免疫细胞的分离技术精选课件.ppt

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1、关于免疫细胞的分离技术第一页，本课件共有76页 免疫系统的组成免疫系统的组成免疫系统免疫系统免疫器官免疫器官中枢中枢:胸腺、骨髓胸腺、骨髓周围：淋巴结、脾脏、粘膜周围：淋巴结、脾脏、粘膜 相关淋巴组织等相关淋巴组织等免疫细胞：淋巴细胞、单核免疫细胞：淋巴细胞、单核-巨噬细胞巨噬细胞 、粒细胞、粒细胞、DC、肥大细胞、肥大细胞、NK细胞细胞免疫分子：抗体、补体、细胞因子、免疫分子：抗体、补体、细胞因子、MHC、TCR、粘附分子等、粘附分子等第二页，本课件共有76页 Innateimmunity 固有免疫固有免疫 定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传获得定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传

2、获得 的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作 用的免疫应答用的免疫应答组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（NKNK细胞、单细胞、单 核核-吞噬细胞、吞噬细胞、DC、NKT、中性粒细胞、中性粒细胞、T 细胞、细胞、B1细胞）细胞）等等特点：先天具有、无潜伏期、特点：先天具有、无潜伏期、无特异性无特异性、无记忆性、无记忆性 作用时间：作用时间：0-960-96小时小时第三页，本课件共有76页 Adaptiveimmunity 获得性获得性(适应性适应性)免疫免疫 定义：机体在生活过程中，因接触抗原性物质而获定义：机体在生活过程中，因接触

3、抗原性物质而获 得的免疫。得的免疫。T、B细胞识别病原体成分后产细胞识别病原体成分后产 生的免疫应答生的免疫应答 特点：后天获得、有潜伏期、特点：后天获得、有潜伏期、特异性特异性，记忆性，记忆性 参与细胞：参与细胞：T细胞和细胞和 B细胞细胞 起作用时间：晚，一般在感染后起作用时间：晚，一般在感染后4-5天发挥作用天发挥作用第四页，本课件共有76页一、一、免疫细胞的种类与特征免疫细胞的种类与特征第五页，本课件共有76页 免疫细胞的分类免疫细胞的分类根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类免疫活性细胞免疫活性细胞(immunocompetentcells)

4、抗原提呈细胞抗原提呈细胞(antigen-presentingcells,APC)其他细胞其他细胞凡凡参参与与免免疫疫应应答答或或与与免免疫疫应应答答有有关关的的细细胞胞，通通称称为为免免疫疫细细胞胞（immunocyte），其其中中包包括括淋淋巴巴细细胞胞、单单核核细细胞胞、巨巨噬噬细细胞胞、NKNK细细胞胞、树突状细胞树突状细胞DCDC、肥大细胞、粒细胞等、肥大细胞、粒细胞等第六页，本课件共有76页第七页，本课件共有76页 免疫细胞的起源与分化免疫细胞的起源与分化第八页，本课件共有76页免疫活性细胞免疫活性细胞具具有有特特异异性性抗抗原原受受体体、在在接接受受抗抗原原刺刺激激下下发发生生克

5、克隆隆性性活活化化、增增值值和和分分化化，产产生生适适应应性性免免疫疫应应答答（adaptive immuneresponse)的的细细胞胞。这这类类细细胞胞是是机机体体产产生生特特异异性性免免疫疫应应答答的的基基础，包括础，包括T T细胞、细胞、B B细胞细胞第九页，本课件共有76页抗原提呈细胞抗原提呈细胞（antigenpresentingcell,APC）加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的一加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的一组免疫细胞。血液中主要的组免疫细胞。血液中主要的APCAPC细胞主要包括单核细胞、树突细胞主要包括单核细胞、树突状细胞、状细胞、B B细

