免疫组化技术课件课件精选课件.ppt

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1、关于免疫组化技术课件第一页，本课件共有45页组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组组织织化化学学：组组组组织织织织水水水水平平平平，对对对对组组组组织织织织内内内内存存存存在在在在的的的的各各各各种种种种物物物物质质质质进进进进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法 免疫组织化学：免疫组织化学：基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应 酶组织化学酶组织化学酶组织化学酶组织化学第二页，本课件共有45页疾疾病病的的病病

2、理理学学研研究究概概括括起起来来主主要要在在基基基基因因因因和和蛋蛋白白水水平上进行的研究。平上进行的研究。免免免免疫疫疫疫组组组组织织织织化化化化学学学学方方法法主主要要用用于于基基因因蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质水水水水平平平平表表表表达的研究。达的研究。达的研究。达的研究。蛋白表达蛋白表达=分布，定位，定量；分布，定位，定量；分布，定位，定量；分布，定位，定量；蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等第三页，本课件共有45页材料：材料：抗体：抗体：抗体：抗体：多多多多克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体：为为针针对对多多个个抗抗原原决决定定簇簇的的抗抗 体体，

3、为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。单单克克隆隆抗抗体体：为为一一个个B B淋淋巴巴细细胞胞分分化化增增殖殖产产 生生的的抗抗体体，可可识识别别有有限限的的抗抗原原决决定定簇簇，特特异异 性强。性强。第四页，本课件共有45页显示物：显示物：酶标反应：酶标反应：碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,APAlkatine phasphotase,AP）APAPAPAP与与与与不不不不同同同同的的的的底底底底物物物物（萘萘萘萘酚酚酚酚As-MxAs-MxAs-MxAs-Mx、快快快快蓝蓝蓝蓝、快快快快红红红红）作作作作用用用用，可可可可形形形

4、形成成成成不不不不同同同同颜颜颜颜色色色色的的的的终终终终产产产产物物物物。用用用用新新新新品品品品红红红红（New New New New fuchsinefuchsinefuchsinefuchsine）显显显显色色色色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。辣根过氧化酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)(Horseradise peroaidase,)HRPHRPHRPHRP：底底底底物物物物为为为为DABDABDA

5、BDAB四四四四盐盐盐盐酸酸酸酸二二二二氨氨氨氨基基基基联联联联苯苯苯苯胺胺胺胺，产产产产生生生生棕棕棕棕色色色色沉沉沉沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。淀，不溶于有机溶剂，不褪色。淀，不溶于有机溶剂，不褪色。淀，不溶于有机溶剂，不褪色。第五页，本课件共有45页HRPHRP第六页，本课件共有45页APAPHEHE第七页，本课件共有45页荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体异异异异 硫硫硫硫 氰氰氰氰 酸酸酸酸 荧荧荧荧 光光光光 素素素素（Fluorescien Fluorescien Fluorescien Fluorescien is

6、othioyarale,isothioyarale,isothioyarale,isothioyarale,FITCFITCFITCFITC）520520520520530nm530nm530nm530nm四四甲甲基基异异硫硫氰氰酸酸罗罗达达明明（Teramethyle Teramethyle rhodamine rhodamine isothiecyanata,TRITCisothiecyanata,TRITC）620nm620nm四四 乙乙 基基 罗罗 达达 明明（Teraethyle Teraethyle rhodamine rhodamine B200,B200,RB200RB200）

7、590590600nm600nm第八页，本课件共有45页第九页，本课件共有45页胶体金：胶体金：胶体金：胶体金：指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，免疫电镜观察免疫电镜观察 第十页，本课件共有45页主要方法：主要方法：直接法：直接法：间接法：间接法：间接法：间接法：经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应PAPPAP法：法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第

8、一抗体结合，然后以酶底物反通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。应检出。应检出。应检出。第十一页，本课件共有45页第十二页，本课件共有45页ABCABC法：法：生物素生物素生物素生物素（BiotinBiotin）和）和卵白素卵白素卵白素卵白素（AvidinAvidinAvidinAvidin）为具有高度）为具有高度）为具有高度）为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合亲合性的物质，一个卵白素分子可结合亲合性的物质，一个卵白素分子可结合亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4 4 4

