07 普通遗传学 细菌和病毒的遗传.ppt

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1、第七章第七章 细菌和病毒的遗传细菌和病毒的遗传本章要点本章要点细菌和病毒在遗传研究中的优越性；细菌和病毒在遗传研究中的优越性；温和噬菌体、烈性噬菌体；温和噬菌体、烈性噬菌体；原噬菌体、溶原性细菌与溶原性生活周期。原噬菌体、溶原性细菌与溶原性生活周期。F-菌株、菌株、F+菌株、菌株、Hfr菌株；菌株；F因子、因子、F因子；因子；转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；酵母：酵母：三个字母表明基因功能，后面的数字表三个字母表明基因功能，后面的数字表示基因座。示基因座。啤酒酵母啤酒酵母基因基因:GAL4，CD28蛋白质蛋白质:GAL4，CDC28非洲粟酒酵母非

2、洲粟酒酵母基因基因:gal4，cdc2蛋白质蛋白质:Gal4，Cdc2基因和基因产物的符号基因和基因产物的符号细菌：细菌：用三个引文字母表示。用三个引文字母表示。表型第一个字母大写，用表型第一个字母大写，用正体正体；基因型三个字母都小写，用基因型三个字母都小写，用斜体斜体；肩上的符号表示野生型、突变型、抗性或敏感性。肩上的符号表示野生型、突变型、抗性或敏感性。如：如：表型表型野生型野生型Gal，突变型，突变型Gal或或Gal基因型基因型野生型野生型gal，突变型突变型gal 或或gal 表型表型AmpRAmpS基因型基因型ampramps果蝇果蝇:以以1-4个字母表示。个字母表示。基因基因:w

3、hite(w),tailless(tll),hedgehog(hh);蛋白蛋白:White,Tailless,Hedgehog植物植物:没有惯用法，没有惯用法，大多数用大多数用1-3个小写字母表示。个小写字母表示。Arabidopsis 基因用果蝇的方法命名但用大写字基因用果蝇的方法命名但用大写字母，如母，如基因基因AGAMOUS（AG），蛋白），蛋白AGAMOUS。脊椎动物脊椎动物:一般以一般以1-4个小写字母表示其基因功能。个小写字母表示其基因功能。例如，基因例如，基因sey,myc,蛋白蛋白Sey,Myc人类人类:方法如脊椎动物但需大写方法如脊椎动物但需大写。例如基因例如基因 MYC、S

4、RY，蛋白，蛋白MYC、ENO1。基因产物的命名无统一的规定，现在一般都用基因产物的命名无统一的规定，现在一般都用正体，全部大写，或第一个字母大写，如正体，全部大写，或第一个字母大写，如Gal或或GAL。第一节第一节 细菌和病毒遗传研究的意义细菌和病毒遗传研究的意义一、细菌的生物学特征一、细菌的生物学特征二、病毒的生物学特征二、病毒的生物学特征三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性四、细菌和病毒的拟有性过程四、细菌和病毒的拟有性过程五、细菌遗传的实验研究方法五、细菌遗传的实验研究方法一、细菌的生物学特征一、细菌的生物学特征1、细菌是、细菌是单细胞生物单细胞生物，完

5、成每个世代只需，完成每个世代只需20分钟，分钟，而且容易得到它的生化突变型。而且容易得到它的生化突变型。2、结构：、结构：鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体鞭毛、细胞壁、质膜、间体、核质体（拟核）、核糖体（拟核）、核糖体3、涂布和繁殖：每个细胞在较短时间内能裂殖、涂布和繁殖：每个细胞在较短时间内能裂殖107，称为肉眼可见的菌落。，称为肉眼可见的菌落。图图7-17-1大肠杆菌大肠杆菌图图7-2细菌的细胞结构与涂布繁殖细菌的细胞结构与涂布繁殖一、细菌的生物学特征一、细菌的生物学特征4、其遗传物质、其遗传物质DNA主要以单个主染色体的形式主要以单个主染色体的形式存在。存在。这种这种DNA与真核生物的与

6、真核生物的DNA不同不同，它不，它不与组蛋白相结合，也不形成核小体的结构是一与组蛋白相结合，也不形成核小体的结构是一个封闭的大环。通常还有一个或多个小染色体个封闭的大环。通常还有一个或多个小染色体(质粒质粒)。5、研究细菌遗传的方法：主要是对细菌菌落形、研究细菌遗传的方法：主要是对细菌菌落形态的遗传研究态的遗传研究(如图，霉菌菌落如图，霉菌菌落)图图7-3霉菌菌落霉菌菌落5、菌落形态性状的突变包括：菌落的形状、颜色和大小等。6、生理特性的突变包括：丧失合成某种营养物质能力的营养缺陷型。7、抗性突变包括：抗药性或抗感染性。二、病毒的生物学特征二、病毒的生物学特征1、病毒是比细菌更为简单的生物，它