6、胞细胞第十页，本课件共有76页其他细胞其他细胞自自然然杀杀伤伤(NK)(NK)细细胞胞，肥肥大大细细胞胞，嗜嗜酸酸性性粒粒细细胞胞，嗜嗜中中性性粒粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等NK细胞肥大细胞嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞嗜碱性粒细胞血小板第十一页，本课件共有76页免疫细胞的特征免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征、免疫细胞的形态学特征 理化性状理化性状 生物学特性生物学特性第十二页，本课件共有76页免疫细胞的特征免疫细胞的特征2 2、免疫细胞的表面分子特征：白细胞分化抗原、免疫细胞的表面分子特征：白细胞分化抗原指指血血细细胞胞分分化化成成熟熟为为不不同同谱谱系系、分分

7、化化的的不不同同阶阶段段以以及及细细胞胞活活化化过过程中程中,出现或消失的细胞表面标记分子出现或消失的细胞表面标记分子聚聚类类分分化化群群(分分化化抗抗原原，cluster cluster of of differentiationdifferentiation，CD)CD)：应应用用单单克克隆隆抗抗体体鉴鉴定定为为主主的的方方法法，将将来来自自不不同同实实验验室室的的单单克克隆抗体所识别的同一分化抗原称为隆抗体所识别的同一分化抗原称为CDCD抗原抗原CDCD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志第十三页，本课件共有76页人人人人CDCD分组分组分组分组分 组

8、CD（举例）T细胞CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA 4)、CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B细胞CD19、CD20、CD21、CD40、CD79a(Ig)、CD79b(Ig)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64(Fc RI)、CD256(APRIL)、CD257(BAFF)、CD312(EMR2)血小板CD36、CD41(整合蛋白 IIb

9、)、CD42a CD42d、CD51(整合蛋白 v)、CD61(整合蛋白 3)、CD62P(P选凝素)NK细胞CD16(Fc RIII)、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、CD336(NKp44)、CD337(NKp30)非谱系CD30、CD32(Fc RII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、CD279(PD1)、CD281 CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、CD305(LAIR-1)、CD3

10、06(LAIR-2)、CD319(CRACC)第十四页，本课件共有76页人人人人CDCD分组分组分组分组分 组CD（举例）黏附分子CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18(整合蛋白 2)、CD29(整合蛋白 1)、CD49a CD49f、CD54(ICAM-1)、CD62E(E整合蛋白)、CD62L(L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM)细胞因子/CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、趋化因子受体CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4

11、)、CD195(CCR5)、CD261 CD264(TRAIL-R1 TRAIL-R4)内皮细胞 CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、CD144(VE钙黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322)碳水化合物结构CD15u、CD60a CD60c、CD75、CDw327 CDw329(siglec6、7、9)树突状细胞CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274 CD276(B7H1-B7H3)、CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、

12、CD304(BDCA4)干细胞/祖细胞CD133、CD243基质细胞 CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、CD331 CD334(FGFR1 FGFR4)、CD339(Jagged-1)红细胞 CD233 CD242第十五页，本课件共有76页二、二、免疫细胞的分离技术免疫细胞的分离技术 （一）（一）外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 （二）（二）T T淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离 （三）（三）B B淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离 （四）（四）Mo/MMo/M分离技术分离技术 （五）（五）NKNK细胞的分离技术细胞的分离技术 第十六页，本课

13、件共有76页免疫细胞分离基本原理免疫细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同第十七页，本课件共有76页根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法免疫细胞的分离技术1 1、密度梯度离心法、密度梯度离心法2 2、黏附分离法、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法）（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法）3 3、磁性分离法、磁性分离法4 4、荧光激活分离法、荧光激活分离法5 5、其他分离法、其他分离法（花环沉降法）（花环沉降法）第十八页，本课件共有76页（一）外周血单个核细胞分离（一）外周血单个核细胞分离 外外周周血

14、血单单个个核核细细胞胞（peripheralbloodmononuclear cells,PBMC）包包 括括 淋淋 巴巴 细细 胞胞 和和 单单 核核 细细 胞胞Ficoll分分 离离 液液 法法 主主 要要 用用 于于 分分 离离 外外 周周 血血 中中 的的 单单 个个 核核 细细 胞，是根据不同细胞密度不同的分离法胞，是根据不同细胞密度不同的分离法第十九页，本课件共有76页不同细胞密度不同不同细胞密度不同 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度 为为1.0771.077左右左右 人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.0931.093，1.0771.0

