第九章转基因动物与生物反应器.ppt

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1、第九章第九章转基因基因动物与生物反物与生物反应器器 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为定整合有人工导入外源基因的动物称为转基因动物转基因动物（transgenetic animal）。）。引引 言言1.转基因牛转基因牛从屠宰场杀掉的奶牛体内

2、收集从屠宰场杀掉的奶牛体内收集 卵母细卵母细胞，并使之在体外成熟胞，并使之在体外成熟用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受精；精；受精卵离心，浓缩卵黄；受精卵离心，浓缩卵黄；将欲导入的将欲导入的DNA微注射到微注射到当当前核中；前核中；对胚胎进行体外培养；对胚胎进行体外培养；利用非外科移植术将一个胚胎植入发情利用非外科移植术将一个胚胎植入发情的代孕母牛子宫内；的代孕母牛子宫内；对对子子代进行代进行DNA检测，确定是否存在检测，确定是否存在转转入入基因。基因。转基因动物研究现状转基因动物研究现状2.转基因绵羊、山羊和猪转基因绵羊、山羊和猪囊性纤维化跨囊性纤维化跨膜传

3、导调节因子膜传导调节因子在山羊奶中生产在山羊奶中生产ATT3.转基因禽类转基因禽类4.转基因鱼转基因鱼将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因；其细胞中都携带有转入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。培育新的纯合系。外源目的基因的制备外源

4、目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系筛选所得的转基因动物品系转基因动物技术路线转基因动物技术路线9.1 目的基因的制备目的基因的制备9.1.1 目的基因的来源目的基因的来源9.1.2 目的基因的克隆目的基因的克隆9.1.3 目的基因的转移目的基因的转移9.1.1目的基因的来源目的基因的来源1.采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；采用限制性内切酶

5、，从生物组织中获取目的基因；2.通过通过mRNA合成合成cDNA；3.人工合成的人工合成的DNA片段；片段；4.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。）扩增特定基因片段。9.1.2 目的基因的克隆目的基因的克隆通过载体在适当的宿主中克隆通过载体在适当的宿主中克隆选择载体选择载体目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞通过通过PCR反应克隆目的基因反应克隆目的基因9.1.3 目的基因的转移目的基因的转移u电穿孔法电穿孔法u显微注射法显微注射法u裸露裸露DNA直接注射直接注射u磷酸钙磷酸钙DNA共沉淀法共沉淀法u脂质载体包埋法脂质载体包埋法u

6、病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法 A.电穿孔法电穿孔法 实现外源基因的转移实现外源基因的转移利用脉冲电场提高细胞利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外膜的通透性，从而使外源源DNA转移至细胞中。转移至细胞中。此法简单、效率较高，此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的广泛应用于培养细胞的基因转移。基因转移。显微注射转基因技术显微注射转基因技术B.利用显微操作技术转移利用显微操作技术转移外源基因的方法。外源基因的方法。此法转入基因长度可达此法转入基因长度可达数百数百kb；并能随机地整合；并能随机地整合在受体细胞染色体在受体细胞染色体DNA上，上，因此应用范围广。因此应用范围广。但是这种

7、整合有时会导但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突排、易位、缺失或定点突变。变。C.磷酸钙磷酸钙DNA共沉淀法共沉淀法这种方法是受二价金属离这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙当核酸以磷酸钙DNA共共沉淀物的形式在时，细胞沉淀物的形式在时，细胞摄取摄取DNA的能力显著加强。的能力显著加强。但转移效率较低，仅有但转移效率较低，仅有1%5%的外源的外源DNA可以可以进入受体细胞核中，大约进入受体细胞核中，大约仅有仅有1%的的DNA可以在细可以在细胞中稳定表达。胞中稳

8、定表达。D.脂质载体包埋法脂质载体包埋法将需要转移的外源将需要转移的外源DNA或或RNA包裹于脂质体内，由包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，可以与受体细胞膜融合，从而将外源从而将外源DNA转入宿主转入宿主细胞。细胞。这种方法转基因效这种方法转基因效率高。率高。病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法9.2 转基因动物的培育技术转基因动物的培育技术基因显微注射法基因显微注射法胚胎干细胞移植法胚胎干细胞移植法反转录病毒法反转录病毒法精子载体导入法精子载体导入法YAC介导的基因转移介导的基因转移细胞核移植技

