12基因诊断与基因治疗总结.ppt

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1、基因诊断基因诊断与基因治疗与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy主讲：李志红主讲：李志红第第 一一 节节 基基 因因 诊诊 断断Gene Diagnosis基因诊断基因诊断基因基因蛋白质蛋白质性状性状生化生化诊断诊断基因基因诊断诊断临床临床诊断诊断 特点特点1 1以基因做检查材料和检查目标，以基因做检查材料和检查目标，针对性强针对性强 2 2分子杂交选用特定基因序列作探针，故分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强特异性强 3 3分子杂交和分子杂交和PCRPCR具有放大效应，故具有放大效应，故灵敏度高灵敏度高 4 4适用性强适用性强，诊断范围广诊断范围广基因

2、诊断的概念和特点基因诊断的概念和特点定义定义利用利用现代分子生物学技术现代分子生物学技术，直接检测基因直接检测基因结构及其表达水平结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。诊断的方法。1、基因诊断的主要对象和样品来源、基因诊断的主要对象和样品来源主要是主要是DNA分子分子，涉及到功能分析时，还可，涉及到功能分析时，还可定量检测定量检测RNA（主要是（主要是mRNA）和蛋白质等）和蛋白质等分子。分子。临床上可用于基因诊断的样品有临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。等。对象

3、：对象：样品来源：样品来源：二、基因诊断技术二、基因诊断技术分类分类定性分析定性分析 定量分析定量分析 基因分型基因分型 检测基因突变检测基因突变 测定基因拷贝数测定基因拷贝数 测定基因表达产物量测定基因表达产物量 基本流程：基本流程：核酸抽提核酸抽提 目的序列的扩增目的序列的扩增分子杂交分子杂交信号检测信号检测基因诊断常用技术方法基因诊断常用技术方法（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链式反应（二）聚合酶链式反应 （三）基因测序（三）基因测序（四）基因芯片（四）基因芯片珠蛋白链基因第珠蛋白链基因第6位密码子发生突变位密码子发生突变 GAGGTG GluVale.g.e.g

4、.e.g.e.g.镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的GeneGeneGeneGene诊断诊断诊断诊断 限制性片断长度多态性分析限制性片断长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism,RFLP)：这种方法对于这种方法对于点突变点突变非常有效。由于基因突变，非常有效。由于基因突变，引起酶切部位的改变，导致限制性片断引起酶切部位的改变，导致限制性片断数目数目、每每个片断长度不同。个片断长度不同。（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术l已知限制已知限制酶Mst 1识别序列序列（CCTNAGG）l CCTGAGG l CCT

5、GTGGl突突变后不能后不能识别l酶切位点消失，限制切位点消失，限制酶切片段切片段长度度发生生变化化。Southern blot（二）（二）PCR技术技术 巢式巢式巢式巢式PCRPCRPCRPCR 多重多重多重多重PCRPCRPCRPCR RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR 实时实时实时实时PCRPCRPCRPCR 联合联合联合联合PCRPCRPCRPCR PCR-PCR-单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性 single strand conformation polymorphismsingle strand conformation polymorphi

6、sm(SSCP)(SSCP)分析分析分析分析PCR-SSCP是在是在PCR技术基础上发展起来的一种简单、技术基础上发展起来的一种简单、快速、经济的显示快速、经济的显示PCR反应产物中反应产物中点突变点突变的手段。的手段。原理：原理：PCR产物经变性后可以产生产物经变性后可以产生2条互补的单链，条互补的单链，不同不同的单链构象不同的单链构象不同，如果存在基因突变，如果存在基因突变，哪怕是只要有一个碱基哪怕是只要有一个碱基发生改变，单链的构象也发生变化发生改变，单链的构象也发生变化;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的DNA单链单链将在凝胶上显现出不同的

7、带型，从而确定野生型和突变型。将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。优点：优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。（三）（三）基因测序基因测序是最直接、最准确的基因诊断技术是最直接、最准确的基因诊断技术病例病例SOX9SOX9基因基因HMG boxHMG box内发生内发生单碱基置换突变单碱基置换突变R178L(GT)R178L(GT)，左侧正常，左侧正常对照第对照第225225位碱基为位碱基为C C，而该患儿为，而该患儿为A A（反义链中（反义链中）。）。三、基因诊断的应用三、基因诊断的应用 遗传疾病遗传疾病 肿瘤肿瘤 感染性疾病，

