分光光度法检测蛋白质含量精选课件.ppt
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1、关于分光光度法检测蛋白质含量第一页,本课件共有36页生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n实验室规则实验室规则n实验室安全及防护实验室安全及防护n实验室常用玻璃仪器实验室常用玻璃仪器n实验考试实验考试第二页,本课件共有36页实验室规则实验室规则n提前提前5 5分钟到实验室,不能迟到、早退、旷课,每迟到、早退分钟到实验室,不能迟到、早退、旷课,每迟到、早退一次一次扣扣1 1分,每旷课一次扣分,每旷课一次扣5 5分分。n禁止在实验室内吃食品禁止在实验室内吃食品,如有违反者按迟到处理。,如有违反者按迟到处理。n上课上课必须穿隔离衣必须穿隔离衣,不能穿拖鞋和吊带背心,否则禁止进入实验室。,
2、不能穿拖鞋和吊带背心,否则禁止进入实验室。n实验期间实验期间手机必须设置在振动上手机必须设置在振动上,上课期间如急需接、打电话请到走廊,上课期间如急需接、打电话请到走廊上处理。上处理。n在实验室内要保持安静,不得嬉闹、大声说话。在实验室内要保持安静,不得嬉闹、大声说话。n认真预习认真预习n认真做实验认真做实验n养成良好的实验习惯(实验中、实验结束后)养成良好的实验习惯(实验中、实验结束后)n值日生工作值日生工作第三页,本课件共有36页实验室安全及防护实验室安全及防护n预防火灾预防火灾n预防中毒预防中毒n外伤外伤第四页,本课件共有36页实验室常用玻璃仪器实验室常用玻璃仪器n吸量管吸量管*(示教示
3、教)n试管试管n烧杯烧杯n量筒量筒第五页,本课件共有36页实验考试实验考试实验课成绩实验课成绩平时表现平时表现 实验测验实验测验 原理原理实验报告实验报告实验报告实验报告 -格式格式 结果结果操作考试操作考试 分析分析第六页,本课件共有36页实验报告网上提交实验报告网上提交n实验报告采取实验报告采取网上提交网上提交的方式,实验报告提交时间设定为的方式,实验报告提交时间设定为3 3天天,即本次实,即本次实验结束后第三天晚上验结束后第三天晚上1212点之前提交,点之前提交,过期无法再提交,本次实验报告则记为过期无法再提交,本次实验报告则记为0 0分分。n尽早提交报告尽早提交报告,不要等到最后期限,
4、有时系统不稳定,可能提交不上去。,不要等到最后期限,有时系统不稳定,可能提交不上去。n直接将报告粘贴在框中直接将报告粘贴在框中,切记,切记不要以附件方式上传不要以附件方式上传,否则有可能文件打不开,影响,否则有可能文件打不开,影响成绩。成绩。n不要相互抄袭不要相互抄袭,一旦,一旦发现雷同卷则均记为发现雷同卷则均记为0 0分分。n若过期没有提交报告,不要将报告发到老师邮箱,发也没用,最终实验报告成若过期没有提交报告,不要将报告发到老师邮箱,发也没用,最终实验报告成绩只记系统导出的成绩。绩只记系统导出的成绩。第七页,本课件共有36页实验一实验一分光光度技术及蛋白含量测定分光光度技术及蛋白含量测定第
5、八页,本课件共有36页n理论理论 掌握分光光度技术的基本原理掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造n实验实验:利用分光光度技术进行蛋白质含量测定利用分光光度技术进行蛋白质含量测定 1.1.双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量 2.2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.3.紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量 第九页,本课件共有36页 一、概念一、概念 利用物质特有的利用物质特有的吸收光谱吸收光谱来鉴别物质或测来鉴别物质或测定其含量的一项技术定其含量的一项技术 。应用:应用:定性、定量定性、定量 优
6、点:优点:灵敏度高灵敏度高 精确度高精确度高 操作简便、快速操作简便、快速 n 分光光度技术分光光度技术(Spectrophotography)第十页,本课件共有36页二、工作原理二、工作原理n物质对光线有选择性吸收作用。物质对光线有选择性吸收作用。n每种物质都具有其特征性的吸收光谱。每种物质都具有其特征性的吸收光谱。n在一定条件下,物质对光的吸收程度与该物质在一定条件下,物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比。的浓度成正比。分光光度法所使用的光谱范围:分光光度法所使用的光谱范围:200nm 10m 200 400nm 400 760nm 760 10m 紫外光区紫外光区 可见光区可见光区
7、红外光区红外光区第十一页,本课件共有36页如何定性?如何定性?利用利用吸收光谱曲线吸收光谱曲线鉴定化合物鉴定化合物 吸收光谱曲线:吸收光谱曲线:吸收光谱曲线:吸收光谱曲线:以不同以不同以不同以不同波长波长波长波长的的的的单色光单色光单色光单色光作为作为作为作为入射光入射光入射光入射光,测,测,测,测定某一定某一定某一定某一溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度,以波长为横轴,吸,以波长为横轴,吸,以波长为横轴,吸,以波长为横轴,吸光度为纵轴作图,得到溶液的吸收光谱曲光度为纵轴作图,得到溶液的吸收光谱曲光度为纵轴作图,得到溶液的吸收光谱曲光度为纵轴作图,得到溶液的吸收光谱曲线。线。线。
