大肠菌群检验.ppt

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1、大肠菌群检验二、大肠菌群的定义及检测方法1 1、大肠菌群的传统定义、大肠菌群的传统定义 大肠菌群（大肠菌群（Coliform groupColiform group）系指一群需氧系指一群需氧及兼性厌氧，在及兼性厌氧，在37 37 2424小时能小时能小时能小时能发酵乳糖产酸产发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。包括肠杆菌科的艾希氏菌属、柠檬酸杆菌包括肠杆菌科的艾希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。其中以艾希氏菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属。其中以艾希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，其它三属习惯上属为主，称为典型大肠杆菌，其它三属习惯上称为典型大肠杆菌。称为典型

2、大肠杆菌。2 2、大肠菌群检验的标准方法、大肠菌群检验的标准方法（1 1）最近拟数法（）最近拟数法（MPNMPN）（）（GB4789.2-1994GB4789.2-1994）样品样品 0.1g3 0.01g 3 0.001g 3 乳糖胆盐发酵管 37 24hr 产酸产气管 伊红美蓝平板（分离）37 24hr可疑菌落 乳糖发酵管（证实）37 24hr 根据经证实的乳糖胆盐发酵管 阳性管数，查MPN表。（2 2）平板直接计数法（）平板直接计数法（SN0169-92SN0169-92）样品 0.1g2 0.01g 2 0.001g 2 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）37 24hr 计数紫红色菌落，

3、乘以稀释倍数报告3 3、ISOISO关于大肠菌群的定义（关于大肠菌群的定义（关于大肠菌群的定义（关于大肠菌群的定义（ISO9308-1ISO9308-1：20002000）（ISOISO：INTERNATIONAL STARDIZATION INTERNATIONAL STARDIZATION ORGANIZATIONORGANIZATION国际标准化组织）国际标准化组织）大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，可需氧或兼性厌氧地生长在含胆盐（或其他具有同样抑制生长性能的表面活性剂）的培养基上，当在36 2培养时，通常能于48hr内发酵乳糖产酸和醛。它们还具有-半乳糖苷酶。4、依据

4、-半乳糖苷酶快速测定大肠菌群的原理 大肠菌群产生的大肠菌群产生的大肠菌群产生的大肠菌群产生的-半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物（即色基半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物（即色基半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物（即色基半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物（即色基与与与与-半乳糖的结合物），使带色基团游离而显色或发荧光。该反半乳糖的结合物），使带色基团游离而显色或发荧光。该反半乳糖的结合物），使带色基团游离而显色或发荧光。该反半乳糖的结合物），使带色基团游离而显色或发荧光。该反应灵敏快速。应灵敏快速。应灵敏快速。应灵敏快速。测定测定测定测定-半乳糖酶常用的底物有半乳糖酶常用的底物有半乳糖酶常用的底物有半

5、乳糖酶常用的底物有4-4-甲基伞形酮甲基伞形酮甲基伞形酮甲基伞形酮-D-D半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷（MUGalMUGal）、）、）、）、5-5-溴溴溴溴-4-4氯氯氯氯-3-3-吲哚吲哚吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷（半乳糖苷（半乳糖苷（半乳糖苷（X-galX-gal）、）、）、）、3 3，4-4-环环环环已酮已酮已酮已酮-D-D-半乳糖苷和半乳糖苷和半乳糖苷和半乳糖苷和8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉-D-D-半乳糖苷等。半乳糖苷等。半乳糖苷等。半乳糖苷等。19931993年年年年BrennerBrenner等人用加等人用加等人用加等人用加4-4-甲基伞形酮甲基伞形酮甲基伞形酮甲

6、基伞形酮-D-D-半乳糖苷（半乳糖苷（半乳糖苷（半乳糖苷（MUGalMUGal）和吲哚氧基和吲哚氧基和吲哚氧基和吲哚氧基-D-D-葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌33，取得满意结果。，取得满意结果。，取得满意结果。，取得满意结果。19951995年该方法被美国国家环境保护署采纳年该方法被美国国家环境保护署采纳年该方法被美国国家环境保护署采纳年该方法被美国国家环境保护署采纳（Code of Federal Regulation 40,141.21 Protection

7、Of Code of Federal Regulation 40,141.21 Protection Of EnvironmentEnvironment）。）。）。）。美国美国美国美国SIGMASIGMA公司有商品化试剂，但价格昂贵。公司有商品化试剂，但价格昂贵。公司有商品化试剂，但价格昂贵。公司有商品化试剂，但价格昂贵。20002000年年年年JamesJames等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物茜素茜素茜素茜素-D-D-半乳糖苷（半乳糖苷（半乳糖苷（半乳糖苷（Ali

