的土土。将将采采集集到到的的土土样样盛盛入入聚聚乙乙烯烯袋袋或或玻玻璃瓶中。璃瓶中。l在在采采集集植植物物根根际际土土

16、样样时时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部残留的土，这部分上却为根际土样。部残留的土，这部分上却为根际土样。2 2植物体采集方法植物体采集方法l在在采采集集叶叶面面时时，一一般般是是用用灭灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜鲜叶叶片片的的同同一一部部位位切切取取一一小块，并注意不要损伤周围边缘。小块，并注意不要损伤周围边缘。l选选择择叶叶面面时时应应考考虑虑叶叶位位、叶叶龄龄

17、、叶叶片片正正反反面面和和在在一片叶上的取样部位。一片叶上的取样部位。l采采集集植植物物根根及及根根系系时时，方方法法与与根根际际土土样样采采集集方方法法相相似似。将将洗洗净净的的根根装装入入采采样样袋袋中中，采采集集根根系系时时，一般与根际土样一起保存。一般与根际土样一起保存。3水样采集方法水样采集方法l用用于于细细菌菌检检测测的的水水样样应应收收集集于于100m1100m1干干净净、灭灭菌菌的的广口塑料瓶中。广口塑料瓶中。l由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静水层中采集水样。静水层中采集水样。l方方法法是是：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水

18、水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水样样进进入入。如如果果有有急急流流存存在在的的话话，应应直直接接将将瓶瓶口口反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时时应应迅迅速速并并带带有有较较大大的的弧弧度度。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。所所有有水水样样都都应应在在24h24h之之内内迅迅速速进进行行检检测测，或者或者44下贮存。下贮存。(二二)生态学参数及培养基生态学参数及培养基的组成原则的组成原则1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用

19、于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2 2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言，部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部部分分培培养养基基中中则则应应含含有有多多种种碳碳、氮氮源源，如如几丁质、纤维素或果胶。几丁质、纤维素或果胶。3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线如放线菌酮和制霉素菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50g50gm1

20、m1，以抑制真菌的生长。以抑制真菌的生长。4 4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l、2 2天。天。5 5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分也应调及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。节到与试样的生态系统参数值相近。（三）土中细菌的富集培养与分离（三）土中细菌的富集培养与分离l 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。行富集。l但但对对某某些些少少数数细细菌菌则则要要求求特特殊殊的的富富集集或或选选择择技技术才能很好地被分离培养。术才能很好地被分离培养。富

21、集方法富集方法l运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。集技术。l富集可以促进抗性的产生并维持下来。富集可以促进抗性的产生并维持下来。l土样中细菌的富集：适度稀释后，取土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m10.1m1涂布已涂布已添加及未添加富集底物添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等如几丁质、纤维素等)的的土浸出汁平板。土浸出汁平板。l植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液植物

22、体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取适度培养取样，洗涤，取1ml1ml经适度稀释后涂布平经适度稀释后涂布平板。板。l水中细菌的分离：水样通过水中细菌的分离：水样通过0.22m0.22m无菌滤膜，取无菌滤膜，取出滤膜用出滤膜用1ml1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。印分离法。水中细菌分离的简易富集技术水中细菌分离的简易富集技术l在在无无菌菌的的、用用棉棉团团塞塞好好的的广广口口三三角角烧烧瓶瓶中中连连续续培培养养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板

23、上；定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；l在在不不同同水水体体的的水水样样中中加加入入一一定定的的底底物物如如蔗蔗糖糖、多多糖糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。l培培养养过过程程中中可可加加入入低低浓浓度度的的抗抗真真菌菌剂剂以以抑抑制制真真菌菌的的生长。生长。l另另一一富富集集方方法法是是在在培培养养烧烧瓶瓶中中添添加加细细菌菌“附附着着材材料料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。，如无菌的植物组织或土壤浸出液。l通通过过改改变变培培养养温温度度和和培培养养周周期期可可选选择择性性富富集集嗜嗜冷冷性性细菌、中温菌和嗜高温菌。细菌、中温菌和嗜高温菌