8、线。每种物质有其特征性的吸收光谱,每种物质有其特征性的吸收光谱,每种物质有其特征性的吸收光谱,每种物质有其特征性的吸收光谱,故可故可故可故可作为作为作为作为定性分析的依据定性分析的依据定性分析的依据定性分析的依据。吸吸 光光 度度第十二页,本课件共有36页 1.1.朗伯朗伯(Lambert)定律定律 一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的厚度厚度增加呈指增加呈指数减少。数减少。I1/I0=e-K1l2.2.比尔比尔(Beer)定律定律 一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸收光介质的一束单色光通过一光吸收介质时,其光强度随吸
9、收光介质的浓度浓度的增的增加呈指数减少。加呈指数减少。I1/I0=e-K2C I I0 0:入射光强度;入射光强度;I I :透射光强度;透射光强度;l l:介质厚度:介质厚度 C C:介质浓度:介质浓度如何定量?如何定量?Lambert-Beer定律定律*第十三页,本课件共有36页 3.Lambert-Beer定律定律*一束单色光通过某溶液时,光波被溶液吸收一部分,一束单色光通过某溶液时,光波被溶液吸收一部分,一束单色光通过某溶液时,光波被溶液吸收一部分,一束单色光通过某溶液时,光波被溶液吸收一部分,吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比。吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比。吸收多少与溶液的
10、浓度和溶液厚度成正比。吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比。A=A=CLCL A:吸光度;吸光度;C C:溶液浓度;溶液浓度;L L:液层厚度液层厚度液层厚度液层厚度 :即摩尔吸光系数,指一定波长时,溶液的浓度即摩尔吸光系数,指一定波长时,溶液的浓度为为1 mol/L1 mol/L,光程为,光程为 1cm时的吸光度值时的吸光度值时的吸光度值时的吸光度值 。*在在波长、溶液波长、溶液波长、溶液波长、溶液和和温度温度确定的情况下,确定的情况下,由物质的特由物质的特由物质的特由物质的特性决定的。性决定的。性决定的。性决定的。第十四页,本课件共有36页4.4.计算计算*(1 1)标准管法标准管法(标准
11、比较法)(标准比较法)实际测定过程中,用一实际测定过程中,用一已知浓度已知浓度的测定物按测的测定物按测定管同样处理显色,读出吸光度,再根据前式计算。定管同样处理显色,读出吸光度,再根据前式计算。A标准标准=标准标准C标准标准L标准标准 A样品样品=样品样品C样品样品L样品样品 A:吸光度;:吸光度;:摩尔吸光度;:摩尔吸光度;C:溶液浓度;:溶液浓度;L:液层厚度:液层厚度第十五页,本课件共有36页 因标准液和样品液中溶质为同一物质,因标准液和样品液中溶质为同一物质,样样品品=标标准准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样样品品=L标标准准 故上二式可写成
12、:故上二式可写成:A标标准准/A样样品品=标标准准C标标准准L标标准准/样样品品C样样品品L样样品品 C样样品品=A样样品品/A标标准准 C标标准准第十六页,本课件共有36页(2 2)标准曲线法)标准曲线法 绘制标准曲线:绘制标准曲线:配制配制一系列已知不同浓度一系列已知不同浓度的测定物溶液,按测定管同样方法的测定物溶液,按测定管同样方法处理显色,分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标,吸处理显色,分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标,吸光度为纵座标,在方格座标纸上作图得标准曲线。光度为纵座标,在方格座标纸上作图得标准曲线。获取样品的浓度:根据测得样品的吸光度值从标准曲线上获取样品的浓度:根
13、据测得样品的吸光度值从标准曲线上获得测定物的浓度。获得测定物的浓度。浓度吸光度第十七页,本课件共有36页标准曲线使用注意事项标准曲线使用注意事项v标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。v吸光度在吸光度在0.051.0范围内。范围内。v所作标准曲线仅供短期使用。所作标准曲线仅供短期使用。v标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行,避标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行,避免误差产生。免误差产生。第十八页,本课件共有36页5应用中注意的问题应用中注意的问题*v Lambert-beers law的偏离:该定律只适应于一定浓度范围,的偏离:该定律
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