15、77 粒细胞密度为粒细胞密度为1.0921.092，1.077 1.077 血小板密度血小板密度 1.0771.077 第二十页，本课件共有76页肝素抗凝静脉血与等量肝素抗凝静脉血与等量HanksHanks液或液或PBSPBS混匀混匀沿管壁缓慢叠加于沿管壁缓慢叠加于FicollFicoll分层液面上分层液面上水平离心水平离心2000 rpm 20 min2000 rpm 20 min离心后管内分三层，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞离心后管内分三层，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞洗涤细胞两次洗涤细胞两次RPMI1640RPMI1640重悬细胞重悬细胞台盼兰染液混合计数台盼兰染液混合计

16、数细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色活细胞数活细胞数活细胞百分率活细胞百分率100100总细胞数总细胞数 方法用本法分离用本法分离PBMCPBMC，一般纯度在，一般纯度在9090以上，收获率可达以上，收获率可达80809090，活细胞百分率在活细胞百分率在9595以上以上第二十一页，本课件共有76页（二）（二）T T淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离第二十二页，本课件共有76页T淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群T T细胞的发育阶段分类细胞的发育阶段分类 表达表达TCRTCR的类型分类的类型分类 是否表达是否表达CD4CD4或或CD

17、8 CD8 T T细胞功能分类细胞功能分类 第二十三页，本课件共有76页T淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群T细胞的发育阶段分类细胞的发育阶段分类初始初始T细胞细胞naiveTcells未经抗原刺激的成熟未经抗原刺激的成熟T细胞，表达细胞，表达CD45RA效应效应T细胞细胞细胞细胞effectorTcells表达高亲和力表达高亲和力IL-2R，介导免疫效应，介导免疫效应记忆记忆T细胞细胞memoryTcellsmemoryTcells表达表达CD45RO，介导再次免疫应答，介导再次免疫应答第二十四页，本课件共有76页T淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群表达表达TCR的类型分类的类型分类TCR+T细胞细胞TCR+T

18、细胞细胞 第二十五页，本课件共有76页T淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群是否表达是否表达CD4或或CD8 CD4+T细胞细胞CD8+T细胞细胞 第二十六页，本课件共有76页T淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群T细胞功能分类细胞功能分类 辅助性辅助性T细胞细胞HelperTcells,Th效应效应T细胞细胞EffectorTcells,TE细胞毒细胞毒T细胞细胞CytotoxicTlymphocytes,CTL迟发性变态反应迟发性变态反应T细胞细胞DelayedTcells，Td初始初始T细胞细胞NaiveTcells调节性调节性T细胞细胞RegulatoryTcells，Tr记忆记忆T细胞细胞MemoryTce

19、lls，Tm抑制性抑制性T细胞细胞SuppressorTcells，Ts 第二十七页，本课件共有76页辅助性辅助性T细胞细胞HelperTcells,ThTh1:细胞免疫细胞免疫Th2：体液免疫：体液免疫Th17：炎症反应：炎症反应第二十八页，本课件共有76页辅助性辅助性T细胞细胞HelperTcells,ThTGF-+IL-6第二十九页，本课件共有76页辅助性辅助性T细胞细胞HelperTcells,Th滤泡辅助性滤泡辅助性T细胞（细胞（Tfollicularhelper，Tfh）通过细胞因子）通过细胞因子IL-10和和IL-21来调节来调节B细胞的功能细胞的功能 第三十页，本课件共有76页

20、 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化Foxp+T调节细胞可以从胸腺直接分化，也可在TGF-作用下从Foxp3-T细胞分化。调节性调节性T细胞细胞RegulatoryTcells，Tr第三十一页，本课件共有76页玫瑰花结玫瑰花结法（法（E E花环沉降法）花环沉降法）尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 淘洗法淘洗法免疫磁珠法免疫磁珠法流式细胞术分选法流式细胞术分选法（二）（二）T T淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离第三十二页，本课件共有76页人人T淋淋巴巴细细胞胞表表面面表表达达CD2分分子子，即即绵绵羊羊红红细细胞胞受受体体，B细细胞胞则则无无。在在适适当当的的条条件件下下，