9、术细胞核移植技术何为显微注射？何为显微注射？显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，分子，成为转基因动物。成为转基因动物。9.2.1 基因显微注射法基因显微注射法通通过过激激素素疗疗法法使使小小鼠鼠超超数数排排卵卵，开开始始时时注注射射雌雌性性

10、妊妊娠娠血血清清，4848小小时时后后再再注注射射人人绒绒毛毛膜膜促促性性腺腺激激素素，这这时时小小鼠鼠便便会会超超数数排排卵卵，一一般般情情况况下下5-105-10个个，超数排卵为超数排卵为3535个；个；与与雄雄性性小小鼠鼠交交配配，然然后后杀杀掉掉小小鼠鼠，从从其其输输卵卵管管内取出受精卵；内取出受精卵；将将经经纯纯化化的的转转基基因因样样品品迅迅速速注注射射入入受受精精卵卵中中变变大的雄性原核内大的雄性原核内 ；DNADNA显微注射法的基本程序显微注射法的基本程序将将25-40个注射了转基因的受精卵移植入个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转

11、基因小鼠受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代子代；从小鼠子代体内取出从小鼠子代体内取出DNA样品进行杂交，样品进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点鉴定转基因的整合与否及位点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达因是否遗传及表达。通过通过DNA显微注射获得转基因小鼠示意图显微注射获得转基因小鼠示意图1.显微注射显微注射DNA的制备与纯化的制备与纯化uDNA构型和末端结构构型和末端结构u载体载体uDNA的长度与浓度的长度与浓度u溶解溶解DNA的缓冲液的缓冲液uDNA的纯度的纯度2.鼠的准备与要求鼠的准备与要求转基因鼠实验所用各类鼠转基因鼠实验

12、所用各类鼠3.超排卵与取卵超排卵与取卵孕马血清（孕马血清（PMS）其有效成分为卵泡刺激素（）其有效成分为卵泡刺激素（FSH）。）。人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激素（hGG）雌鼠的排卵时间：PM10.0012.00雄鼠的排精时间：PM10.0012.00受精一般发生在：AM1.00超排卵超排卵制定排卵程序：制定排卵程序：(1)于第一日中午先向小鼠腹腔内注入于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一一l 0单位的单位的PMS；(2)过过48小时小时(第三天中午第三天中午)腹腔内注入腹腔内注入510单位的人单位的人hCG(注射后注射后1113 小时后排卵小时后排卵)；(3)令雌雄动物一对一的合笼交配；

13、动物半夜交尾，如未发令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再重用，但成功率下降；生交配，两周后可再重用，但成功率下降；(4)检查阴栓检查阴栓(第四日晨第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。受精则出现阴栓。2 受精卵的收集受精卵的收集(1)检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物：检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物：(2)取输卵管：剖开腹腔取出输卵管，置入含有取输卵管：剖开腹腔取出输卵管，置入含有3ml培培养液的养液的60mm直径的瓶皿中；直径的瓶皿中；(3)取卵子；在取卵子；在20或或50解剖镜下找到输卵管

14、，在卵管解剖镜下找到输卵管，在卵管膨大的壶腹部膨大的壶腹部(于卵管开口近处于卵管开口近处)隐约可见内含的胚卵，隐约可见内含的胚卵，把胚卵团用尖摄轻轻压挤出，用吸管移入含有把胚卵团用尖摄轻轻压挤出，用吸管移入含有400 l分离液的表玻皿中；分离液的表玻皿中；(4)另准备另准备45个平皿，每皿内均充有胚胎培养基个平皿，每皿内均充有胚胎培养基400 l并覆盖有厚并覆盖有厚8mm硅烷油或液硅烷油或液 体石蜡层体石蜡层(Fisher产，研究用产，研究用)，硅烷油和石蜡巳预先在，硅烷油和石蜡巳预先在5%CO2中置中置371小时做平衡处理。小时做平衡处理。覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、覆硅烷油或