7、们也只有一条染色体，即单倍体。有些病毒的染色体是DNA，还有一些病毒是RNA。2、病毒主要是由蛋白质外壳及其包被的核酸所组成的颗粒。病毒可根据宿主(动物、植物、细菌)或遗传物质(DNA或RNA)来分类。细菌病毒(Bacterial phage)，称为噬菌体(phage)(如图)，是目前经过广泛研究，了解比较清楚的一种病毒。图图7-4噬菌体噬菌体图图7-5烟草花叶病毒腺病毒烟草花叶病毒腺病毒T4噬菌体爱滋病病毒噬菌体爱滋病病毒RNADNADANRNA图图7-6爱滋病病毒爱滋病病毒三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性世代周期短，繁殖世代所需时间短；世代周期短，繁殖世

8、代所需时间短；易于操作管理和进行化学分析易于操作管理和进行化学分析(纯培养与代谢产物累积纯培养与代谢产物累积)；便于研究基因的突变便于研究基因的突变(表现与选择表现与选择)；便于研究基因的作用便于研究基因的作用(突变型生长条件与基因作用突变型生长条件与基因作用)；便于研究基因的重组便于研究基因的重组(重组群体大、选择方法简便有效重组群体大、选择方法简便有效)；遗传物质比较简单，可作为研究高等生物的简单模型。遗传物质比较简单，可作为研究高等生物的简单模型。四、细菌和病毒的拟有性过程四、细菌和病毒的拟有性过程虽然细菌和病毒不具备象真核生物配子进行融合虽然细菌和病毒不具备象真核生物配子进行融合的有性

9、过程，但它们的的有性过程，但它们的遗传物质也能从一个细胞遗传物质也能从一个细胞传递到另一个细胞，并且也能形成重组体传递到另一个细胞，并且也能形成重组体。细菌获取外源遗传物质细菌获取外源遗传物质有四种不同的方式：转化，有四种不同的方式：转化，接合，转导和性导。接合，转导和性导。拟有性拟有性过程的存在是细菌、病毒作为过程的存在是细菌、病毒作为真核生物的真核生物的模型模型研究遗传重组和基因结构研究遗传重组和基因结构的重要的重要前提前提。五、细菌遗传的实验研究方法五、细菌遗传的实验研究方法 1 1、细胞计数、细胞计数(培养物细胞浓度培养物细胞浓度)2 2、建立纯系的方法、建立纯系的方法 3 3、选择培

10、养法鉴定突变型与重组型、选择培养法鉴定突变型与重组型 4 4、突变型与重组型的批量筛选方法、突变型与重组型的批量筛选方法 1 1、细胞计数、细胞计数(培养物细胞浓度培养物细胞浓度)培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是：验技术，其基本思路是：对原培养物进行连续稀释；对原培养物进行连续稀释；进行平板涂抹培养；进行平板涂抹培养；由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数；由于每个细胞形成一个菌落，计数菌落数；根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。图图7-7细胞计数细胞计数(培养物细胞浓度培养物细胞浓度)R

11、esultsoftheserialdilutiontechniqueandsubsequentcultureofbacteria图图7-8细菌培养细菌培养 2 2、建立纯系的方法、建立纯系的方法纯培养纯培养挑取由单个细胞繁殖而来的菌落进行培养就可挑取由单个细胞繁殖而来的菌落进行培养就可以获得由一个细胞繁殖而来的纯系。以获得由一个细胞繁殖而来的纯系。通常采用通常采用平板表面涂布法平板表面涂布法或或划线法划线法可以获得单可以获得单菌落。这种方法获得的纯系，称为菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯菌种纯”。有时采用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法有时采用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法从单个细胞直

12、接培养建立纯系。采用这种方法从单个细胞直接培养建立纯系。采用这种方法获得的纯系称为获得的纯系称为“菌株纯菌株纯”。图图7-9 7-9 细菌培养细菌培养3、选择培养法鉴定突变型与重组型、选择培养法鉴定突变型与重组型许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。有关。营养缺陷型营养缺陷型的筛选、鉴定：的筛选、鉴定：选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现将菌株分为的生长表现将菌株分为原养型原养型(也称为原生营养型也称为原生营养型)与与营营养缺陷型养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应