9、 4个生物素。个生物素。个生物素。个生物素。当生物素标上特定的标记物质后当生物素标上特定的标记物质后当生物素标上特定的标记物质后当生物素标上特定的标记物质后orororor与抗体结合后仍能与抗体结合后仍能与抗体结合后仍能与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，

10、而以适当方式显示。适当方式显示。适当方式显示。适当方式显示。第十三页，本课件共有45页S-PS-P法（法（LSABLSAB）：）：采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。定细胞和组织中的抗原。第十四页，本课件共有45页EnvisionEnvisionEnvisionEnvision法（二步法）：法（二步法）：法（二步法）：法（二步法）：原理：第二抗体上标记有多聚物酶（原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or HRP or APAP）复合物与第

11、一抗体结合。二抗上的多聚物可结）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的合许多的HRPHRP分子，使信号有显著提高，敏感性较分子，使信号有显著提高，敏感性较PAPPAP法，法，ABCABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。简便。第十五页，本课件共有45页以以以以LSABLSABLSABLSAB法为例简单介绍染色步骤：法为例简单介绍染色步骤：法为例简单介绍染色步骤：法为例简单

12、介绍染色步骤：石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水；3%H3%H2 2 2 20 0 0 02 2 2 2抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶15min15min15min15min；每张切片加每张切片加10-20ul10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育5min5min；加特异性一抗，加特异性一抗，37370 0C C C C孵育孵育孵育孵育3030303060min60min60min60min，or 4or 4or 4or 40 0 0 0C C过夜；过夜；加加20ul20ul生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体，3

13、70C370C，30min30min30min30min；第十六页，本课件共有45页加加过过氧氧化化物物酶酶标标定定的的链链菌菌素素亲亲生生物物素素，37370 0C C，30min30min；以上每步后均用以上每步后均用PBSPBS液洗液洗33min33min；用用过过氧氧化化物物酶酶基基质质液液（DABDAB基基质质液液）显显色色5 515min15min。在光镜下观察。在光镜下观察。自自来来水水冲冲洗洗，苏苏木木素素浅浅染染，自自来来水水冲冲洗洗还还蓝蓝，梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。第十七页，本课件共有45页免疫组化常见问题

14、的处理：免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：固定液为：固定液为：固定液为：固定液为：10%10%10%10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%4%4%4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4PH7.4PH7.4PH7.4）；）；）；）；固定时间：固定时间：固定时间：固定时间：8-24hr8-24hr8-24hr8-24hr 组织大小：组织大小：2*1.5*0.3cm 2*1.5*0.3cm 第十八页，本课件共

15、有45页防脱片处理：防脱片处理：防脱片处理：防脱片处理：多聚多聚-L-L-赖氨酸；赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。硫酸铬钾明胶液。第十九页，本课件共有45页增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：1 1）蛋白酶消化：）蛋白酶消化：a a a a、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%0.05-0.1%0.05-0.1%0.05-0.1%）；）；）；）；b b b b、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（0.4%0.4%0.4%0.4%）。）。）。）。2 2 2 2）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：

16、）热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波96960 0 0 0C,10minC,10min；直接加温方法直接加温方法直接加温方法直接加温方法 100 100 100 1000 0 0 0C,10minC,10minC,10minC,10min；高压锅高压锅高压锅高压锅 120 120 120 1200 0C,10minC,10minC,10minC,10min；热处理液：热处理液：0.01mol/L PH6.0 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 第二十页，本课件共有45页合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。