8、zAliz-gal-gal）。该试剂具有比同类酶底物更灵该试剂具有比同类酶底物更灵该试剂具有比同类酶底物更灵该试剂具有比同类酶底物更灵敏的性能，在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落，色素为敏的性能，在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落，色素为敏的性能，在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落，色素为敏的性能，在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落，色素为脂溶性不扩散，易与辨别，另还脂溶性不扩散，易与辨别，另还脂溶性不扩散，易与辨别，另还脂溶性不扩散，易与辨别，另还可以和不同的阳离子（可以和不同的阳离子（可以和不同的阳离子（可以和不同的阳离子（FeFeFeFe、AlAlAlAl、K K K K

9、、NH4NH4NH4NH4）形成带色的螯合物，这样就便于和其他的显色剂合用，组成形成带色的螯合物，这样就便于和其他的显色剂合用，组成形成带色的螯合物，这样就便于和其他的显色剂合用，组成形成带色的螯合物，这样就便于和其他的显色剂合用，组成具有多种性能的鉴别培养基，以提高检测的灵敏度。目前，国内具有多种性能的鉴别培养基，以提高检测的灵敏度。目前，国内具有多种性能的鉴别培养基，以提高检测的灵敏度。目前，国内具有多种性能的鉴别培养基，以提高检测的灵敏度。目前，国内外均无商品化试剂出售。外均无商品化试剂出售。外均无商品化试剂出售。外均无商品化试剂出售。三、应用三、应用三、应用三、应用4-4-甲基伞形酮甲

10、基伞形酮甲基伞形酮甲基伞形酮-D-D-半乳糖苷快速检验半乳糖苷快速检验半乳糖苷快速检验半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群食品中的大肠菌群食品中的大肠菌群食品中的大肠菌群1、检测步骤、检测步骤 样品 0.1g3 0.01g 3 0.001g 3 MUGal肉汤 37 24hr 在紫外光下观察产荧光管数，查MPN表得MPN值 大肠菌群大肠菌群-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 4-甲基伞形酮甲基伞形酮-D-半乳糖苷半乳糖苷 4-甲基伞形酮（兰色荧光）甲基伞形酮（兰色荧光）MUGalMUGal肉汤肉汤肉汤肉汤：胰蛋白胨胰蛋白胨胰蛋白胨胰蛋白胨2020g g 氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠5 5g g 无水磷酸氢二钾

11、无水磷酸氢二钾无水磷酸氢二钾无水磷酸氢二钾2.752.75g g 无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾2.752.75g g 月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.10.1g g MUGal MUGal0.08g0.08g 水水水水10001000mlml 加热使溶化，调加热使溶化，调加热使溶化，调加热使溶化，调Ph7.4Ph7.4，分装试管，每管分装试管，每管分装试管，每管分装试管，每管1010mlml，116116高压灭菌高压灭菌高压灭菌高压灭菌1010minmin。待待待待培养基冷却后，以无菌手培养基冷却后，以无菌手培养基冷却后，以无菌手培养基冷却后，以

12、无菌手续在每管培养液内加入续在每管培养液内加入续在每管培养液内加入续在每管培养液内加入0.10.1mLmL经过滤除菌的经过滤除菌的经过滤除菌的经过滤除菌的500500ug/mLug/mL头孢磺啶头孢磺啶头孢磺啶头孢磺啶稀释稀释稀释稀释液。液。液。液。2、试验情况简介当在当在MUGal肉汤中生长的大肠菌群数量较少时肉汤中生长的大肠菌群数量较少时也可在紫外灯下呈现明显的蓝色荧光，反应较也可在紫外灯下呈现明显的蓝色荧光，反应较乳糖产酸显色快速灵敏，结果易读。乳糖产酸显色快速灵敏，结果易读。以以13株与肠杆菌科相关的标准菌株验证株与肠杆菌科相关的标准菌株验证MUGal肉汤，其结果与在肉汤，其结果与在L

13、ST和乳糖胆盐肉汤中的乳和乳糖胆盐肉汤中的乳糖发酵结果完全一致，符合相关菌株的特性。糖发酵结果完全一致，符合相关菌株的特性。将自制将自制MUGal与与SIGMA产产MUGal比较测试比较测试26份样品，两者阳性符合率为份样品，两者阳性符合率为94.6%。以自制以自制MUGal肉汤与肉汤与LST肉汤比较检测肉汤比较检测66份样份样品中大肠菌群，其品中大肠菌群，其24h阳性检出率是阳性检出率是LST肉汤肉汤48h的的1.5倍，但延长倍，但延长LST肉汤培养时间至肉汤培养时间至96小小时后，两者结果逐步接近。表明时后，两者结果逐步接近。表明MUGal多检出多检出的阳性部分多为受伤生长缓慢或迟缓发酵乳

