分子生物学常用技术 (2)精选课件.ppt

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1、关于分子生物学常用技术(2)第一页，本课件共有31页.核酸分子杂交（核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNADNA/DNA or DNA/RNA）技术）技术 核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在19681968年由华盛顿卡内基学院年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of WashingtonCavnegie Institute of Washington）的）的Roy BrittenRoy Britten及及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链序列的单链DNADNA或或RNARN

2、A，当它们混合在一起时，其相应的同，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。源区段将会退火形成双链的结构。第二页，本课件共有31页1 1、萨瑟恩、萨瑟恩DNADNA印迹杂交印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNADNADNADNA片段片段片段片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA

3、DNADNADNA或或或或 RNA RNA RNA RNA探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的DNADNADNADNA片段，这种实验方法叫做片段，这种实验方法叫做片段，这种实验方法叫做片段，这种实验方法叫做DNADNADNADNA印迹杂交技术。由于它是由印迹杂交技术。由于它是由印迹杂交技术。由于它是由印迹杂交技术。由于它是由E.SouthernE.SouthernE.SouthernE.Southern于于于于1975197519751975年首先设计出年首先设计出年首先设计出年首先设计出来的，故又叫来的，故又

4、叫来的，故又叫来的，故又叫Southern DNA Southern DNA Southern DNA Southern DNA 印迹转移技术。印迹转移技术。印迹转移技术。印迹转移技术。第三页，本课件共有31页（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝凝胶转移杂交胶转移杂交技术技术第四页，本课件共有31页Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之X X光显像图片光显像图片 水稻（水稻（水稻（水稻（Oryz

5、a sativa LOryza sativa L.).)的叶绿体的叶绿体的叶绿体的叶绿体DNADNA分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶BglBgl(A-C)(A-C)(A-C)(A-C)、BamHBamHBamHBamH（D-FD-FD-FD-F）、）、）、）、EcoREcoREcoREcoR（G-IG-IG-IG-I）、和）、和）、和）、和HindHindHindHind（J-LJ-LJ-LJ-L）消化，加样在含有）消化，加样在含有）消化，加样在含有）消化，加样在含有EtBrEtBrEtBrEtBr染料的染料的染料的染料的1%1%1%1%的琼脂糖

6、凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32323232P P P P标记的玉米标记的玉米标记的玉米标记的玉米psbApsbApsbApsbA探针作探针作探针作探针作SouthernSouthernSouthernSouthern杂交。杂交。杂交。杂交。X X X X光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的，表明含有水稻的，表明含有水稻的，表明含有水稻的psbApsbApsbApsbA基因序基因序基因序基因序列。列。列。列。第五页，本

7、课件共有31页2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blottingNorthern blotting）1979197919791979年，年，年，年，J.C.AlwineJ.C.AlwineJ.C.AlwineJ.C.Alwine等人发展而来，是将等人发展而来，是将等人发展而来，是将等人发展而来，是将RNARNARNARNA分子从电泳凝胶转移分子从电泳凝胶转移分子从电泳凝胶转移分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种到硝酸纤

8、维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩实验方法。由于这种方法与萨瑟恩实验方法。由于这种方法与萨瑟恩实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNADNADNADNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做印迹杂交技术十分类似，所以叫做印迹杂交技术十分类似，所以叫做印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩诺赛恩RNARNA印迹技术（印迹技术（Northern blottingNorthern blottingNorthern blottingNorthern blotting）。）。）。）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜

9、上而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同然后同然后同然后同放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素125125125125I I I I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（斯顿蛋白质杂交技术（斯顿蛋白质杂交技术（斯顿蛋白质杂交技术（Western blottingWestern blottingWestern blottingWestern blotting）。）

10、。）。）。第六页，本课件共有31页3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。第七页，本课件共有31页检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术4、菌落杂交第八页，本课件共有31页核酸杂交常用几

11、种膜的性核酸杂交常用几种膜的性能比较能比较第九页，本课件共有31页.蛋白质蛋白质/DNA/DNA、蛋白质、蛋白质/RNA/RNA杂交技术杂交技术第十页，本课件共有31页1 1、凝胶阻滞实验（、凝胶阻滞实验（Gel retardation assayGel retardation assay）又叫又叫又叫又叫DNADNADNADNA迁移率变动实验（迁移率变动实验（迁移率变动实验（迁移率变动实验（DNA mobility shift assayDNA mobility shift assayDNA mobility shift assayDNA mobility shift assay），），），

12、），是在是在是在是在80808080年代初期出现的用于在体外研究年代初期出现的用于在体外研究年代初期出现的用于在体外研究年代初期出现的用于在体外研究DNADNADNADNA与蛋白质型胡作用的一与蛋白质型胡作用的一与蛋白质型胡作用的一与蛋白质型胡作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定选作分离纯化特定选作分离纯化特定选作分离纯化特定DNADNADNADNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。结合