15、石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和散热和pH改变；改变；(5)向含卵团表玻皿的分离液中加向含卵团表玻皿的分离液中加5 l新制备的透明新制备的透明质酸酶质酸酶(透明质酸酶透明质酸酶10mg1ml分离液，分离液，Sigma产产)，把胚卵团消化分散开；，把胚卵团消化分散开；(6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接种入任一培养液小转移入培养皿中，通过硅油层接种入任一培养液小滴中滴中)，以清除酶的继续作用；，以清除酶的继续作用；(7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱

16、碎片和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口碎片能堵塞吸管口)，此时的卵己可用此时的卵己可用作作DNA注射之用。注射之用。4.DNA显微注射显微注射1）制备持卵管与注射针）制备持卵管与注射针u持卵管制备：持卵管制备：在火焰灯上将微玻璃管拉成在火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约中间较细的约510cm长的一段，其口径长的一段，其口径约约80120 m，用玻璃刀将其在离颈部，用玻璃刀将其在离颈部2cm处切断，再把切口烧成如图形状，口处切断，再把切口烧成如图形状，口径约径约15 m。将尖部移近火焰喷灯略加热，。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所示角度

17、。示角度。u注射针的制备：注射针的制备：由拉针器制成，针的口径由拉针器制成，针的口径应低于应低于1 m。（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡（厚约5mm）；（2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100l为单元的小滴数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液小滴中；2 DNA注射注射（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重悬于注射缓冲液中(含1mgDNAml)，使其最终浓度为：0.050.5mg/ml（5）于临注射前把DN

18、A样品在Eppendorf管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消除末溶解物，防止阻塞注射管口；（6）把待注射用的DNA装入注射管中；（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养液，仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；（8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，然后通过透明带刺入胚卵细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；注射

19、细胞数量越多越好；（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；（10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。5.体内接种体内接种（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用；（2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液，排出后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)；最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别；（3）麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；（4）剪出背肾部两侧毛，碘酒酒精

20、消毒；（5）使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；（6）轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入输卵管内；（7）把输卵管及周围组织送回腹腔内；（8）仔细紧密缝合创口，（9）再令动物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。6.显微注射法获得转基因鼠的成活率显微注射法获得转基因鼠的成活率优点：优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。缺点：缺点：缺点：缺点

21、：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转移动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。9.2.3 胚胎干细胞方法胚胎干细胞方法1.ES细胞的建立与维持细胞的建立与维持动物的准备：动物的准备：取受精之后3.5天的母鼠分离鼠胚。胚胎的分离和初培养：胚胎的分离和初培养：3.5天孕鼠鼠断颈

22、处死解剖小鼠取出胚胎体外培养胚胎46天后，离散ICM。ICM的离散与的离散与ES的分离：的分离：分离ICM酶解细胞团培养离散细胞ES细胞集落ES细胞的扩增：细胞的扩增：离散ES细胞置四孔培养板中培养ES细胞的常规培养：细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养2.ES细胞的基因组操作细胞的基因组操作将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2）转入的目的基因（TG）编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（ne

23、or）两个不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）3.转基因转基因ES细胞的筛选细胞的筛选正负选择法正负选择法正选择法筛选出转基因整合型正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：细胞：通过物理方法将重组DNA分子导入ES细胞，在含有抗菌素G418的培养基中，没有整合外源基因的细胞将全部死亡，只有整合了外源基因的细胞才可以存活下来。负选择法筛选出特异整合型负选择法筛选出特异整合型ES细胞：细胞：如果非特异性整合发生，则两个tk基因或其中一个基因很大可能与TG和neor一起整合，这时用GCV筛选，tk基因表达的胸苷激酶能反GCV(环鸟苷)转化成毒性氨基酸，使细胞死亡。这是负选反择。4.转基因转