8、传染性流行病感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性 器官移植组织配型器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定疾病疾病致病基因致病基因突变类型突变类型诊断方法诊断方法地中海贫血地中海贫血珠蛋白珠蛋白缺失为主缺失为主Gap-PCR、DNA杂交、杂交、DHPLC地中海贫血地中海贫血珠蛋白珠蛋白点突变为主点突变为主反向点杂交、反向点杂交、DHPLC甲型血友病甲型血友病凝血因子凝血因子点突变为主点突变为主PCR-RFLP乙型血友病乙型血友病凝血因子凝血因子点突变、缺失等点突变、缺失等PCR-STR连锁分析连锁分析苯丙酮尿症苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶苯丙

9、氨酸羟化酶点突变点突变PCR-STR连锁分析、连锁分析、ASO分子分子杂交杂交 马凡综合症马凡综合症原纤蛋白原纤蛋白点突变、缺失点突变、缺失PCR-VNTR连锁分析、连锁分析、DHPLC我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断 基因检测的现状基因检测的现状l目前可以用基因目前可以用基因检测进行行检测的疾病数的疾病数1767种种，其中，其中1492种种检测应用于用于临床，床，275种种仅用于研究。用于研究。l美国美国早在早在1996年就开始了基因年就开始了基因检测，2004年接受年接受检测的人的人次数次数递增至增至400万，占人口比例万，占人口比例1.57，至

10、，至2007年已有年已有700多万人次。多万人次。l国内目前已国内目前已经开展的基因开展的基因检测项目包括目包括：l遗传病基因病基因检测数十种数十种，如，如遗传病的染色体病的染色体检测，地中海，地中海贫血基因血基因检测，G-6PD基因基因检测等；等；l易感基因型易感基因型检测400多种多种，如白，如白细胞抗原（胞抗原（HLA）分型）分型检测、多种癌症、糖尿病、冠心病、心肌梗死、多种癌症、糖尿病、冠心病、心肌梗死、动脉粥脉粥样硬硬化、高血化、高血压病、老年性痴呆等；病、老年性痴呆等；疾病易感基因检测适合于.l家族中有某种疾病的家族中有某种疾病的遗传病史者病史者。l某某类疾疾病病的的高高风险人人群

11、群，如如近近亲或或个个人人罹罹患患慢性疾病，或者常慢性疾病，或者常处于于污染染环境者。境者。l有有正确健康意正确健康意识者。者。第第 二二 节节 基基 因因 治治 疗疗Gene Therapy定义定义早期早期是指是指用用正常的基因正常的基因整合入细胞基因组，整合入细胞基因组，以以校正和置换校正和置换致病基因致病基因的一种治疗方法。的一种治疗方法。目前目前广义上来讲是指将广义上来讲是指将某种遗传物质某种遗传物质转转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病的目的。达到治疗疾病的目的。一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念 20世纪世纪60年代年代 Ed

12、ward Tatum提出基因水平上纠正缺陷基提出基因水平上纠正缺陷基因的设想。因的设想。以病毒为截体，体细胞为靶细胞的技术路线以病毒为截体，体细胞为靶细胞的技术路线，从根，从根本上解决遗传病的治疗问题。本上解决遗传病的治疗问题。1966年年 美国国立实验室的美国国立实验室的Rogers发现，接触发现，接触兔乳头状病毒兔乳头状病毒的实验工作人员中相当部分的血精氨酸降低。推测病毒核酸进的实验工作人员中相当部分的血精氨酸降低。推测病毒核酸进入细胞使入细胞使精氨酸酶活性升高精氨酸酶活性升高。1973年年 Rogers用用shope兔乳头状瘤病毒感染一个患有精氨兔乳头状瘤病毒感染一个患有精氨酸血症女孩的

13、皮肤成纤维细胞，使酸血症女孩的皮肤成纤维细胞，使细胞精氨酸酶活性上升细胞精氨酸酶活性上升，且，且可持续可持续7个月。个月。1990年年11月，美国月，美国NIH的的Blease,Culver和和Anderson进行进行了了首例人体基因治疗临床试验首例人体基因治疗临床试验。患。患ADA缺失症的缺失症的4岁小女孩，岁小女孩，利用反转录病毒将利用反转录病毒将ADA基因转移到基因转移到T淋巴细胞淋巴细胞中，再回输。患中，再回输。患者免疫力明显提高，取得了巨大成功。者免疫力明显提高，取得了巨大成功。二、基因治二、基因治疗历史史基因治疗的三要素：基因治疗的三要素：(NIH提出）提出）合适的目的基因合适的目

14、的基因 发病机制在发病机制在DNA水平上已经清楚水平上已经清楚 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 合适的基因转移方式合适的基因转移方式 合适的基因表达与调控合适的基因表达与调控三、基因治疗的基本策略三、基因治疗的基本策略（一）缺陷基因精确的原位修复（一）缺陷基因精确的原位修复基因矫正基因矫正gene correction基因置换基因置换gene replacement致病基因的突变碱基进行纠正致病基因的突变碱基进行纠正用用正常基因通过重组原位替换致病基因正常基因通过重组原位替换致病基因这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，这两种