17、过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；即用型抗体；浓缩型。浓缩型。第二十一页，本课件共有45页减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：非特异性染色：非特异性染色：原因：原因：方法：方法：第二十二页，本课件共有45页第二十三页，本课件共有45页对照：对照：阳阳性性对对照照：用用一一直直抗抗原原阳阳性性的的切切片片与与待待测测标标本本同同时时进进行行免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色，阳阳性性对对照照应应呈阳性结果，即为阳性对照。呈阳性结果，即为阳性对照。阴阴性性对对照照：用用不不含含一一直直抗抗原原的的标标本本作作对对照照，实实验验结结果果为为阴阴性性，即即为为阴阴性性对对照

18、照。阴阴性性对对照照中中还还包包括括空空白白对对照照、替替代代对对照照、吸吸收收和和抑抑制制对对照照等，用以排除假阳性结果。等，用以排除假阳性结果。第二十四页，本课件共有45页染色染色特异性染色特异性染色非特异性染色非特异性染色显色部位显色部位特定细胞或间质特定细胞或间质细胞和间质均匀染色或更强细胞和间质均匀染色或更强显色定位显色定位特定，具有结构性特定，具有结构性无特定部位，无结构性无特定部位，无结构性显色程度显色程度同一部位呈不同程度显同一部位呈不同程度显色色无分布规律，某一片均匀着无分布规律，某一片均匀着色色 免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的免疫组织化学的结果判断应非常严谨，

19、阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片

20、细间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。胞，两者可显著区别。胞，两者可显著区别。胞，两者可显著区别。第二十五页，本课件共有45页阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色分布有三种：阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面 阳性细胞分布：阳性细胞分布：阳性细胞分布：阳性细胞分布：灶性；弥漫性灶性；弥漫性灶性；弥漫性灶性；弥漫性 染色强度不一染色强度不一 切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕oror组织折叠，坏死，挤压区，组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强

21、度。对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：-，+，+，+等分级和计数统计等分级和计数统计等分级和计数统计等分级和计数统计 第二十六页，本课件共有45页垂体腺瘤垂体腺瘤 ACTH ACTH第二十七页，本课件共有45页乳腺癌乳腺癌 c-erbB-2 c-erbB-2第二十八页，本课件共有45页免疫组化A细胞B细胞D细胞第二十九页，本课件共有45页上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（上皮膜抗原（上皮膜抗原（上皮膜抗原（EMAEMAEMAEMA）：）：）：）：广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。广泛分布于各种

22、正常上皮细胞膜及肿瘤中。广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。癌胚抗原（癌胚抗原（癌胚抗原（癌胚抗原（CEACEACEACEA）：）：）：）：主要存在于胎儿消化道上皮，主要存在于胎儿消化道上皮，主要存在于胎儿消化道上皮，主要存在于胎儿消化道上皮，胰腺以及绝大部分内脏癌。胰腺以及绝大部分内脏癌。胰腺以及绝大部分内脏癌。胰腺以及绝大部分内脏癌。前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（PSAPSAPSAPSA）：）：）：）：甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFPAFPAFP）：）：）：）：甲状腺球蛋白（甲状腺球蛋白（

23、甲状腺球蛋白（甲状腺球蛋白（TgTgTgTg）：）：）：）：第三十页，本课件共有45页软组织标记软组织标记 软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。肌动蛋白（肌动蛋白（ActinActin）：分布于所有的肌型细胞中）：分布于所有的肌型细胞中 肌红蛋白（肌红蛋白（MyoglobinMyoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种）：是骨骼肌肌浆中的一种 可溶性蛋白，具有较高组织特异性。可溶性蛋白，具有较高组织特异性。第三十一页，本课件共有45页内皮细胞标记内皮细胞标记CD34CD34：主要标

24、记内皮细胞；：主要标记内皮细胞；亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。第第八八因因子子相相关关抗抗原原（Factor-related Factor-related antigen,antigen,F-F-RAgRAg）：）：血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。CD34 CD34优于优于F-RAgF-RAg。溶菌酶（溶菌酶（LysozymeLysozyme）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。抗胰糜蛋白酶（抗胰糜蛋白酶（AAcTAAcT）：主要用于恶纤组的诊断。）：主要用于恶纤组的诊断。第三十二页，本课件