24、。次代培养及纯化步骤次代培养及纯化步骤l涂涂布布的的平平板板经经培培养养后后，如如生生长长出出菌菌落落，则则按按涂涂布布不不同同稀稀释释度度的的稀稀释释液液所所得得的的单单菌菌菌菌落落和和多多菌菌菌菌落落对琼脂平板进行分类。对琼脂平板进行分类。l用用无无菌菌牙牙签签将将菌菌落落转转接接到到筛筛选选平平板板上上及及转转接接至至添添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。l筛筛选选平平板板经经培培养养后后，按按生生长长出出菌菌落落的的形形态态学学特特征征如色素、菌落形态等进行最初分组。如色素、菌落形态等进行最初分组。l将将认认为为有有希希望望的的菌菌落落用用

25、牙牙签签转转接接到到另另一一模模拟拟分分离离琼脂平板上进行筛选。琼脂平板上进行筛选。生产选种生产选种 在在长长年年累累月月的的生生产产实实践践中中，在在培培养养工工艺艺条条件件没没有有任任何何可可见见变变更更情情况况下下，突突然然发发现现某某些些批批次次生生产产水水平平提提高高较较大大，这这就就有有可可能能是是个个别别自自然然变变异异朝朝更更好好的的方方向向变变的的细细胞胞，在在这这种种条条件件下下很很适适应应于于培培养养条条件件，并并逐逐渐渐显显示示出出它它的的生生长长优优势势，这这种种优优势势的的发发展展，促促使使它它优优良良的的生生产产性性能能表表露露。进进行行类类似似新新种种筛选分离，

26、达到获得新的优良生产菌种的目的。筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。第二节第二节 工业菌种的育种方针工业菌种的育种方针工业菌种的育种：工业菌种的育种：是是运运用用遗遗传传学学原原理理和和技技术术对对某某个个用用于于特特定定生生物物技技术术目目的的的的菌菌株株进进行行的的多多方方位位的的改改造造。通通过过改改造造，可可使使现现存存的的优优良良性性状状强强化化，或或去去除除不不良性质或增加新的性状。良性质或增加新的性状。工业菌种育种的方法工业菌种育种的方法l诱变诱变l基因转移基因转移l基因重组基因重组育种过程育种过程包括下列包括下列3 3个步骤：个步骤：(1)(1)在不影响菌种活力的前提下，

27、有益基因型的在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的 引入。引入。(2)(2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。(3)(3)改良菌种的评价改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产包括实验规模和工业生产 规模规模)。选择育种方法时综合考虑的因素选择育种方法时综合考虑的因素(1)(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式如批式 或连续发酵试验或连续发酵试验)；(2)(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的 明了程度；明了程度；(3)(3)经济费用。经济费用。l如如果果对对特特定定菌菌种种的的基基本本性性状状及及其其

28、工工艺艺知知晓晓甚甚少少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：l如如果果对对其其遗遗传传及及生生物物化化学学方方面面的的性性状状已已有有较较深深的的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。工业菌种改良方法工业菌种改良方法(1)(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加 特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力 来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出来提高限速酶的含量；在代谢裔途径中引伸出 新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径

29、。新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)(2)增加前体物的浓度。增加前体物的浓度。(3)(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对对高高浓浓度度的的有有潜潜在在毒毒性性的的底底物物、前前体体或或产产品的耐受力。品的耐受力。(4)(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。(5)(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品 的结构类似物抗性。的结构类似物抗性。提高特定基因的表达水平提高特定基因的表达水平l引引入入强强转转录录及及翻

30、翻译译信信号号，可可通通过过在在一一高高效效表表达达载载体体上上克克隆隆靶靶基基因因；在在靶靶基基因因的的上上游游引引入入强强启启动动子子；修修改改现现有有表表达达信信号号，提提高高基基因因效效力等。力等。l诱导解除基因表达抑制的突变。诱导解除基因表达抑制的突变。改进菌种的生长效率改进菌种的生长效率l通过确定并改变代谢中的耗能部分通过确定并改变代谢中的耗能部分;l由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。l赋赋予予菌菌种种对对多多种种底底物物，特特别别是是价价廉廉而而丰丰富富的的底底物的利用能力，由此可降低操作费用。物的利用能力，由此可降低操作费用。提高菌