14、糖的阳性部分多为受伤生长缓慢或迟缓发酵乳糖的大肠菌群类菌株所致。的大肠菌群类菌株所致。将将MUGal肉汤阳性管中的可疑菌株进行触酶、肉汤阳性管中的可疑菌株进行触酶、氧化酶和硝酸盐还原试验，并任选其中氧化酶和硝酸盐还原试验，并任选其中18株用株用API 20E鉴定。证明鉴定。证明95.1%的的MUGal肉汤阳性肉汤阳性管中含有大肠菌群。管中含有大肠菌群。综上所述，自制综上所述，自制MUGal肉汤检测大肠菌群灵肉汤检测大肠菌群灵敏、快速、准确，无需验证，可一次完成。自敏、快速、准确，无需验证，可一次完成。自制制MUGal性质稳定，无游离荧光，可替代昂贵性质稳定，无游离荧光，可替代昂贵的进口产品使用

15、。鉴于以的进口产品使用。鉴于以MUGal检测大肠菌群检测大肠菌群的方法早在的方法早在1995年即为美国国家环境保护署采年即为美国国家环境保护署采纳纳，有关大肠菌群具有，有关大肠菌群具有-半乳糖苷酶的特性，半乳糖苷酶的特性，也在也在ISO 9308-1:2000给予了明确的定义。因此，给予了明确的定义。因此，经过本次试验我们认为，以经过本次试验我们认为，以MUGal肉汤快速检肉汤快速检测食品中大肠菌群作为一种推荐的标准方法加测食品中大肠菌群作为一种推荐的标准方法加以应用是可行的。以应用是可行的。四、应用茜素四、应用茜素四、应用茜素四、应用茜素-D-D-半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群半乳糖苷快速

16、检验食品中的大肠菌群半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群1 1、检测步骤、检测步骤、检测步骤、检测步骤 样品 0.1g2 0.01g 2 0.001g 2 Aliz-gal琼脂37 24hr 计数紫色和红色菌落，乘以稀释倍数报告 大肠菌群大肠菌群-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 茜素茜素茜素茜素-D-半乳糖苷半乳糖苷 茜素茜素茜素茜素Fe.NH4.Al.KFe.NH4.Al.K（紫色和红色）茜素茜素茜素茜素-D-D-半乳糖苷琼脂半乳糖苷琼脂半乳糖苷琼脂半乳糖苷琼脂（Alig-galAlig-gal琼脂）：琼脂）：琼脂）：琼脂）：Aliz-gal Aliz-gal 5050

17、mgmg蛋白胨蛋白胨蛋白胨蛋白胨2020g g无水磷酸氢二钾无水磷酸氢二钾无水磷酸氢二钾无水磷酸氢二钾2.752.75g g无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾无水磷酸二氢钾2.752.75g g氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠5 5g g月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.10.1g g异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷0.030.03g g硫酸铝钾硫酸铝钾硫酸铝钾硫酸铝钾0.50.5g g 柠檬酸铁铵柠檬酸铁铵柠檬酸铁铵柠檬酸铁铵0.50.5g g琼脂琼脂琼脂琼脂1515g g蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水10001000mLmL。调调调调Ph

18、7.4Ph7.42、试验情况简介 AlizAliz-gal-gal检检检检测测测测食食食食品品品品中中中中大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群可可可可在在在在18-2418-24h h内内内内显显显显示示示示出出出出半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶反反反反应应应应，在在在在同同同同类类类类性性性性质质质质的的的的酶酶酶酶底底底底物物物物中中中中，AlizAliz-gal-gal的的的的用用用用量量量量较较较较低低低低，做做做做倾倾倾倾注注注注培培培培养养养养时时时时在在在在琼琼琼琼脂脂脂脂深深深深层层层层菌菌菌菌落落落落特特特特征征征征较较较较明明明明显。显。显。显。由由由由于于于于采采采

19、采用用用用测测测测定定定定-半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶的的的的方方方方法法法法易易易易于于于于检检检检出出出出迟迟迟迟缓缓缓缓发发发发酵酵酵酵乳乳乳乳糖糖糖糖的的的的大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群和和和和厌厌厌厌氧氧氧氧大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌。所所所所以以以以，本本本本试试试试验验验验与与与与4-4-甲甲甲甲基基基基伞伞伞伞形形形形酮酮酮酮-D-D-半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷试试试试验验验验所所所所得得得得阳阳阳阳性性性性结结结结果果果果都都都都比比比比各各各各自的对比培养基的高。自的对比培养基的高。自的对比培养基的高。自的对比培养基的高。试试试试验验验验证证证证明明明明用用用用AlizAliz-gal-gal作作作作-半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶底底底底物物物物以以以以平平平平板板板板直直直直接接接接计计计计数数数数检检检检测测测测食食食食品品品品中中中中的的的的大大大大肠肠肠肠菌菌菌菌群群群群，具具具具有有有有特特特特异异异异性性性性强强强强、速速速速度度度度快快快快、准准准准确确确确率率率率高高高高、结结结结果果果果稳稳稳稳定定定定的的的的特特特特点点点点，可可可可作作作作为为为为标标标标准准准准方方方方法法法法加以应用。加以应用。加以应用。加以应用。谢谢观赏谢谢观赏