13、在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长的营养培养基上生长)。营养突变型的筛选、鉴定方法与红色面包霉生化突变营养突变型的筛选、鉴定方法与红色面包霉生化突变型的鉴定方法基本一致。型的鉴定方法基本一致。4、突变型与重组型的批量筛选方法、突变型与重组型的批量筛选方法选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，效率太低。检测分离含有多种突变型的混和菌株，效率太低。为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了伯格夫妇设计了影印培养法影印培养法。该方法原理与选择培

14、养法一致，但是采用影印该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选不同选择培养基择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。定效率大大提高。图图7-10影印培养法影印培养法图图7-11影印培养法影印培养法注意：注意：(1)最初的培养基必须是非选择性的，即各最初的培养基必须是非选择性的，即各种突变型都能够在其上生长；种突变型都能够在其上生长；(2)必须采用适当的方法如涂布或划线法，必须采用适当的方法如涂布或划线法，以使培养物菌落之间要分开。以使培养物菌落之间要分开。第二节第二节噬菌体

15、的遗传分析噬菌体的遗传分析一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体二、温和噬菌体二、温和噬菌体三、噬菌体三、噬菌体(T2)的基因重组的基因重组一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体：遗传学上应用较广泛的是大肠杆菌的遗传学上应用较广泛的是大肠杆菌的T偶数偶数系列噬菌体。它们的外貌都象蝌蚪状系列噬菌体。它们的外貌都象蝌蚪状(如如图图)。T偶数系列噬菌体具有偶数系列噬菌体具有六角形的头部六角形的头部，其内，其内部含有部含有双链双链DNA分子分子，尾部包括一个中空，尾部包括一个中空的的针状结构及外鞘针状结构及外鞘。末端是。末端是基盘基盘，由尾丝，由尾丝及尾针组成。及尾针组成。图图7-12一、烈性噬菌体一、烈性噬菌体T偶数系

16、列噬菌体的尾丝附着在大肠杆菌表偶数系列噬菌体的尾丝附着在大肠杆菌表面时，面时，通过尾鞘的收缩将噬菌体通过尾鞘的收缩将噬菌体DNA经中经中空尾部注入寄主细胞空尾部注入寄主细胞，破坏寄主细胞的遗，破坏寄主细胞的遗传物质，并合成大量的噬菌体传物质，并合成大量的噬菌体DNA和蛋白和蛋白质，组成许多新的子噬菌体，最后使细菌质，组成许多新的子噬菌体，最后使细菌裂解，裂解，释放出无数个子噬菌体释放出无数个子噬菌体。所以这样。所以这样的的T偶数系列噬菌体称为偶数系列噬菌体称为烈性噬菌体。烈性噬菌体。图图7-13烈性噬菌体烈性噬菌体T4噬菌体从大肠杆菌中释放图图7-14烈性噬菌体烈性噬菌体图图7-15烈性噬菌体

17、烈性噬菌体图图7-16噬菌体的溶解性周期噬菌体的溶解性周期二、温和噬菌体二、温和噬菌体温和噬菌体温和噬菌体侵入细菌后，细菌并不裂解，即侵入细菌后，细菌并不裂解，即它们有溶原性的生活周期。例如它们有溶原性的生活周期。例如和和P1噬菌噬菌体可代表略有不同的溶原性类型。体可代表略有不同的溶原性类型。噬菌体附着在大肠杆菌染色体的噬菌体附着在大肠杆菌染色体的gal和和bio位点之间的位点之间的att座位上，它能通过交换而整座位上，它能通过交换而整合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为原原噬菌体噬菌体(图图)。溶原性细菌溶原性细菌是带有原噬菌体基因组的是带有原噬菌体基因组的细

18、菌。如乳酸菌溶原性具有完整的细菌。如乳酸菌溶原性具有完整的噬菌噬菌体基因组体基因组而不被裂解的细菌称为溶原性而不被裂解的细菌称为溶原性细菌。细菌。用温和噬菌体感染细菌并使之成为溶用温和噬菌体感染细菌并使之成为溶原性细菌的过程称为原性细菌的过程称为“溶原化溶原化”图图7-17噬菌体噬菌体图图7-18图图7-19噬菌体特定位点的整合噬菌体特定位点的整合图图7-20噬菌体的溶原性（噬菌体的溶原性（lysogenic)周期及溶解性周期及溶解性(lytic)的转变的转变病毒病毒宿主宿主核酸结构核酸结构染色体类型染色体类型染色体长度染色体长度（m）T-偶数噬菌体偶数噬菌体E.coli双链双链DNA线状；环

