1-3-1菊花的组织培养-副本.ppt

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1、课题课题1 1 菊花的组织培养菊花的组织培养学习目标学习目标熟悉植物组织培养的基本过程。熟悉植物组织培养的基本过程。理解细胞分化、脱分化及再分化概念。理解细胞分化、脱分化及再分化概念。课题重点与难点课题重点与难点课题重点：植物组织培养的基本过程。课题重点：植物组织培养的基本过程。课题难点：植物组织培养过程中使用课题难点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。细胞分化，脱分化，再的无菌技术。细胞分化，脱分化，再分化。分化。1.1.细胞分化：细胞分化：个体发育中，细胞在形态、结构和个体发育中，细胞在形态、结构和 生理功能上出现生理功能上出现稳定性稳定性差异的过程。差异的过程。特定时空下基因的选择性表达

2、。特定时空下基因的选择性表达。形成各种组织器官。形成各种组织器官。结果：结果：原因：原因：定义：定义：？什么是细胞分化？什么是细胞分化？细胞分化的原因和结果？细胞分化的原因和结果？一、基础知识一、基础知识2.植物组织培养的理论基础：植物组织培养的理论基础：细胞全能性：具有某种生物全套细胞全能性：具有某种生物全套遗传信息遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成的任何一个活细胞，都具有发育成完整个完整个体体的能力，即每个生物细胞都具有的能力，即每个生物细胞都具有全能性全能性。细胞全能性表达条件：细胞全能性表达条件：2.一定的营养物质、激素和其他外界条件一定的营养物质、激素和其他外界条件1.外植体：从

3、活植物体上切下进行培养的那外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官部分组织或器官二、植物组织培养的基本过程二、植物组织培养的基本过程 离体器官、组织或细胞 脱分化 愈伤组织 再分化丛芽、根 植物体 外植体由高度分化的由高度分化的植物组织或细胞植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。产生愈伤组织的过程。愈伤组织是通过愈伤组织是通过细胞分裂细胞分裂形成的，形成的，其细胞排列其细胞排列疏松而无规则疏松而无规则，高度高度液泡化液泡化呈呈无定形无定形状态的状态的薄壁薄壁细胞。细胞。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，又可以重新分化成根或芽

4、等器官，这个过程叫再分化。这个过程叫再分化。三、影响植物组织培养的因素三、影响植物组织培养的因素 不同植物不同植物的组织培养难度不同的组织培养难度不同 同一种植物的同一种植物的不同组织不同组织培养难度不同培养难度不同 大量元素：大量元素：微量元素：微量元素：有机物：有机物：植物激素植物激素：1、外植体的选取、外植体的选取2、培养基的配制、培养基的配制(MS培养基培养基)N、P、K、Ca、Mg、S B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等 生长素、细胞分裂素、赤霉素等生长素、细胞分裂素、赤霉素等 讨论：讨论：P33旁栏旁栏微量

5、元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐无机盐；蔗糖蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求细胞对特殊营养的需求。微生物微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，不同，MSMS培养基则需提供大量无机营养。培养基则需提供大量无机营养。3、不同植物激素浓度，使用顺序和使用量、不同植物激素浓度，使用顺序和使用量生长素细胞生长素细胞分裂素比值分裂素比值结果结果 比值高时比值高时

6、促根分化，促根分化，抑芽形成抑芽形成 比值低时比值低时 促芽分化，促芽分化，抑根形成抑根形成 比值适中比值适中 促进愈伤组促进愈伤组织生长织生长 使用顺序使用顺序实验结果实验结果先使用生长先使用生长素，后使用素，后使用细胞分裂素细胞分裂素有利于细胞有利于细胞分裂，但不分裂，但不利分化利分化先使用细胞先使用细胞分裂素后使分裂素后使用生长素用生长素细胞既分裂细胞既分裂也分化也分化同时使用同时使用分化频率提分化频率提高高4、消毒、消毒在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境原因：在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境原因：5、pH、温度、光照、温度、光照菊花：菊花：pH=5.8 温度控制在温度控制

7、在1822 每日光照每日光照12h活动：活动：用自己的话把菊花组织培养的操作流程给用自己的话把菊花组织培养的操作流程给描述出来描述出来?（提示：（提示：怎样配制怎样配制MS培养基培养基?外外植体消毒应如何进行植体消毒应如何进行?接种、培养、移栽时接种、培养、移栽时应注意什么问题应注意什么问题?）制备制备MS固体固体培养基培养基外植体消毒外植体消毒 接种接种 培培 养养栽栽 培培四、实验操作四、实验操作 移移 栽栽冲洗冲洗酒精酒精无菌水冲洗无菌水冲洗氯化汞氯化汞无菌无菌水冲洗至少三次之上水冲洗至少三次之上二、实验操作二、实验操作（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMS培养基包括培

8、养基包括2020多种营养成分，实验室一般多种营养成分，实验室一般使用使用4 4。C C保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来制备1 1、配置各种母液、配置各种母液无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩1010倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量2 2、配置培养基、配置培养基定容定