31、株对底物的利用率方法：提高菌株对底物的利用率方法：第三节第三节营养缺陷型的选育营养缺陷型的选育l营营养养缺缺陷陷型型是是指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的缺缺乏乏合合成成某某些些营营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分才才能正常生长的变异株。能正常生长的变异株。l与营养缺陷型对应的是野生型。与营养缺陷型对应的是野生型。一、基本概念一、基本概念l能能满满足足野野生生型型菌菌株株正正常常生生长长的的培培养养基基称称基基本本培培养基养基(MM)(MM)；l在在基基本本培培养养基基中中加加

32、入入相相应应的的营营养养成成分分的的称称补补充充培养基培养基(SM)(SM)；l能能满满足足各各种种营营养养缺缺陷陷型型生生长长的的称称完完全全培培养养基基(CM)(CM)，如如牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基、麦麦芽芽汁汁培培养养基基等。等。二、营养缺陷型的用途二、营养缺陷型的用途 营营养养缺缺陷陷型型在在生生产产上上和和科科学学研研究究上上用用途途很很大大。目目前前生生产产氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸的的菌菌种种都都是是各各种种类类型型的的缺缺陷陷型型。要要研研究究代代谢谢途途径径，育育种种技技术术都都必必须须有营养缺陷型的菌株为材料。有营养缺陷型的菌株为材料。三、筛选营养缺陷型的步骤三

33、、筛选营养缺陷型的步骤l出发菌株的选择出发菌株的选择l处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备l淘汰野生型淘汰野生型l检出缺陷型检出缺陷型l确定生长谱确定生长谱(一一)出发菌株的选择出发菌株的选择1 1、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较、自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较 敏感，容易达到好的效果。敏感，容易达到好的效果。2 2、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较、在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较 相像，也是良好的出发菌株。相像，也是良好的出发菌株。3 3、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多、每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多 次诱变能积累较多的提高。次诱变能积累较多的提高。

34、4 4、出发菌株开始时可以同时选、出发菌株开始时可以同时选2 23 3株，在处理株，在处理 比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。5 5、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细、要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细 胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状 大部分是隐性的，特别是高产基因。大部分是隐性的，特别是高产基因。6 6、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱、根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱 变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处 理会使细胞产生抗性，使诱变效果下

35、降。有理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有 的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期 的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。(二二)处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备 这这一一步步骤骤的的关关键键是是制制备备单单细细胞胞和和单单孢孢子子状状态态的的、活活力力类类似似的的菌菌悬悬液液，为为此此要要进进行行合合适适培培养养基基的的培养，并要离心，洗涤，过滤。培养，并要离心，洗涤，过滤。（三）诱变方法（三）诱变方法l物理诱变物理诱变l化学诱变化学诱变 根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变根据有关诱变剂及诱变处理的介绍，

36、结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。对象的实际，设计诱变处理方案。（四）淘汰野生型（四）淘汰野生型l抗抗生生素素法法：野野生生型型能能在在MMMM中中生生长长，而而缺缺陷陷型型不不能能，于于是是将将诱诱变变处处理理液液在在MMMM中中培培养养短短时时让让野野生生型型生生长长，处处于于活活化化阶阶段段，而而缺缺陷陷型型无无法法生生长长，仍仍处处于于休休眠眠状状态态。由由于于细细菌菌或或酵酵母母对对一一些些抗抗生生素素敏敏感感，于于是是就就相相应应加加入入一一定定量量的的抗抗生生素素，结结果果活活化化状状态态的的野野生生型型就就被被杀杀死死，保保存存了了缺缺陷陷型型。一一般般细细菌菌可可以以采采

37、用用青青霉霉素素，酵酵母母可可采采用用制制霉霉菌菌素。素。l菌菌丝丝过过滤滤法法：对对于于霉霉菌菌，因因孢孢子子生生长长后后会会长长出出菌菌丝丝体体，就就可可用用滤滤纸纸过过滤滤法法将将菌菌丝丝滤滤去去，而而缺缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。陷型孢子却因未发芽而不能滤过。（五）检出缺陷型（五）检出缺陷型l原原理理：在在固固体体基基本本培培养养基基和和完完全全培培养养基基上上，生生长长情情况况完完全全不不同同，缺缺陷陷型型在在CMCM上上生生长长良良好好，而而在在MMMM上则不生长，野生型都能生长。上则不生长，野生型都能生长。l具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法 1