15、方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。目的，是最为理想的治疗方法。（二）基因增补（二）基因增补不不删删除除突突变变的的致致病病基基因因，而而在在基基因因组组的的某某一一位位点点额额外外插插入入正正常常基基因因，在在体体内内表表达达出出功功能能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这这种种对对基基因因进进行行异异位位替替代代的的方方法法称称为为基基因因添添加加（gene augmentation）或或称称基基因因增增补补，是是目前临床上使用的主要基因治疗策

16、略目前临床上使用的主要基因治疗策略。（三）基因沉默或失活（三）基因沉默或失活 有有些些疾疾病病是是由由于于某某一一或或某某些些基基因因的的过过度度表表达达引引起起的的，向向患患者者体体内内导导入入有有抑抑制制基基因因表表达达作作用用的的核核酸酸，如如反反义义RNA、核核酶酶、干干扰扰小小RNA等等，可可降降解解相相应应的的mRNA或或抑抑制制其其翻翻译译，阻阻断断致致病病基基因因的的异异常常表表达达，从从而而达达到到治治疗疗疾疾病病的的目目的的。这这一一策策略略称称为为基基因因失失活活（gene inactivation）或或基因沉默基因沉默（gene silencing）。）。反义反义RNA

17、 定义：定义：与与mRNA或其它或其它RNA互补的互补的RNA分子分子。由于核糖体不能翻译双链的由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义，所以反义RNA与与mRNA特异性的互补结合即特异性的互补结合即抑制了该抑制了该mRNA的翻译的翻译，是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中也存在反义也存在反义RNA。特点特点（l l）安安全全性性高高，专专一一性性强强，效效率率高高。反反义义RNARNA只只作作用用于于特特异异的的mRNAmRNA分分子子，不不改改变变所所调调节节基基因因的的结结构构。反反义义RNARNA分分子子无无论论怎怎样样修修饰饰，

18、最最终终将将在在细细胞胞内内部部被被降降解解，不留不留“残渣残渣”（2 2）设计和制备方便）设计和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）在在治治疗疗RNARNA病病毒毒感感染染性性疾疾病病时时有有更更大大的的优优势势。能直接作用于一些能直接作用于一些RNARNA病毒，病毒，阻断阻断RNARNA病毒的繁殖病毒的繁殖（四）（四）自杀基因治疗自杀基因治疗 将将“自杀基因自杀基因”导入宿主细胞中，这种导入宿主细胞中，这种基因编码的酶基因编码的酶能能使无毒使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生，诱导靶细胞产生“自杀效自杀效应应”

19、，从而清除肿瘤细胞。，从而清除肿瘤细胞。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。自杀基因的自杀基因的旁观者效应旁观者效应 “自杀基因自杀基因”治疗不仅使转导了治疗不仅使转导了“自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转与其相邻的未转导导“自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死的肿瘤细胞也被杀死。（五）（五）基因免疫治疗基因免疫治疗(基因疫苗基因疫苗)定义定义通过将抗癌通过将抗癌免疫增强细胞因子（免疫增强细胞因子（TNF,TNF,干扰素，干扰素，IL-2)IL-2)或或MHCMHC基因基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的

20、抗导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。癌免疫反应。三、基因治疗的基本程序三、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的选择基因载体的选择靶细胞的选择靶细胞的选择基因转移基因转移外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因利用在体中的标记基因回输体内回输体内病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法（一）选择治疗基因（一）选择治疗基因许许多多分分泌泌性性蛋蛋白白质质如如生生长长因因子子、多多肽肽类类激激素素、细细胞胞因因子子、可可溶溶性性受受体体（人人工工构构建建的的去去除除膜膜结结

21、合合特特征征的的受受体体），以以及及非非分分泌泌性性蛋蛋白白质质如如受受体体、酶酶、转转录录因因子子的的正正常常基基因因都都可可作为治疗基因。作为治疗基因。简简言言之之，只只要要清清楚楚引引起起某某种种疾疾病病的的突突变变基基因因是是什什么么，就就可可用用其其对对应应的的正正常常基基因因或或经经改造的基因作为治疗基因。改造的基因作为治疗基因。（二）基因载体的选择（二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。转移入患者体内、并能调控其适度表达。病毒载体：病毒载体：逆转录病毒逆转录病毒(RV)(RV)、腺病毒腺

22、病毒(AV)(AV)、腺腺相关的病毒相关的病毒(AAV)AAV)等。等。非病毒载体：非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要这类载体的发展较快，目前主要是是脂质体脂质体。（三）靶细胞的选择（三）靶细胞的选择-分为生殖细胞和体细胞两大类分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应用体细现阶段只限于应用体细胞胞靶细胞选择的原则靶细胞选择的原则:l1.1.易操作易操作;l2.2.易培养易培养;l3.3.易接受外源基因易接受外源基因;l4.4.在体内能持久高效表达在体内能持久高效表达 目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细