21、可可与与绵绵羊羊红红细细胞胞（SRBC）结结合合，形形成成玫玫瑰瑰花花结结（rosette）,因因为为红红细细胞胞环环绕绕T细细胞胞，形形似花环，所以又称似花环，所以又称E-花环（花环（E-rosette）该该实实验验常常用用于于临临床床检检测测人人外外周周血血T淋淋巴巴细细胞胞的的数数量量和和比比例例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况 玫瑰花结法第三十三页，本课件共有76页淋巴细胞淋巴细胞 +SRBC+SRBC悬液悬液 37C37C水浴水浴 10 min 10 min 低温低速离心低温低速离心 T T细胞形成细胞形成E E花环而沉于管底花环而沉于管底

22、悬液中为悬液中为B B细胞。细胞。方法 第三十四页，本课件共有76页混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而龙毛上，而T细胞不与尼龙毛粘附的特性，这是获得富细胞不与尼龙毛粘附的特性，这是获得富含含T细胞群的有效方法细胞群的有效方法尼龙毛柱分离法第三十五页，本课件共有76页简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用可分离大量细胞可分离大量细胞细胞不会被激活，可用于功能测定细胞不会被激活，可用于功能测定纯度不高纯度不高耗时耗时

23、优点 缺点 第三十六页，本课件共有76页也叫亲合板结合分离法也叫亲合板结合分离法(immunepanningisolation）。）。利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于塑利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于塑料平板上，由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点料平板上，由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则与相应和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则与相应的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取中获取同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具同理若

24、用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适 淘洗法第三十七页，本课件共有76页亲亲和和板板分分离离淋淋巴巴细细胞胞示示意意图图第三十八页，本课件共有76页利用利用T T淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相载体上的特异性单抗结合，将载体上的特异性单抗结合，将T T细胞与其他细胞分细胞与其他细胞分离

25、的方法离的方法T淋巴细胞淘洗分离原理第三十九页，本课件共有76页1.1.羊抗兔羊抗兔IgIg包被平皿包被平皿2.2.CD4 CD4 一抗培育一抗培育T T细胞，倒入平皿，细胞，倒入平皿，44孵育孵育1 1小时；小时；3.3.收集未粘附的收集未粘附的CD4CD4-T T细胞细胞4.4.PBSPBS漂洗非特异吸附的漂洗非特异吸附的CD4CD4-T T细胞细胞5.5.收集粘附的收集粘附的CD4CD4+T T细胞，可以用刮板刮取并在显微镜细胞，可以用刮板刮取并在显微镜下观察下观察 方法（以CD4+T细胞为例）第四十页，本课件共有76页免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异免疫磁珠法分

26、离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离得以分离 免疫磁珠法（Magnetic activated cell sorting,MACS）第四十一页，本课件共有76页第四十二页，本课件共有76页N NS S阳性选择法（正选）第四十三页，本课件共有76页N

27、 NS S阴性选择法（负选）第四十四页，本课件共有76页第四十五页，本课件共有76页免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置第四十六页，本课件共有76页第四十七页，本课件共有76页将将特特异异性性抗抗T T细细胞胞表表面面分分子子的的单单克克隆隆抗抗体体与与磁磁性性小小珠珠形形成成免免疫疫磁磁珠，用这种免疫磁珠从珠，用这种免疫磁珠从PBMCPBMC中结合中结合T T细胞细胞在在磁磁场场中中，结结合合T T细细胞胞的的免免疫疫磁磁珠珠固固定定了了，未未结结合合的的其其它它细细胞胞被被洗脱下来洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱 T T细胞细胞 免疫磁珠法 阳性选择T细

28、胞 第四十八页，本课件共有76页将将多多种种特特异异性性抗抗非非T T细细胞胞表表面面分分子子的的单单克克隆隆抗抗体体与与磁磁性性小小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMCPBMC中结合非中结合非T T细胞细胞在在磁磁场场中中，结结合合其其它它细细胞胞的的免免疫疫磁磁珠珠固固定定了了，未未结结合的合的T T细胞被洗脱下来细胞被洗脱下来免疫磁珠法 阴性选择T细胞 第四十九页，本课件共有76页CD4+T Cell Isolation Kit II CD4+T Cell Isolation Kit II Non-CD4+TcellsinPBMC,i.e.,CD8+T