19、状排列末端有线状；环状排列末端有RS60T7E.coli双链双链DNA线状；单一顺序线状；单一顺序12E.coli双链双链DNA线状；单股粘性末端线状；单股粘性末端16P22沙门氏菌沙门氏菌双链双链DNA线状；单一顺序线状；单一顺序14174E.coli单链单链DNA环状环状1.8QE.coli单链单链RNA线状线状1.4（呼肠病毒）（呼肠病毒）哺乳动物哺乳动物双链双链RNA几个片段几个片段8.3SV40人类人类双链双链DNA超螺旋环超螺旋环1.7鼠白血病病毒鼠白血病病毒鼠鼠单链单链RNA几个片段几个片段烟草花叶病毒烟草花叶病毒烟草烟草单链单链RNA线状线状RS:重复序列，引自重复序列，引自P

20、eterJ.Russell:1972表表7-1几种病毒染色体的特点几种病毒染色体的特点1、噬菌体遗传学的建立与发展：、噬菌体遗传学的建立与发展：（1）1946年，年，BeadlrA.D.andTatum宣布了宣布了“一基因一酶一基因一酶”学说；学说；（2）LederbergJ.细菌杂交实验报告；细菌杂交实验报告；（3）HersheyA.D.andLuriaS.宣布发现了宣布发现了r，h突变体突变体（4）DelbrukeM.D.andHersheyA.D.各自各自发现噬菌体重组。发现噬菌体重组。三、噬菌体三、噬菌体(T2)的基因重组与遗传作图的基因重组与遗传作图2、噬菌体的突变：、噬菌体的突变：

21、噬菌斑的形态噬菌斑的形态宿主范围宿主范围（1）噬菌斑突变：）噬菌斑突变：T噬菌体的噬菌体的r-突变体（速溶）突变体（速溶）正常噬菌体，正常噬菌体，r+，产生的菌斑小而边缘模糊，产生的菌斑小而边缘模糊突变噬菌体，突变噬菌体，r-，产生的菌斑大两倍而边缘清晰，产生的菌斑大两倍而边缘清晰（2）宿主范围突变：）宿主范围突变：T2噬菌体的噬菌体的h-突变体突变体正常噬菌体，正常噬菌体，h+，只能以，只能以EcoliB株株(Ttor)为宿主为宿主突变噬菌体，突变噬菌体，h-，能以，能以EcoliB株和株和B/2株株(Ttos)为宿主为宿主3、T2噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组将两种不同的将两种不同的T2

22、突变体进行杂交，对其杂交子代突变体进行杂交，对其杂交子代进行重组分析。进行重组分析。杂交方法：杂交方法：将将Ttor和和Ttos两种大肠杆菌细胞混合；两种大肠杆菌细胞混合；同时接种高浓度的同时接种高浓度的T2噬菌体的噬菌体的h-r+和和h+r-两种突变体，两种突变体，保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染；保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染；两种不同的噬菌体两种不同的噬菌体DNA可能在宿主细胞内进行重组，可能在宿主细胞内进行重组，从而产生从而产生非亲本型子代非亲本型子代h+r+和和h-r-。亲本型亲本型重组型重组型 hr+,h+r双重感染双重感染E.coli进行的进行的 杂交杂交(引自引自

23、Griffiths et al.,1999)图图7-21图图7-22T2噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组h+r-h-r+接种在同时长有接种在同时长有B和和B/2株的培养基上株的培养基上h+r-h-r+h+r+h-r-混浊，大混浊，大透明，小透明，小混浊，小混浊，小透明，大透明，大图图7-23h+r-h-r+培养所产生的四种噬菌斑培养所产生的四种噬菌斑 h+r-h-r-h+r+h-r+图图7-24噬菌斑噬菌斑4、T2的环形遗传图的环形遗传图Hershey根据根据h+r-h-r+的杂交结果推的杂交结果推测测T2的染色体是线性的。的染色体是线性的。多个多个T2噬菌体的杂交结果显示：噬菌体的杂交结果显