23、胞等上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞等（四）基因转移方法（四）基因转移方法化学方法化学方法磷酸钙沉淀法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法葡聚糖法物理方法物理方法电穿孔法、粒子轰击法（基因枪）电穿孔法、粒子轰击法（基因枪）病毒法病毒法主要通过携带有外源基因的病毒载体感染主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。靶细胞来实现基因的转移。膜融合法膜融合法细胞融合法、脂质体介导法、原生质体细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、微细胞核介导法等融合法、微细胞核介导法等 l间接体内接体内疗法法l目的基因目的基因转移到移到体外培养的靶体外培养的靶细胞内胞内高效表达，高效表达，然后将靶

24、然后将靶细胞胞回回输体内体内l直接体内直接体内疗法法l将目的基因在将目的基因在体内体内直接直接转移到靶移到靶细胞胞l载体：需要有体：需要有特异特异导向性和高向性和高转移效率移效率将治疗基因导入人体将治疗基因导入人体载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞（五）治疗基因表达的检测（五）治疗基因表达的检测 无无论论以以何何种种方方法法导导入入基基因因，都都需需要要检检测测这这些些基基因因是是否否能能被被正正确确表表达达。被被导导入入基基因因的的表表达达状状态态可可以以用用PCR、RNA印印迹迹、蛋蛋白白印印迹迹及及ELISA等等方方法法去去检检测测。对对于于导导入入基基因因是是否

25、否整整合合到到基基因因组组以以及及整整合合的的部部位位，可以用可以用DNA印迹技术印迹技术进行分析。进行分析。（六）回输体内（六）回输体内方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；织；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞；或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA,A

26、denosine Deaminase)缺乏的缺乏的严重联合免疫缺陷严重联合免疫缺陷(SCID,severe combined immunodeficiency syndrome)l病因病因l淋巴淋巴细胞缺乏胞缺乏ADA酶 腺苷、腺苷、dATP堆堆积 破坏免疫功能破坏免疫功能 患儿很少活到成年患儿很少活到成年(bubble-baby syndrome;very low T cell counts)治疗基本步骤治疗基本步骤:ADA基因基因+逆逆转录病毒病毒载体体导入患者入患者淋巴淋巴细胞胞体外体外扩增增回回输病人体内病人体内淋巴淋巴细胞胞ADA酶恢复至正常水平的恢复至正常水平的5%-10%维持免疫

27、系持免疫系统功能功能,改善病人症状改善病人症状基因治疗成功范例基因治疗成功范例l ADA缺乏症基因治缺乏症基因治疗 l1990年年9月月,一位四一位四岁的的ADA缺乏症女孩接受缺乏症女孩接受了首例基因治了首例基因治疗l患者注入患者注入10亿个个遗传修修饰的的T淋巴淋巴细胞胞,约每月每月1次次,连续1年年,ADA水平从水平从1%上升到上升到20%,淋淋巴巴细胞数量正常胞数量正常,免疫功能正常免疫功能正常l 1991年年,另一位另一位9岁患者基因治患者基因治疗也取得成功也取得成功,他他们从隔离病房走向了美好生活从隔离病房走向了美好生活.四、基因治疗的应用与展望四、基因治疗的应用与展望应用应用展望展

28、望遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病感染性疾病、神经系统疾病进一步寻找切实有效的基因进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响减少外源基因对机体的不利影响基因治疗展望基因治疗展望l 展望展望21世纪世纪,各种遗传病各种遗传病,肿瘤外肿瘤外,传染病，神传染病，神经系统经系统,心血管系统和各种常见疾病均可以获得治心血管系统和各种常见疾病均可以获得治疗疗.基因治疗象吃药和打针一样方便基因治疗象吃药和打针一样方便;按照人和疾按照人和疾病治疗的需要定量表达或关闭基因病治疗的需要定量表达或关闭基因.基因治疗可以让人类告别传染病基因治疗可以让人类告别传染病,肿瘤肿瘤,使人使人长得更高长得更高,寿命更长寿命更长,使人更聪明，更漂亮，使人看使人更聪明，更漂亮，使人看得更远，听得更清楚得更远，听得更清楚,生活更加美好生活更加美好.关于考试关于考试l时间，地点：，地点：l见课程网站通知程网站通知l考考试方式：方式：l闭卷卷l授授课ppt，复，复习题：l见课程网站程网站成绩评定成绩评定l平平时成成绩l网上作网上作业（3次）次）+平平时点名点名l占占40%l课程考程考试成成绩l占占60%谢谢！