29、cells,/Tcells,Bcells,NKcells,dendriticcells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodies against CD8,TCR/,CD19,CD56,CD14,CD16,CD36,CD123,and CD235a(glycophorin A).These cells are subsequentlymagnetically labeled with Anti-Biot

30、in MicroBeads for depletion.Thereby,highlypureCD4+Tcellsareobtained.免疫磁珠法 阴性选择CD4+T细胞实例 PBMCbeforeseparationUntouchedCD4+Tcells第五十页，本课件共有76页荧光激活细胞分离法(fluorescence activated cell sorter,FACS)第五十一页，本课件共有76页FACSFACS用用途途：用用流流式式细细胞胞仪仪对对单单个个细细胞胞进进行行快快速速定定量量分分析析与与分分选选的的一一门技术门技术原原理理：包包在在鞘鞘液液中中的的细细胞胞通通过过高高频频

31、振振荡荡控控制制的的喷喷嘴嘴，形形成成包包含含单单个个细细胞胞的的液液滴滴，在在激激光光束束的的照照射射下下，这这些些细细胞胞发发出出散散射射光光和和荧荧光光，经经探探测测器器检检测测，转转换换为为电电信信号号，送送入入计计算算机机处处理理，输输出出统统计计结结果果，并并可可根根据据这这些些性性质质分分选选出出高高纯纯度度的的细细胞胞亚亚群群，分离纯度可达分离纯度可达99%99%第五十二页，本课件共有76页第五十三页，本课件共有76页 方法（以CD4+T细胞为例）PBMCPBMC用用PBSPBS洗涤，低温离心弃上清；洗涤，低温离心弃上清；加入含加入含ABAB血清的血清的PBSPBS封闭，封闭，

32、44孵育孵育1010分钟；分钟；加入适量的加入适量的PerCP-CD3PerCP-CD3，APC-CD4APC-CD4抗体，抗体，44孵育孵育3030分钟；分钟；PBSPBS洗涤，低温离心弃上清并用洗涤，低温离心弃上清并用RPMI 1640RPMI 1640重悬；重悬；流式细胞术分选；流式细胞术分选；第五十四页，本课件共有76页（三）（三）B B淋巴细胞及其亚群的分离淋巴细胞及其亚群的分离如如果果仅仅考考虑虑PBMC中中T细细胞胞和和B细细胞胞，那那么么所所有有从从PBMC中中分分离离T淋淋巴巴细细胞胞的的方方法法实实际际上上也也可可用用于于分分离离B淋巴细胞。淋巴细胞。第五十五页，本课件共有

33、76页B B细胞表面标志细胞表面标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分子是分子是B B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B B细细胞所特有，是鉴定胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标细胞可靠的指标 CD19/CD5CD19/CD5分子：可将分子：可将B B细胞区分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细胞，细胞，B1B1细胞为细胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞仅为细胞仅为CD19CD19阳阳性，性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞

34、细胞 第五十六页，本课件共有76页终浓度终浓度5 mM L-leucine methyl ester(L-LME)5 mM L-leucine methyl ester(L-LME)重悬重悬PMBCPMBC，混匀，室温混匀，室温35s35s离心，离心，400 g400 g，10 min10 min，弃上清，弃上清，PBSPBS洗涤洗涤细胞重悬于细胞重悬于25 ml RPMI 164025 ml RPMI 1640培养基，过尼龙毛柱，去除细培养基，过尼龙毛柱，去除细胞团块胞团块玫瑰花结法去除玫瑰花结法去除T T细胞细胞抗抗CD19CD19或或CD20CD20单抗标记，流式细胞仪检验单抗标记，流式