24、示：ra、rb、rc有有4种不同的排列形式。种不同的排列形式。杂交每一基因型的%r+h+r-h+r+h-r-h-重组值rah+xr+h-rbh+xr+h-rch+xr+h-12.034.042.012.05.932.056.06.40.739.059.00.924/100=24.0%12.3/100.3=12.3%1.6/99.6=1.6%rxh+r+h出现的出现的4 种噬菌斑的数目和求得的重组值种噬菌斑的数目和求得的重组值 （rx代表不同的代表不同的r 基因）基因）不同的快速溶菌突变型在表型上不同，记作不同的快速溶菌突变型在表型上不同，记作ra,rb,rc。将这几种快速溶菌突变型。将这几种快

25、速溶菌突变型(rx h+)与宿主与宿主范围突变型范围突变型(r+h)杂交，结果如下表：杂交，结果如下表：去掉去掉%的重组值可作为基因间的图距，用来作基因连锁图。的重组值可作为基因间的图距，用来作基因连锁图。rahrbhhrc24.012.31.6rahrbrcrahrbrcrahrbrcrahrbrcrbrarch图图7-25 噬菌体噬菌体T2 的环状基因连锁图的环状基因连锁图三个三个r 基因与基因与h 基因的连锁图基因的连锁图4 种不同的基因顺序种不同的基因顺序rc-rb+rc+rb-第三节第三节细菌的染色体作图细菌的染色体作图一、转化一、转化（transformation）二、接合二、接合

26、（conjugation）三、性导三、性导（transduction）四、转导四、转导（sexduction)）一个细菌细胞的DNA与另一个细菌细胞的DNADNA的交换重组的交换重组可以通过4种方式进行一、转化一、转化转化转化(transformation)：指某些细菌：指某些细菌(或其它或其它生物生物)能通过其细胞膜能通过其细胞膜摄取周围介质中的摄取周围介质中的DNA片段，片段，并将此外源并将此外源DNA片段整合到自己染色体组中的过片段整合到自己染色体组中的过程。程。转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个菌转化过程

27、有一定差异，但是它们都存在几个共共同特征：同特征：（一）转化过程（一）转化过程1、感受态与感受态因子：、感受态与感受态因子：感受态感受态指细菌能够从周围环境中吸收指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进分子进行转化的行转化的生理状态生理状态。感受态主要受一类蛋白质感受态主要受一类蛋白质(感受态因子感受态因子)影响，感受影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可

28、以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用例，用Ca2+处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。其感受能力。2、供体、供体(donor)DNA与受体与受体(receptor)细胞结细胞结合合(binding)：结合发生在受体细胞特定部位结合发生在受体细胞特定部位(结合点结合点)；对供体对供体DNA片段有一定要求；片段有一定要求；结合过程是一个不可逆过程。结合过程是一个不可逆过程。3、DNA摄取：摄取：当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源外源DNA；细菌在摄取外源细菌在摄取外源DN

29、A时，由时，由DNA移位酶移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产降解其中一条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条链拉进细胞中。生的能量，将另一条链拉进细胞中。4、联会、联会(synapsis)与外源与外源DNA片段整合片段整合(integration)：整合整合就是指单链的转化就是指单链的转化DNA与受体与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺入到受对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体体DNA中的过程。中的过程。实际上就是一个遗传重组的过程。因而实际上就是一个遗传重组的过程。因而研究整合的分子机制事实上也为遗传重研究整合的分子机制事实上也为遗传重组的分子机制作出了贡献。组的分子机制作出了

30、贡献。图图7-26 细菌转化的机制细菌转化的机制(转引自转引自Russell,1992)转化细胞 非转化细胞 复制 带有杂合DNA片断的染色体 降解 通过双交换进行重组 形成三链联会 一条供体的链进入细胞 供体双链DNA 受体DNA 自然转化自然转化（naturaltransformation）在自然转化中细菌可以自由地吸收在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化。枯草杆菌中的转，通过它来进行遗传转化。枯草杆菌中的转化属于自然转化化属于自然转化。工程转化工程转化（engineeredtransformation）在这种转化中，细菌发生改变使得它们在这种转化中，细菌发生改变使得

31、它们能摄入并转化外源能摄入并转化外源DNA。E.coli 转化就属转化就属于工程转化。于工程转化。本实验采用质粒本实验采用质粒pUC18转化大肠杆转化大肠杆菌菌DH-5a，通过氨苄青霉素抗性筛选转，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。化子。我们通过一个重要的分子生物学我们通过一个重要的分子生物学实验来介绍实验来介绍细菌工程转化细菌工程转化的过程：的过程：（一）实验材料（一）实验材料大肠杆菌大肠杆菌DH-5a质粒质粒pUC18（ampicillin，AmpR）（二）培养基和试剂（二）培养基和试剂1.LB液体培养基液体培养基(%)2.LB固体培养基固体培养基3.抗生素：氨苄青霉素配制成抗生素：氨苄青霉素