9、容 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 3 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1 1 1 1、选材：、选材：、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒（二）外植体消毒2 2 2 2、消毒、消毒、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉

10、，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗洗后在流水下冲洗洗后在流水下冲洗洗后在流水下冲洗20min20min20min20min左右左右左右左右 酒精酒精酒精酒精处理处理处理处理无菌水冲洗无菌水冲洗用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70707070的酒精中摇动的酒精中摇动的酒精中摇动的酒精中摇动2 2 2 23 3 3 3次，持续次，持续次，持续次，持续6 6 6 67s7s7s7s，立即将外植体，立即将外植体，立即将外植体，立即将外植体取出

11、，在无菌水中清洗取出，在无菌水中清洗取出，在无菌水中清洗取出，在无菌水中清洗 氯化汞氯化汞无菌水冲洗至少三次之上无菌水冲洗至少三次之上取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为数为数为数为0.10.10.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 1 1 12min2min2min2min，取出后在无菌水中，取出后在无菌水中，取出后在无菌水中，取出后在无菌水中至少清洗至少清洗至少清洗至少清洗3 3 3 3次，漂

12、净次，漂净次，漂净次，漂净消毒液消毒液消毒液消毒液（三）接种（三）接种1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无菌操作要求、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种污染的主要来源是空气中的细菌污染的主要来源是空气中的细菌污染的主要来源是空气中的细菌污染

13、的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要和孢子，接种室消毒是至关重要和孢子，接种室消毒是至关重要和孢子，接种室消毒是至关重要的。用的。用的。用的。用70707070的酒精喷雾使空气消的酒精喷雾使空气消的酒精喷雾使空气消的酒精喷雾使空气消毒，毒，毒，毒，酒精或新洁尔灭擦洗工作台酒精或新洁尔灭擦洗工作台酒精或新洁尔灭擦洗工作台酒精或新洁尔灭擦洗工作台并用紫外线照射并用紫外线照射并用紫外线照射并用紫外线照射20202020分钟分钟分钟分钟4 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为数为7575的酒精溶液中消毒一次，然后在酒

14、的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件分利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养基利于吸收水分和养分（四）培养（四）培养无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，光

15、照无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，光照无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，光照无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，光照（五）移栽（五）移栽（六）栽培（六）栽培幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花时浇水、施肥，直至开花时浇水、施肥，直至开花时浇水、施肥，直至开花移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封移栽生根的菊花试管苗之前，应先

16、打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日口膜，让试管苗在培养间生长几日口膜，让试管苗在培养间生长几日口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1 1 1、打开封口膜、打开封口膜、打开封口膜、打开封口膜2 2 2 2、清洗转移、清洗转移、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭将幼苗移植到消过毒的蛭将幼苗移植到消过毒的蛭将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下石或珍珠岩等环境下石或珍珠岩等环境下石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间生活一段时间生活一段时间珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好

17、，适合栽培珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培三、课题延伸三、课题延伸1 1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养容易进行组织培养2 2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季思思 考考 在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）、外植体的消毒（酒精

18、、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灼烧）灼烧）4、无菌箱中的培养；、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。结果分析与评价结果分析与评价（一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析（二）是否完成了对植物组织的脱分化和（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再再 分化分化（三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录（四）生根苗的移栽是否合格（四）生根苗的移栽是否合格总结植物组织培养过程总结植物组织培养过程:离离离离体体体体组组组组织织织织或或或或细细细细胞胞胞胞植植植植物物

19、物物体体体体脱分化脱分化脱分化脱分化细胞分细胞分细胞分细胞分裂素裂素裂素裂素生长素生长素生长素生长素愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织芽芽芽芽根根根根细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素细胞分裂细胞分裂细胞分裂细胞分裂素素素素 生长素生长素生长素生长素再分化再分化再分化再分化植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养植物细胞培养不需要光不需要光不需要光不需要光需要光需要光需要光需要光基础知识基础知识（一）植物组织培养的基本过程一）植物组织培养的基本过程植物的组织培养技术植物的组织培养技术不同的植物组织不同的植物组织同一植物的不同材料同一植物的不同材料营养、环境条件营养、环

20、境条件植物激素植物激素（二）影响植物组织培养的因素（二）影响植物组织培养的因素1.制备制备MS固体培养基固体培养基 1.11.1、配制母液、配制母液 1.21.2、配制培养基、配制培养基 1.31.3、灭菌、灭菌2.外植体消毒外植体消毒3.接种接种4.培养培养5.移栽移栽6.栽培栽培实验操作实验操作本课题内容小结菊花菊花组织组织培养培养基础基础知识知识实验实验操作操作植物体植物体的组织的组织培养培养影响组影响组织培养织培养的因素的因素细胞分化细胞分化细胞全能性细胞全能性组织培养过程组织培养过程营养营养激素激素环境条件环境条件MSMS固体培养基制备固体培养基制备外植体消毒外植体消毒接种接种培养培养移栽移栽栽培栽培思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。