13、蛋白质的一种典型的实验方法。结合蛋白质的一种典型的实验方法。结合蛋白质的一种典型的实验方法。第十一页，本课件共有31页凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质B B B B结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带A AC C

14、B B放射自显放射自显放射自显放射自显影影影影*凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳放射性标记的放射性标记的放射性标记的放射性标记的DNADNADNADNA细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物蛋白质与蛋白质与蛋白质与蛋白质与DNADNA结结结结合合合合*B BDNA-DNA-蛋白质结蛋白质结蛋白质结蛋白质结合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓慢慢慢慢滞后带表明滞后带表明滞后带表明滞后带表明DNADNA与与与与蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合第十二页，本课件共有31页(a)(a)(b)(b)(c)(c)在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争在

15、凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争DNADNADNADNA与探针与探针与探针与探针DNADNADNADNA之间的竞争作用之间的竞争作用之间的竞争作用之间的竞争作用（a a a a）没有加入竞争）没有加入竞争）没有加入竞争）没有加入竞争DNADNADNADNA的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针DNADNADNADNA与特异蛋白质结合，出与特异蛋白质结合，出与特异蛋白质结合，出与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（现阻滞条带；（现阻滞条带；（现阻滞条带；（b b b b）加入的超量竞争）加入的超量竞争）加入的超量竞争）加入的超量

16、竞争DNADNADNADNA与探针与探针与探针与探针DNADNADNADNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞竞争结合同一种蛋白质，阻滞竞争结合同一种蛋白质，阻滞竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（条带消失；（条带消失；（条带消失；（c c c c）竞争）竞争）竞争）竞争DNADNADNADNA与探针与探针与探针与探针DNADNADNADNA分别结合不同的蛋白质，出现同（分别结合不同的蛋白质，出现同（分别结合不同的蛋白质，出现同（分别结合不同的蛋白质，出现同（a a a a）一样的）一样的）一样的）一样的阻滞条带。阻滞条带。阻滞条带。阻滞条带。*蛋白质与未蛋白质与未蛋白质与未蛋白质与未标记的竞争标记

17、的竞争标记的竞争标记的竞争DNADNA结合结合结合结合凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影蛋白质与标蛋白质与标蛋白质与标蛋白质与标记的探针记的探针记的探针记的探针DNADNA结合结合结合结合*第十三页，本课件共有31页2 2、DNaseDNase足迹实验（足迹实验（footprinting assayfootprinting assay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNADNA序列的部序列的部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因

18、子同特点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定定DNADNA片段之间的结合区域。如果使用较大的片段之间的结合区域。如果使用较大的DNADNA片段，片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNADNA序列，序列，来消除特定的来消除特定的“足迹足迹”，并据此测定其核苷酸序列的，并据此测定其核苷酸序列的特异性。特异性。第十四页，本课件共有31页3232p p1 5 10

19、1 5 10*1 4 8 1 4 8 1010*加入蛋白质加入蛋白质X X加入加入DNaseIDNaseI凝胶电泳放凝胶电泳放射自显影射自显影1 15 51010A BA B足迹足迹足迹足迹(a)(a)(c)(c)(b)(b)DNaseI DNaseI DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验足迹实验足迹实验第十五页，本课件共有31页3 3、甲基化干扰实验（、甲基化干扰实验（methyltion interference assaymethyltion interference assay）根据根据根据根据DMSDMSDMSDMS（硫酸二甲酯）能够使（硫酸二甲酯）能够使（硫酸二甲酯）能够使

20、（硫酸二甲酯）能够使G G G G残基甲基化，而六氢吡啶又能残基甲基化，而六氢吡啶又能残基甲基化，而六氢吡啶又能残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的够特异切割甲基化的够特异切割甲基化的够特异切割甲基化的G G G G残基这一原理，设计出了另一种研究残基这一原理，设计出了另一种研究残基这一原理，设计出了另一种研究残基这一原理，设计出了另一种研究DNADNADNADNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测

21、靶可以检测靶可以检测靶可以检测靶DNADNADNADNA中特异中特异中特异中特异G G G G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNADNADNADNA与蛋白质之与蛋白质之与蛋白质之与蛋白质之间相互作用的模式。间相互作用的模式。间相互作用的模式。间相互作用的模式。DMSDMSDMSDMS化学干扰的主要局限性时，它只能使化学干扰的主要局限