32、配制成100mg/ml备用。备用。4.0.1mol/LCaCl2溶液溶液实验材料和试剂：实验材料和试剂：（三）器材（三）器材接种针接种针10ml移液管移液管50ml塑料离心管塑料离心管5ml移液管移液管90mm培养皿培养皿1ml移液管移液管1.5mlEppendorf管管200ml吸头吸头三角瓶三角瓶15150试管试管冰块冰块试管铝帽试管铝帽封膜封膜纱布盖纱布盖线绳线绳硫酸纸硫酸纸（四）仪器（四）仪器净化工作台净化工作台摇床机摇床机恒温水浴锅恒温水浴锅离心机离心机培养箱培养箱（二）细菌的转化（二）细菌的转化1.取大肠杆菌取大肠杆菌DH-5a新鲜感受态细胞新鲜感受态细胞100ml于于1.5mlE

33、ppendorf管中，加入管中，加入50100ng质粒质粒pUC18DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置置30min。2.42热休克热休克120s，不要摇动，不要摇动Eppendorf管。管。3.加入加入LB液体培养基液体培养基900ml，37保温保温60min。4.取取100ml转化液涂布在含氨苄青霉素转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp）100mg/ml的的LB固体平板上，固体平板上，37倒置倒置培培养养1624h。5观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。进一步提取质粒鉴定。实验步骤：实验步骤：（

34、以下均需无菌操作（以下均需无菌操作）（一）感受态细胞的制备（一）感受态细胞的制备*(二二)、共同转化与遗传图谱绘制、共同转化与遗传图谱绘制利用利用共同转化共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：原理：相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。转化的频率越高，反之越低。因此可能因此可能通过测定两基因共同转化的频率来通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。指示基因间的相对距离。图图7-27 通过共转化确定基因的排列顺序通过共转

35、化确定基因的排列顺序(引自引自Russell,1992)供体供体DNA 供体菌供体菌 p q o受体受体菌的转化菌的转化 转化的基因型转化的基因型 提取提取DNADNA断裂断裂或片段或片段 共转化共转化供体一条供体一条DNA片段上的两个基因同时转化的现片段上的两个基因同时转化的现象称为象称为共转化共转化。应用：应用：两个基因同时转化的效率（连锁或不连锁）两个基因同时转化的效率（连锁或不连锁）基因定位（遗传作图）（枯草杆菌）基因定位（遗传作图）（枯草杆菌）转化实验：转化实验：trp2+his2+tyr1+转化转化trp2-his2-tyr1-trp2+his2+tyr1+转化转化trp2-his

36、2-tyr1-实验实验 trp2 34 his2 13 tyr13660二、接合：二、接合：(一一)接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实(二二)F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为(三三)中断杂交试验作图中断杂交试验作图(一一)接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实1、Lederberg和和Tatum大肠杆菌杂交试验：大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌材料：大肠杆菌(Escherichia coli)K12菌株的两个营养菌株的两个营养缺陷型品系：缺陷型品系：A甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型和生物素缺陷型bio-；B苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型

37、和亮氨酸缺陷型leu-。方法：方法：将将A、B混和，在基本培养基混和，在基本培养基(固体固体)上涂布培养。上涂布培养。结果：结果：平板上长出平板上长出原养型菌落原养型菌落(+)。图7-29 塔特姆塔特姆（19091975）图图7-28 莱德伯格（莱德伯格（1925）图图7-302、几种可能解释及其分析、几种可能解释及其分析对上述试验结果原养型菌落可能产生于：对上述试验结果原养型菌落可能产生于：亲本细菌亲本细菌A或或B发生了发生了回复突变回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料两品系细胞通过培养基交换养料互养作用；互养作用；两品系间发生了两品系间发生了转化作用转化作用；发生细胞融合，形成了发生细胞

38、融合，形成了异核体或杂合二倍体异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：行的研究最终表明：这些解释均不成立这些解释均不成立。回复突变可能的排除回复突变可能的排除Lederberg和和Tatum采用的是双营养缺陷型菌株，采用的是双营养缺陷型菌株，已基本排除已基本排除A或或B品系发生回复突变产生原养型细品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。菌的可能。理论分析：理论分析：单基因回复突变的频率约为单基因回复突变的频率约为10-6；双基因回复突变的频率则为双基因回复突变的频率则为10-12，频率很低；，频率很低；但试验中产生原养型菌落产