35、细胞仪检验B B细胞纯度细胞纯度去除Mo/M法第五十七页，本课件共有76页将将特特异异性性抗抗B B细细胞胞表表面面分分子子CD19CD19的的单单克克隆隆抗抗体体免免疫疫磁磁珠与珠与PBMCPBMC混合，用这种免疫磁珠从混合，用这种免疫磁珠从PBMCPBMC中结合中结合B B细胞细胞在在磁磁场场中中，结结合合B B细细胞胞的的免免疫疫磁磁珠珠固固定定了了，未未结结合合的的其它细胞被洗脱下来其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱 CD19CD19+B B细胞细胞 免疫磁珠法 阳性选择B细胞 第五十八页，本课件共有76页将将多多种种特特异异性性抗抗非非B B细

36、细胞胞表表面面分分子子的的单单克克隆隆抗抗体体与与磁磁性性小小珠珠形形成成免免疫疫磁磁珠珠，用用这这种种免免疫疫磁磁珠珠从从PBMCPBMC中中结结合合非非B B细胞细胞在在磁磁场场中中，结结合合其其它它细细胞胞的的免免疫疫磁磁珠珠固固定定了了，未未结结合合的的B B细胞被洗脱下来细胞被洗脱下来免疫磁珠法 阴性选择B细胞 第五十九页，本课件共有76页B Cell Isolation Kit II B Cell Isolation Kit II Non-Bcells,i.e.,Tcells,NKcells,monocytes,dendritic cells,granulocytes,platel

37、ets,and erythroid cells,are indirectly magnetically labeled using acocktail of biotinylated CD2,CD16,CD14,CD36,CD43,and CD235a(glycophorinA)antibodies.ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.HighlypureBcellsareobtainedbydepletionofmagneticallylabelednon-Bcel

38、ls.PBMCbeforeseparationUntouchedBcells免疫磁珠法 阴性选择B细胞实例 第六十页，本课件共有76页（四）（四）Mo/MMo/M分离技术分离技术 单单核核-巨巨噬噬细细胞胞包包括括骨骨髓髓中中的的前前单单核核细细胞胞、外外周周血血中中的的单单核核细细胞胞、以以及及组组织织内内的的巨巨噬噬细细胞胞(M)。M来来源源于于血血液液中中的的单单核核细细胞胞，而而单单核核细细胞胞又又来来源源于于骨骨髓髓中中的的前前体体细细胞。胞。第六十一页，本课件共有76页Mo/MMo/M细胞表面标志细胞表面标志 表面标志抗原：表面标志抗原：CD14CD14，但，但CD14CD14也表

39、达在粒细胞。也表达在粒细胞。CD14CD14主要强表达在单核主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞巨噬细胞，弱表达在粒细胞上上第六十二页，本课件共有76页 无血清无血清RPMI 1640RPMI 1640培养液将培养液将PBMC PBMC 2102106 6 cell/ml cell/ml重悬；重悬；75 ml75 ml培养瓶中加入培养瓶中加入1010 mlml细胞悬液，于培养箱内细胞悬液，于培养箱内3737孵育孵育1 1小时；小时；吸尽培养液，吸尽培养液，RPMI 1640RPMI 1640培养液漂洗培养液漂洗2 2遍，去除非黏附细胞；遍，去除非黏附细胞；细胞刮片轻轻刮取黏附的单核细胞。

40、细胞刮片轻轻刮取黏附的单核细胞。黏附法黏附法第六十三页，本课件共有76页快速，方便快速，方便纯度和得率均较低纯度和得率均较低易引起易引起Mo/M激活，引起基因表达和分泌蛋白激活，引起基因表达和分泌蛋白优点 缺点 第六十四页，本课件共有76页将将特特异异性性抗抗单单核核细细胞胞表表面面分分子子CD14CD14的的单单克克隆隆抗抗体体免免疫疫磁磁珠珠与与PBMCPBMC混混合合，用用这这种种免免疫疫磁磁珠珠从从PBMCPBMC中中结结合合单单核细胞核细胞在在磁磁场场中中，结结合合单单核核细细胞胞的的免免疫疫磁磁珠珠固固定定了了，未未结结合的其它细胞被洗脱下来合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫

41、磁珠上洗脱撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱 CD14CD14+单核细胞单核细胞 免疫磁珠法 阳性选择单核细胞 第六十五页，本课件共有76页将将多多种种特特异异性性抗抗非非单单核核细细胞胞表表面面分分子子的的单单克克隆隆抗抗体体与与磁磁性性小小珠珠形形成成免免疫疫磁磁珠珠，用用这这种种免免疫疫磁磁珠珠从从PBMCPBMC中结合非单核细胞中结合非单核细胞在在磁磁场场中中，结结合合其其它它细细胞胞的的免免疫疫磁磁珠珠固固定定了了，未未结结合合的的单单核细胞被洗脱下来核细胞被洗脱下来免疫磁珠法 阴性选择单核细胞 第六十六页，本课件共有76页Monocyte Isolation Kit II Monocyt

42、e Isolation Kit II Non-monocytes,such as T cells,NK cells,B cells,dendritic cells,andbasophils,are indirectly magnetically labeled using a cocktail of biotin-conjugated antibodies against CD3,CD7,CD56,CD19,CD16,CD123,andCD235a(Glycophorin A),as well as Anti-Biotin MicroBeads.Highly pureunlabeled mon

43、ocytes are obtained by depletion of the magnetically labeledcells.PBMCbeforeseparationUntouchedMonocytes免疫磁珠法免疫磁珠法 阴性选择单核细胞阴性选择单核细胞第六十七页，本课件共有76页PBMCPBMC用用PBSPBS洗涤，低温离心弃上清洗涤，低温离心弃上清加入含加入含ABAB血清的血清的PBSPBS封闭，封闭，44孵育孵育1010分钟分钟加入适量的加入适量的FITC-FITC-CD14CD14抗体，抗体，44孵育孵育3030分钟分钟PBSPBS洗涤，低温离心弃上清并用洗涤，低温离心弃上清并

44、用RPMI 1640RPMI 1640重重悬悬流式细胞术分选流式细胞术分选流式细胞术分选单核细胞流式细胞术分选单核细胞第六十八页，本课件共有76页（四）（四）自然杀伤细胞（自然杀伤细胞（NKNK）的的分离技术分离技术 无无须须抗抗原原预预先先作作用用，可可直直接接杀杀伤伤肿肿瘤瘤细细胞胞和和病病毒毒感感染染细细胞胞，在在机机体体免免疫疫监监视视和和早早期期抗抗感感染染过过程程中中起起重重要作用要作用第六十九页，本课件共有76页NKNK细胞表面标志细胞表面标志 表面标志抗原：表面标志抗原：CD3CD3-、CD56CD56+、CD16CD16+第七十页，本课件共有76页NK cell Isolat

45、ion KitNK cell Isolation KitNon-NK cells,i.e.,T cells,B cells,stem cells,dendritic cells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesandtheNKCellMicroBeadCocktail.Isolation of highly pure NK cells is achieved by depletion of m

46、agneticallylabeledcells.PBMCbeforeseparationUntouchedNKcells免疫磁珠法免疫磁珠法第七十一页，本课件共有76页三、免疫细胞分离的临床意义三、免疫细胞分离的临床意义第七十二页，本课件共有76页免疫细胞的分化第七十三页，本课件共有76页肿瘤局部微环境内的抑制性细胞亚群肿瘤局部微环境内的抑制性细胞亚群调节性调节性T细胞（细胞（regulatoryTcells,Treg）髓系来源的抑制性细胞髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs）肿瘤相关巨噬细胞（肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,TAM）调节性调节性NK细胞（细胞（regulatoryNKcells）调节性树突状细胞（调节性树突状细胞（regulatoryDC）第七十四页，本课件共有76页记忆记忆T细胞细胞(Tm)效应性记忆效应性记忆T细胞细胞TEM外周炎症组织外周炎症组织行使速发性效应功能行使速发性效应功能CD45RO+CCR7-CD62L-中枢性记忆中枢性记忆T细胞细胞TCM外周淋巴器官外周淋巴器官分化成效应细胞分化成效应细胞CD45RO+CCR7+CD62L+第七十五页，本课件共有76页感感谢谢大大家家观观看看2/28/2023第七十六页，本课件共有76页