22、性时，它只能使化学干扰的主要局限性时，它只能使化学干扰的主要局限性时，它只能使G G G G残基甲基化。尽管残基甲基化。尽管残基甲基化。尽管残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中定足迹区段中定足迹区段中定足迹区段中DNADNADNADNA与蛋白质相互作用的精确位置。与蛋白质相互作用的精确位置。与蛋白质相互作用的精确位置。与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。具体操作如下页图所示。具体操作

23、如下页图所示。具体操作如下页图所示。第十六页，本课件共有31页G GG GG GG GG GG GmmG GG GG GmmG GG GG GmmG GG GG GmmG GG GG GmmG GG GG GmmDNADNA局部甲基化局部甲基化局部甲基化局部甲基化与蛋白质提取物混合与蛋白质提取物混合与蛋白质提取物混合与蛋白质提取物混合与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合不与蛋白质结合不与蛋白质结合不与蛋白质结合不与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合凝胶电泳凝胶电泳与蛋白质结合的与蛋白质结合的与蛋白质结合的与蛋白质结合的DNADNA带含带含带含带含有有有有和和

24、两种类型两种类型两种类型两种类型DNADNA片片片片段段段段不能与蛋白质结合的不能与蛋白质结合的不能与蛋白质结合的不能与蛋白质结合的DNADNA带含有全部三种类型带含有全部三种类型带含有全部三种类型带含有全部三种类型DNADNA片段片段片段片段切除所有结合与不切除所有结合与不切除所有结合与不切除所有结合与不结合蛋白质的结合蛋白质的结合蛋白质的结合蛋白质的DNADNA带，并用六氢吡啶带，并用六氢吡啶带，并用六氢吡啶带，并用六氢吡啶切割甲基化的切割甲基化的切割甲基化的切割甲基化的GG残残残残基基基基结合带结合带结合带结合带 非结合带非结合带非结合带非结合带缺失的缺失的缺失的缺失的DNADNA带表带

25、表带表带表明相应明相应明相应明相应GG残基的重残基的重残基的重残基的重要意义，它得到结要意义，它得到结要意义，它得到结要意义，它得到结合蛋白质的保护合蛋白质的保护合蛋白质的保护合蛋白质的保护甲基化干扰实验甲基化干扰实验第十七页，本课件共有31页4 4、体内足迹实验、体内足迹实验G GG GG GG GmeG GG GG GG GMe MeMe Me完整的细胞完整的细胞完整的细胞完整的细胞裸露的裸露的裸露的裸露的DNADNADMSDMS分离分离DNA并用并用六氢吡啶切割六氢吡啶切割凝胶分析凝胶分析凝胶分析凝胶分析PCRPCR扩增扩增扩增扩增受保护的受保护的受保护的受保护的GG残基残基残基残基应用

26、甲基化保护作用进行的体内足迹实验应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验第十八页，本课件共有31页5 5、SouthwesternSouthwestern杂交杂交6 6、NorthwesternNorthwestern杂交杂交第十九页，本课件共有31页.PCR.PCR技术技术 1 1、基因扩增原理条件、基因扩增原理条件 第二十页，本课件共有31页(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互

27、补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)第二十一页，本课件共有31页温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1mi

28、n1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完

29、成的。图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min，60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。第二十二页，本课件共有31页Reaction Condition for

30、a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR Assay第二十三页，本课件共有31页Typical PCR Thermal ProfileTypical PCR Thermal Profile*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any“unfinished”product from previous amp

31、lification to achieve any“unfinished”product from previous amplification to achieve its full lengthits full length第二十四页，本课件共有31页Some DNA Polymerases Used in PCR第二十五页，本课件共有31页Characteristics of Taq Polymerase 第二十六页，本课件共有31页55333355靶靶靶靶DNADNA片段片段片段片段引物引物引物引物A A5 55 5引物引物引物引物AA3333PCRPCRPCRPCRPCRPCR3 3

32、3 35555PCRPCR引物引物引物引物B B引物引物引物引物C C5 55 53333混合混合混合混合,变性变性变性变性,退火退火退火退火5533553333553355+DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5533335555333355用引物用引物用引物用引物B B和和和和C C作作作作PCRPCRPCRPCR定点诱变定点诱变2 2、PCRPCR用于基因突变用于基因突变第二十七页，本课件共有31页 3 3、PCRPCR用于融合基因的克隆用于融合基因的克隆 第二十八页，本课件共有31页.体外转录与体外翻译体外转录与体外翻译1 1、体外转录系统、体外转录系统第二十九页，本课件共有31页.基因瞬间表达与稳定表达基因瞬间表达与稳定表达2 2、常用的体外翻译系统、常用的体外翻译系统 小麦胚、兔网织红血球小麦胚、兔网织红血球下节课讲下节课讲第三十页，本课件共有31页感感谢谢大大家家观观看看28.02.2023第三十一页，本课件共有31页