39、生的频率非常高，因此基但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高，因此基本可以排除回复突变的可能。本可以排除回复突变的可能。对照实验对照实验：单独接种，未产生原养型菌落。单独接种，未产生原养型菌落。互养作用及其排除互养作用及其排除试验材料：试验材料：A品系：品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)B品系：品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)试验方法：试验方法：将将A、B品系混合接种在基本培养基表面；品系混合接种在基本培养基表面；短时间后喷短时间后喷T1杀死杀死A品系，使其不能持续产生；品系，使其不能持续产生；thr、leu供供B品系生长品系生长结果与

40、结论：结果与结论：仍然出现原养型菌落仍然出现原养型菌落互养并非前述原养型菌落出现的原因，而可能互养并非前述原养型菌落出现的原因，而可能发生了发生了遗传重组遗传重组转化作用及其排除转化作用及其排除Lederbery和和Tatum曾把品曾把品系系A的培养液经过滤后，加的培养液经过滤后，加入到入到B品系的培养物中，未品系的培养物中，未得到原养型菌落；表明原得到原养型菌落；表明原养型菌落可能养型菌落可能不是由转化不是由转化作用产生作用产生戴维斯戴维斯(Dawis,1950)的的U型管试验型管试验结果：没有得到原养型细菌结果：没有得到原养型细菌结论：细胞直接接触是原养结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的

41、必要条件型细菌产生的必要条件图图7-31异核体和杂合二倍体的可能性异核体和杂合二倍体的可能性出现原养型菌落的另一种可能是：出现原养型菌落的另一种可能是：细胞融合产生异核体或双杂合二倍体，类似二倍体生物细胞融合产生异核体或双杂合二倍体，类似二倍体生物的杂合体可产生原养型菌落；的杂合体可产生原养型菌落；异核体异核体指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核；两个或多个细胞核；双杂合二倍体双杂合二倍体则是异核体进一步发生核融合，形成二倍则是异核体进一步发生核融合，形成二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。体细胞核，核内含有两种遗传物质。但细菌为

42、单倍配子体生物，异核体和二倍体只能但细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂时存在，继续培养将发生分离；暂时存在，继续培养将发生分离；对试验中得到的原养型菌落后代研究表明：对试验中得到的原养型菌落后代研究表明：后代没有出现预期的性状分离现象。后代没有出现预期的性状分离现象。经过上述分析可以认为：经过上述分析可以认为：在在Lederbery和和Tatum及其它类似试验中，及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为称之为接合。接合。细菌的同宗配合细菌的同宗配合(homothallic)与与异宗配合异宗配合(heterothallic)-认为细

43、菌接合是一个彼此交换遗传物质认为细菌接合是一个彼此交换遗传物质的过程，即细菌的过程，即细菌同宗配合同宗配合。3、W.Hayes的实验（的实验（1952）链霉素处理链霉素处理A菌菌完全培养基培养一段时间完全培养基培养一段时间洗涤离心洗涤离心B菌菌重组体未减少重组体未减少基本培养基基本培养基链霉素处理链霉素处理B菌菌完全培养基培养一段时间完全培养基培养一段时间洗涤离心洗涤离心A菌菌无重组体产生无重组体产生基本培养基基本培养基该实验说明细菌接合过程中该实验说明细菌接合过程中遗传物质的转移是单遗传物质的转移是单向的向的，即遗传物质从，即遗传物质从A A株转移到了株转移到了B B株。株。Hayes(19

44、52)研究表明：研究表明：大肠杆菌两种不同菌株大肠杆菌两种不同菌株(品系品系)接合过程中接合过程中遗传物质的转移是遗传物质的转移是单向单向的（的（异宗配合异宗配合）；）；从而认为大肠杆菌存在两种类型品系：雌从而认为大肠杆菌存在两种类型品系：雌性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的性与雄性分别作为接合过程中遗传物质的受受体体与与供体供体。接合接合(conjugation)：遗传物质从供体遗传物质从供体(donor)(“雄性雄性”)转移转移到受体到受体(receptor)(“雌性雌性”)的重组过程。的重组过程。图图7-32细菌的接合细菌的接合(二二)F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为1、

