第十七章病毒检验技术.ppt

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1、第十七章病毒第十七章病毒检验技技术微生物学检验微生物学检验国家卫生和计划生育委员会规划教材国家卫生和计划生育委员会规划教材 第十七章病毒检验技术 返回总目录返回总目录本 章 内 容 第一节 标本的采集、处理与运送 1第二节 病毒的分离与鉴定2第三节 病毒学检测及诊断3学习目标及重点 学习目标：掌握病毒标本采集和送检应遵循的原则；病毒检验鉴定常用技术熟悉病毒血清学诊断常用的方法了解病毒感染的实验室快速诊断学会病毒的培养基本操作本章重点：病毒标本采集和运送原则。病毒学诊断及鉴定常用方法。病毒培养的基本操作。第一节 标本的采集、处理与运送 一、标本的采集与处理1.采集时间：发病早期或急性期尽快采集。

2、2.采集部位：取决于临床症状和所怀疑感染的病毒。如：流感病毒感染-鼻咽拭子 乙型脑炎病毒感染-脑脊液 轮状病毒感染-粪便 乙型肝炎病毒感染-血液3.采集方法与处理 提高病毒的分离率，防止标本污染。采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌二、二、标本的运送与保存 1.1.标本的运送尽快送检冷冻、冷藏运输防漏、专人、标记2.2.标本的保存-70可较长时间保存可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活第一节 标本的采集、处理与运送 返回章内容返回章内容一、病毒的分离培养 2.鸡胚培养 第二节 病毒的分离与鉴定原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞 羊膜腔接种尿囊腔接种卵黄囊接

3、种绒毛尿囊膜接种组织细胞培养 鸡胚培养 动物接种1.组织细胞培养 鸡成纤维细胞Hep-2细胞细胞培养瓶Vero细胞第二节 病毒的分离与鉴定一般选用914d的鸡胚来源充足、组织分化程度低、本身很少携带病毒和细菌、对接种病毒不产生抗体及病毒较易增殖等2.鸡胚培养优点：第二节 病毒的分离与鉴定选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键常用的主要有：尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种2.鸡胚培养第二节 病毒的分离与鉴定2.鸡胚培养尿囊腔接种羊膜腔接种尿囊腔羊膜腔常用接种途径：尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养常用于

4、临床流感病毒初次分离第二节 病毒的分离与鉴定卵黄囊接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊绒毛尿囊膜人工气室羊膜腔气室绒毛尿囊膜尿囊腔 卵白2.2.鸡胚培养主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体的分离和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离卵卵黄黄囊囊第二节 病毒的分离与鉴定3.动物接种常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及脑内接种等方式第二节 病毒的分离与鉴定二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 2红细胞吸附 3细胞培养液pH值改变（二）病毒数量及病毒感染性测定 1血凝试验 2中和试验 3空斑形成试验

5、4半数感染量（ID50）和组织培养半数感染量（TCID50）第二节 病毒的分离与鉴定二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标 1细胞形态的改变 （1）细胞病变效应（cytophathic effect，CPE）第二节 病毒的分离与鉴定正常细胞 病变细胞是指某些病毒特别是无包膜的病毒感染组织细胞后，正常生长的梭形细胞变圆、变性、坏死、溶解及从培养瓶壁脱落，细胞堆积形成葡萄状第二节 病毒的分离与鉴定（2）多核巨细胞1细胞形态的改变多见于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染细胞融合而成多核巨细胞第二节 病毒的分离与鉴定（3）包涵体1细胞形态的改变 某些病毒感染宿主细胞后，细胞

6、内出现一种光学显微镜下可见的蛋白质结构，多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成，称为包涵体。第二节 病毒的分离与鉴定2红细胞吸附3细胞培养液pH值改变二、病毒增殖的观察病毒感染细胞后，可使细胞的代谢发生变化，导致培养液pH值改变。第二节 病毒的分离与鉴定（二）病毒数量及病毒感染性测定二、病毒增殖的观察1血凝试验 病毒颗粒红细胞 某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，将这类病毒感染细胞后收集的病毒液作不同稀释，以发生血凝反应的病毒液的最高稀释度作为该病毒的血凝效价（即滴度），可对病毒含量进行半定量测定。血凝现象第二

7、节 病毒的分离与鉴定能使红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为该病毒的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）第二节 病毒的分离与鉴定病毒颗粒 红细胞病毒抗体 血凝抑制试验 病毒液中若先加入病毒的特异性抗体，抗体与病毒表面的抗原特异性结合，从而抑制病毒与红细胞的血凝现象，称为血凝抑制试验。第二节 病毒的分离与鉴定2中和试验（Nt）在体外孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，经培养后观察CPE或红细胞吸附现象是否消失，即特异性抗体是否中和相应病毒，从而测定残存的病毒感染力的一种方法3空斑形成试验第二节 病毒的分离与鉴定4半数感染量（ID50）和组织培养

8、半数感染量（TCID50）测定病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%死亡或病变的最小量。用来估计病毒感染的强弱程度，但不能准确测定感染性病毒颗粒的多少返回章内容返回章内容第二节 病毒的分离与鉴定 第三节 病毒学检测及诊断一、形态学检查及诊断 1.光学显微镜检查：*直接观察到较大的病毒体（如痘病毒）*包涵体 狂犬病毒感染-嗜酸性包涵体 巨细胞病毒感染-“猫头鹰眼”状的嗜酸性包涵体 2.电子显微镜检查：*透射电子显微镜 用于观察病毒的大小、形态与结构及细胞内的超微结构等*扫描电子显微镜：用于观察病毒和细菌表面结构和附属结构等 一、形态学检查及诊断扫描电子显微镜 第三节 病毒学检测及诊断H1N1流感

9、病毒电子显微镜图片狂犬病病毒电子显微镜图片 第三节 病毒学检测及诊断（1）标本制备 超滤法超速离心法接种细胞快速增殖法免疫凝集法（2）常用观察方法 负染色法 超薄切片法 免疫电镜法病毒颗粒具有亮度，在周围较暗的背景上显示亮点过程与病理切片过程相似免疫组织化学与电镜技术的结合透射电子显微镜 第三节 病毒学检测及诊断二、血清学检测及诊断 原理：用已知的病毒抗原检测患者血清中的抗体水平或 用已知的病毒抗体直接检测标本中的病毒抗原1.病毒抗原的检测：用荧光素、酶或胶体金等标记物标记病毒抗体检测标本中的相应病毒抗原。如ELISA检测HBsAg 第三节 病毒学检测及诊断2.病毒抗体的检测：已知病毒抗原多数为通过基因工程技术制备的重组抗原，其次是从患者标本中分离纯化的抗原。检测抗体的类型确定患者所处感染阶段-急性期单份血清的IgM测定是诊断原发感染和早期感染-IgG含量的测定应取病人急性期和恢复期双份血清，若含量升高4倍以上表明感染病毒 第三节 病毒学检测及诊断三、分子生物学检测及诊断1.核酸分子杂交技术 2.聚合酶链反应（PCR）-多种病毒的快速诊断3.基因芯片技术-如检测H1N1甲型流感病毒4.基因测序-如病毒耐药基因型的检测返回章内容返回章内容 第三节 病毒学检测及诊断汇报结束谢谢大家!请各位批评指正