24、基因ES细胞的检测细胞的检测5.转基因小鼠的繁育转基因小鼠的繁育 正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后正确整合的转基因胚胎干细胞经培养后就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚就可以移入胚泡期的供体胚胎了。将这些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基胎移植到假孕的代孕母鼠子宫内，繁育转基因小鼠。因小鼠。6.获得纯合的转基因鼠获得纯合的转基因鼠优点：优点：基因转移效率大大提高，且能进行定位基因基因转移效率大大提高，且能进行定位基因转移。转移。缺点：缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳类动物来说，饲养成本高，产仔数较少的大

25、型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。1.反转录病毒感染法的原理反转录病毒感染法的原理9.2.3 反转录病毒法反转录病毒法2.反转录病毒感染法的载体的构建反转录病毒感染法的载体的构建提取病毒未整合的环状形式提取病毒未整合的环状形式DNA；将环状将环状DNA克隆到适当的载体中；克隆到适当的载体中；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；将外源目的基因克隆到载体中将外源目的基因克隆到载体中3.通过物理方法将重组通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞分子转入包装细胞 反转录病毒载体的工作原理

26、：反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病毒由于没有包装信号，能生产病毒RNA和所有蛋白质，但不能和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。4.重组反转录病毒感染早期胚胎重组反转录病毒感染早期胚胎（1）人为）人为感染感染着床前或着床后的着床前或着床后的胚胎。胚胎。（2）直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养）直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育

27、以达到感染目的。细胞共孵育以达到感染目的。可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组因组DNA中。中。优优点点：能能有有效效地地将将基基因因整整合合入入受受体体细细胞胞的的基基因因组组内内，单单拷拷贝贝整整合合型型；转转基基因因整整合合后后能能稳稳定定地地遗遗传传；整整合合机机制制相相应应明明确确，在在TR区域内进行，不会破坏转基因结构区域内进行，不会破坏转基因结构 缺缺点点：载载量量较较小小，一一般般只只有有8kb，可可能能会会因因缺缺少少必必须须的的调调控控元元件件而而影影响响转转基基因因表表达达；尽尽管管病病毒毒载载体体被被设设计计为为复复制制缺

28、缺陷陷型型的的，但但在在包包装装细细胞胞的的包包装装过过程程中中，若若与与整整合合型型辅辅助助表表达达基基因因组组发发生生同同源源重重组组，就就有有可可能能组组装装成成野野生生型型逆逆转转录录病病毒毒颗颗粒粒，因因此此在在构构建建具有商业价值的转基因具有商业价值的转基因 动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。9.2.4 精子载体法精子载体法显微注射技术的效率很低，设备昂贵。显微注射技术的效率很低，设备昂贵。直接用直接用精子作为外源精子作为外源DNA载体载体的转移方法。的转移方法。主要问题：重复性不好主要问题：重复性不好基本原理和方法基本原理和方法精子直接与外源

29、精子直接与外源DNA混合培养混合培养，外源基因可以直，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。后来后来Rottman对此方法进行了改进，将外源对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与体与DNA相互作用形成脂质体相互作用形成脂质体DNA复合物复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。细胞内。uDNA的提取的提取u斑点杂交和斑点杂交和PCR扩增扩增uSouthern杂交杂交uNorthern杂交杂交u表达产的

30、检测表达产的检测转基因动物的检测转基因动物的检测一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用研究基因的结构与功能研究基因的结构与功能研究基因的组织特异性表达研究基因的组织特异性表达研究发育相关基因的表达与调控研究发育相关基因的表达与调控克隆在发育中起重要作用的基因克隆在发育中起重要作用的基因基因多级调节系统的研究基因多级调节系统的研究细胞功能研究细胞功能研究9.3 转基因动物的应用转基因动物的应用基因打靶基因打靶基因整合三种方式：基因整合三种方式：基因随机插入基因随机插入基因敲除基因敲除基因替换基因替换基因打靶基因打靶基因打靶基因打靶基因敲除（基因敲除（ge

31、ne knock out），是指对一个结构已），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分期生理学研究中常用的切除部分观察整体观察整体推测功能的三部曲思想相似。推测功能的三部曲思想相似。基因敲除的技术路线如下：基因敲除的技术路线如下：（1）构建重组基因载体）构建重组基因载体（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组）用电穿孔、显微注射等方