45、F因子因子(细菌染色体外的一个决定细菌细菌染色体外的一个决定细菌雄性雄性性别的共价环状性别的共价环状DNA质粒质粒)：Hayes等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作供体的能力受细胞内一种供体的能力受细胞内一种致育因子致育因子(fertilityfactor,F因子因子;sexfactor,性因子性因子)控制。携带控制。携带F因子的菌株称因子的菌株称供体菌供体菌或或雄性雄性，用，用F+表示，没有表示，没有F因子的菌株称为因子的菌株称为雌性雌性，用，用F-表示。表示。A(strs)冰箱放置一年冰箱放置一年B(strs)A(strs)“”不育不育A(strr)“”

46、A(strs)诱变诱变B(strs)A(strr)可育可育F因子的发现因子的发现：F因子实际上是一种微小的质粒，一种封闭的因子实际上是一种微小的质粒，一种封闭的环状环状DNA，全长约，全长约94.5kb。F因子结构包含因子结构包含3个个区域：区域：复制起点或原点（复制起点或原点（O）：）：oriT和和oriV致育基因区：这些基因使它具有感染性，其中致育基因区：这些基因使它具有感染性，其中一些基因编码生成一些基因编码生成F纤毛的蛋白质。纤毛的蛋白质。配对区：这一区域有配对区：这一区域有4个插入序列个插入序列（insertionsequence,IS），），通过和宿主染色体上的通过和宿主染色体上的

47、IS同源重同源重组或转座，组或转座，F因子可以整合到宿主的不同位点。因子可以整合到宿主的不同位点。图图7-33F因子的结构因子的结构图图7-34F因子与细菌结构、生理差异因子与细菌结构、生理差异F因子可以在细菌细胞间进行转移并传递因子可以在细菌细胞间进行转移并传递遗传物质。遗传物质。没有没有F因子的细菌称为因子的细菌称为F，F细菌经吖啶橙处理细菌经吖啶橙处理而丢失，成为而丢失，成为F。F因子一经丢失，因子一经丢失，细胞中便不细胞中便不再出现；再出现；F可以和可以和F杂交，而不能和杂交，而不能和F杂交；杂交；FF的杂交后代皆为的杂交后代皆为F，而且可以，而且可以107频率频率获得重组体后代。获得

48、重组体后代。F因子的存在状态因子的存在状态以大肠杆菌为例，以大肠杆菌为例，F因子能够以自主状态存在因子能够以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上，以三种状于细胞质中或整合到细菌的染色体上，以三种状态存在：态存在：没有没有F因子，即因子，即F-；包含一个自由状态的包含一个自由状态的F因子，即因子，即F+；包含一个整合到自己染色体组内的包含一个整合到自己染色体组内的F因子，即因子，即Hfr(highfrequencyrecombination)(如如图图)。图图7-35F因子的存在状态因子的存在状态图图7-36F因子的存在状态因子的存在状态Hfr与与F+的异同：的异同：相同点：相同点：1、

49、和、和F-杂交产生重组后杂交产生重组后代；代；2、杂交是通过接合管、杂交是通过接合管和受体菌相连；和受体菌相连；3、用高剂量链霉素处、用高剂量链霉素处理不影响杂交。理不影响杂交。不同点：不同点：1、产生重组子的频率不、产生重组子的频率不同；同；2、F+F-的后代常为的后代常为F+，而，而HfrF-后代皆为后代皆为F-；3、经吖啶橙处理后，、经吖啶橙处理后，F+会变成会变成F-，Hfr仍为仍为Hfr。图图7-36 F7-36 F因子的存在方式因子的存在方式图图7-37自主状态时自主状态时F因子独立进行分裂因子独立进行分裂2、F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为当当F+细菌和细菌和F-细

50、菌接合时细菌接合时(F+F-)，F因子因子的新拷贝能在接合过程中转移到的新拷贝能在接合过程中转移到F-细胞中去，细胞中去，使使F-细胞转变成细胞转变成F+细胞，在接合管形成后，细胞，在接合管形成后，F+DNA双链之一被切断，从断端转移到双链之一被切断，从断端转移到F-细胞，在那里发生细胞，在那里发生DNA复制。当复制。当F因子复制因子复制完成后，完成后，F-变成变成F+(图图)。图图7-38F因子的杂交因子的杂交当当HfrF-接合时，接合时，F-细菌很少转变成细菌很少转变成Hfr，这是因，这是因为当为当Hfr与与F-接合时，整合的接合时，整合的FDNA从一端被内切从一端被内切酶切成单链切口，细