25、共有45页淋巴细胞标记物淋巴细胞标记物：白细胞共同抗原（白细胞共同抗原（LCA,CD45LCA,CD45）：主要分布于）：主要分布于T,BT,B细胞，细胞，单核细胞，粒细胞表面。单核细胞，粒细胞表面。CD20CD20：B B细胞标记物。细胞标记物。CD45ROCD45RO、CD3CD3：T T细胞标记物。细胞标记物。CD57CD57：为自然杀伤细胞的标记物。：为自然杀伤细胞的标记物。CD38CD38：为浆细胞的标记物。：为浆细胞的标记物。CD68CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。：主要标记各种组织中的巨噬细胞。第三十三页，本课件共有45页神经内分泌标记物：神经内分泌标记物：嗜铬素嗜铬素A

26、 A（Chromogranin,CgAChromogranin,CgA）：）：存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。突触素（突触素（Synaptophysin,SySynaptophysin,Sy）：）：存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，神经内分泌细胞中。神经内分泌细胞中。髓磷脂硷性蛋白（髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein,MBPMyelin basic protein,MBP）：）：第三十四页，本课件共有45页激素及激素受体类标记：激素及激素受体类标记：雄激素受体（雄激素受体

27、（Androgen receptor,ARAndrogen receptor,AR）：）：雌激素受体（雌激素受体（Estrogen receptor,EREstrogen receptor,ER）孕激素受体（孕激素受体（Progesterone receptor,PRProgesterone receptor,PR）：）：垂体激素：垂体激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH ACTH,GH,PRL,LH,TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。主要用于垂体腺瘤的功能分类。降钙素（降钙素（Calcitotin,CTCalcitotin,CT）：）：甲状腺旁细胞（甲状腺旁细胞（C C细胞）分泌。细

28、胞）分泌。第三十五页，本课件共有45页以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断 其联合应用的作用和意义：其联合应用的作用和意义：Keratin Vimentin 上皮性肿瘤 Keratin 滑膜肿瘤 Vimentin 间皮肿瘤 上皮样肉瘤 癌肉瘤 第三十六页，本课件共有45页 Desor Actin 肌源性肿瘤肌源性肿瘤 CD34or F 血管性肿瘤血管性肿瘤 Keratin S-100or MBP 神经鞘膜瘤神经鞘膜瘤Vimentin LCA 淋巴细胞淋巴细胞 AACT 骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤 GFAP 胶质细

29、胞肿瘤胶质细胞肿瘤 Keratin NSEor Sy Vimentin NF 节细胞神经母细胞瘤节细胞神经母细胞瘤第三十七页，本课件共有45页免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HEHE染色的染色的 形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的免疫组化染色作为诊断的“金标准金标准”。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。免疫组化用于判断组织

30、起源，分型，预后的估计。免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为准。为准。第三十八页，本课件共有45页涂片涂片第三十九页，本课件共有45页磨片磨片骨骨bone第四十页，本课件共有45页电子显微镜技术：透射电镜电子显微镜技术：透射电镜第四十一页，本课件共有45页透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜电子显微镜技术电子显微镜技术第四十二页，本课件共有45页透射电镜透射电镜扫描电镜扫描电镜第四十三页，本课件共有45页固定：固定：为了尽量保存样本的原样使用戊二醛为了尽量保存样本的原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇酸来染色。来硬化样本和使用锇酸来染色。冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这样水不会结晶，而形成非晶体的样水不会结晶，而形成非晶体的脱干：脱干：使用乙醇和丙酮来取代水。使用乙醇和丙酮来取代水。包埋：包埋：树脂树脂超薄切片：超薄切片：将样本使用金刚石刃切成薄片。将样本使用金刚石刃切成薄片。染色：染色：重的原子如铅或铀比轻的原子散射电重的原子如铅或铀比轻的原子散射电子的能力高，因此可被用来提高对比度。子的能力高，因此可被用来提高对比度。第四十四页，本课件共有45页感感谢谢大大家家观观看看28.02.2023第四十五页，本课件共有45页