32、法把重组DNA转入转入受体细胞核内受体细胞核内（3）用选择培养基筛选已击中的细胞）用选择培养基筛选已击中的细胞（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。二、转基因动物在医药研究领域中的应用二、转基因动物在医药研究领域中的应用研究病毒性疾病研究病毒性疾病研究建立人类疾病的转基因动物模型研究建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物与基因治疗转基因动物与基因治疗生产天然活性药物蛋白生产天然活性药物蛋白转基因动物的低效性转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基

33、因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题转入基因的表达问题病毒转基因研究存在的问题病毒转基因研究存在的问题转基因动物模型与预期不符问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题乳腺生物反应器的问题社会问题社会问题9.2.7 转基因动物研究存在的问题转基因动物研究存在的问题一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如

34、，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。9.4 动物生物反应器动物生物反应器微生物反应器植物反应器动物反应器(一)优点1可以利用发酵工程技术大规模生产。2胞外活性物质制备容易。（二）不足1哺乳动物或人类的基因往往不能表达。有些表达了，却没有活性，需要进一步修饰。2真核生物蛋白质翻译后加工的精确性有限。3需要大型发酵设备和车间。4细菌发酵常形成不溶聚合物，使下游加工成本增加。（一）优点1可大规模

35、种植，上游生产成本较低。作为食物可省去下游加工步骤。2转基因植物自交后可得到稳定遗传的遗传性状。3可利用植物组织和细胞培养技术实现大量制备。（二）不足1植物种植受季节、环境影响。2需专门的活性物质分离设备与技术。3植物细胞培养需要发酵罐等设备和技术支持，成本较高。（一）优点1易养殖，实现大规模制备。2通过乳腺和血液制备活性物质简单易行。3可以通过动物细胞培养实现大量制备。（二）不足1细胞培养需要昂贵的培养基和设备。2转基因动物制备成本昂贵。3转基因动物易产生一些伦理问题。一一、动物血液生物反应器动物血液生物反应器 外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生

36、物反应器。物反应器。大家畜的血液容量较大大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。血细胞组分可通过裂解细胞获得。二、动物膀胱生物反应器二、动物膀胱生物反应器外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源

37、基因插入5端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。三、动物乳腺生物反应器三、动物乳腺生物反应器动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺指导外源基因在乳腺中表达中表达,并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。1.动物乳腺生物反应器的制备动物乳腺生物反应器的制备（1）表达载体的构建）表达载体的构建 目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控蛋白基因启动子元件

38、，主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是元件：第一类是B2乳球蛋白乳球蛋白(BL G)，第二类是酪蛋白，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。（2）目的基因的选择）目的基因的选择 选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基因。达量低、应用前景广阔的蛋白基因。（3）体外重组）体外重组 选择好目的基因和启

39、动子调控元件后进行体外选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。重组，构建融合基因。（4）基因转导）基因转导 将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。精卵。（5）胚胎移植）胚胎移植 利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过采集转基因动物的乳汁表达个体。通过采集转基因动物的乳汁,来获得目的来获得目的基因表达产物。基因表达产物。（6）鉴定）鉴定 转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和转基因

40、动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。乳腺分泌物两个方面进行鉴定。2.动物乳腺生物反应器的优点动物乳腺生物反应器的优点u产品质量稳定产品质量稳定u产品成本低产品成本低u研制开发周期短研制开发周期短u无污染无污染u经济效益显著经济效益显著3.动物乳腺生物反应器的应用动物乳腺生物反应器的应用u高乳汁营养价值高乳汁营养价值u生产药用蛋白生产药用蛋白 患有庞普病的婴儿体内一种可促进糖原物质代患有庞普病的婴儿体内一种可促进糖原物质代谢的酶有缺陷。谢的酶有缺陷。荷兰研究人员培育出一种转基荷兰研究人员培育出一种转基因兔，兔奶中表达这种酶，因此饮用这种奶可因兔，兔奶中表达这种酶，因此饮用这种奶可以治疗这种疾病。以治疗这种疾病。4.动物乳腺生物反应器存在的问题动物乳腺生物反应器存在的问题（1）外源基因在动物体内的位点整合问题）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题）伦理道德问题 谢谢