38、 1、将一较平且直径小于、将一较平且直径小于1cm1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的金属圆筒蒙上一层灭菌 的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。2 2、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻、将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻 一压，使之成为印模，标记方位。一压，使之成为印模，标记方位。3 3、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的、将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的 同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。1、影印法、影印法4 4、将、将CMCM和和MMMM在恒温箱中培养。在恒温箱中培养。5 5、二平皿相同方位进行

39、比较，即可发现在、二平皿相同方位进行比较，即可发现在MMMM平平 皿上长出的菌落少于皿上长出的菌落少于CMCM平板上的。平板上的。MMMM上未长上未长 而相应于而相应于CMCM上长出的那几个菌落就可能是缺上长出的那几个菌落就可能是缺 陷型。陷型。此此法法要要求求平平皿皿上上菌菌落落不不能能太太多多，菌菌落落之之间间应应有有一定间隔。一定间隔。2、点种法、点种法l也就是任意法。也就是任意法。l用用接接种种针针或或牙牙签签将将CMCM上上长长出出的的菌菌落落在在MMMM和和CMCM两两副副平平板板上上接接种种，依依次次在在相相应应位位置置点点种种，然然后后一一起培养，观察其生长情况。起培养，观察其

40、生长情况。l此法结果明确，但工作量大。此法结果明确，但工作量大。3、夹层法、夹层法l先先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MMMM，凝凝固固后后再再倒倒一一薄薄层层MMMM琼琼脂脂培培养养基基，培培养养24h24h，将将出出现现的的菌菌落落标标记记，然然后后倒倒上上一一层层CMCM琼琼脂脂培培养养基基，再再培培养养。这这时时第第二二批批长出的菌落就可能是缺陷型。长出的菌落就可能是缺陷型。l此此法法缺缺点点是是，结结果果有有时时不不明明确确，而而且且将将缺缺陷陷型型菌落从夹层中挑出并不很容易。菌落从夹层中挑出并不很容易。四、营养

41、缺陷型生长谱的确定四、营养缺陷型生长谱的确定 验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷因子，即生长谱测定。因子，即生长谱测定。生长谱测定的方法生长谱测定的方法 将将缺缺陷陷型型菌菌株株培培养养后后，收收集集菌菌体体，制制备备成成细细胞胞悬悬液液，与与MMMM培培养养基基(融融化化并并凉凉至至50)50)混混合合并并倾倾注注平平皿皿。待待凝凝固固后后，分分别别在在平平皿皿的的5 56 6个个区区间间放放上上不不同同的的营营养养组组合合的的混混合合物物或或吸吸饱饱此此组组合合营营养养物物的的滤滤纸纸圆圆片片。培培养养后后会会在在某某组组合合区区长长出出，就就可可测测得所

42、需营养。得所需营养。个平皿测一个菌。个平皿测一个菌。以以不不同同组组合合的的营营养养混混合合物物与与融融化化凉凉至至5050的的MMMM培培养养基基混混合合铺铺成成平平皿皿，然然后后在在这这些些平平皿皿上上划划线线接接种种各各个个缺缺陷陷型型菌菌株株于于各各相相应应位位置置，培培养养后后根根据据在在这这些些组组合合长长出出可可推推知知其其营营养养因因子子。在在5 56 6个平皿上可测个平皿上可测2020株菌以上。株菌以上。第四节第四节基因育种基因育种 1 1、基因重组育种：、基因重组育种：运运用用体体外外DNADNA各各种种操操作作或或修修改改手手法法获获得得目目的的基基因因，再再借借助助于于

43、病病毒毒、细细菌菌质质粒粒或或其其他他载载体体，将将目目的的基基因因转转移移至至新新的的宿宿主主细细胞胞并并使使其其在在新新的的宿宿主主细细胞胞系系统统内内进进行行复复制制和和表表达达，或或者者通通过过细细胞胞间间的的相相互互作作用用，使使一一个个细细胞胞的的优优秀秀性性状状经经其其间遗传物质的交换而转移给另间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。个细胞的方法。2、一个完整的基因克隆过程包括以下、一个完整的基因克隆过程包括以下步骤步骤、获得待克隆的、获得待克隆的DNADNA片段（基因）；片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、目的基因与载体在体外连接；、重组、重组DNADNA分子导入宿主细

44、胞；分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。、重组子的扩增与或表达。基因重组基因重组载体宿主系统载体宿主系统 载体载体(vector)(vector)：是是携携带带外外源源DNADNA进进入入宿宿主主细细胞胞进进行行扩扩增增和和表表达达的的DNADNA；一一般般是是通通过过改改造造质质粒粒、噬噬菌菌体体或或病病毒毒等构建的。等构建的。载体应具备以下条件：载体应具备以下条件：、能在适当的宿主细胞中复制；、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆 位点）以便外源位点）以便外源DNAD

45、NA插入；插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载 体体DNADNA与宿主与宿主DNADNA便于分离；便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应 的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元 件。件。宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、不存在特异的内切酶体系降解外源、不存在特异的内切酶体系降解外源DNADN

46、A；、在重组、在重组DNADNA增殖过程中，不会对它进行修饰；增殖过程中，不会对它进行修饰；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、容易导入重组、容易导入重组DNADNA分子；分子；、符合重组、符合重组DNADNA操作的安全标准。操作的安全标准。第五节第五节杂交育种杂交育种 一、细菌杂交一、细菌杂交l在在细细菌菌中中实实现现杂杂交交的的种种类类尚尚不不多多，主主要要是是大大肠肠杆杆菌菌，其其他他还还有有鼠鼠伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌、淋病奈氏球菌等。淋病奈氏球菌等。l大大肠肠杆杆菌菌中中存存着着致致育育因因子子F F，有有F F因因子子为为F+

47、F+，没没有有F F因子称因子称F-F-。lF F因因子子存存在在于于细细胞胞中中形形式式：游游离离状状态态(F+(F+细细胞胞)；整整合合状状态态，即即F F因因子子插插入入胞胞核核质质的的一一定定位位置置上上(Hfr(Hfr细胞细胞)。lF F因因子子有有明明显显的的感感染染性性，大大肠肠杆杆菌菌的的接接合合，实实质质上上是是F F因因子子的的转转移移，所所以以F+F+和和HfrHfr称称供供体体菌菌，而而F-F-称受体菌。称受体菌。二、酵母杂交育种技术二、酵母杂交育种技术 1 1、酵母繁殖方式、酵母繁殖方式 酵酵母母为为单单细细胞胞型型真真菌菌，一一般般以以出出芽芽方方式式生生殖殖，在在

48、通通常常情情况况下下，繁繁殖殖体体为为双双倍倍体体，但但经经过过特特定定条条件件的的诱诱导导，可可使使其其产产生生单单倍倍体体孢孢子子并并可可出出芽芽产产生生单单倍倍体繁殖体。体繁殖体。l单单倍倍体体细细胞胞具具及及22两两种种交交配配型型。两两种种交交配配型型细细胞胞经经其其细细胞胞壁壁上上特特定定的的凝凝聚聚因因子子诱诱导导而而进进行行交交配配，恢恢复复为为双双倍倍体体；同同一一交交配配型型细细胞胞之之间间，则则因因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。l在在生生活活过过程程中中，酵酵母母细细胞胞还还可可以以形形成成三三倍倍体体、四四倍体、多倍体或非整

49、倍体细胞。倍体、多倍体或非整倍体细胞。2 2、酵母杂交、酵母杂交 一一般般而而言言，杂杂交交育育种种运运用用了了酵酵母母的的单单双双倍倍生生活活周周期期，将将不不同同基基因因型型和和相相对对的的交交配配型型的的单单倍倍体体细细胞胞经经诱诱导导杂杂交交而而形形成成二二倍倍体体细细胞胞，经经筛筛选便可获得新的遗传性状。选便可获得新的遗传性状。酵酵母母的的杂杂交交方方法法有有孢孢子子杂杂交交法法、群群体体交交配配法法、单单倍倍体体细细胞胞杂杂交交法法和和罕罕见见交交配配法法。就就啤啤酒酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。第六节第六节原生质体育种原生质体育种l

50、原原生生质质体体育育种种技技术术主主要要有有原原生生质质体体融融合合、原原生生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。l原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。l原原生生质质体体融融合合作作为为一一种种新新的的基基因因重重组组手手段段是是19781978年年第第三三届届国国际际工工业业微微生生物物遗遗传传学学讨讨论论会会上上提出来的。提出来的。一、原生质体融合育种的特点一、原生质体融合育种的特点1 1、杂交频率较高：、杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形