流式细胞术实验方法及应用精选课件.ppt

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1、关于流式细胞术实验关于流式细胞术实验方法及应用方法及应用第一页，本课件共有77页 科研型科研型 分选功能分选功能488nm488nm激光激光 四色荧光四色荧光(525(525、575575、610610、675nm675nm）第二页，本课件共有77页 一、流式细胞术的原理 流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发流动室，在激光照射区域，携

2、带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。的生物特性。第三页，本课件共有77页前向散射激光第四页，本课件共有77页FCMFCM的液流系统（如何的液流系统（如何形成单个细胞流）形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管第五页，本课件共有77页 近近3030年来流式细胞术在我国得到很年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、

3、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。医学研究领域。第六页，本课件共有77页速度快速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。细胞，甚至几万个细胞。多参数分析多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。细胞群分为各亚群。二、流式细胞术的特点、优点第七页，本课件共有77页定性、定量分析细胞定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些

4、成分，如：通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNADNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。抗原或受体等进行定性、定量分析。灵敏度高灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于60010S10、G2/M15G2/M15或或S20S20、G2/M5G2/M5第四十一页，本课件共有77页白细胞分化抗原（白细胞分化抗原（CDCD分子）的命名：分子）的命名：19821982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为分为2525群，把每一群抗体称

5、为一个群，把每一群抗体称为一个分化抗体群分化抗体群(Cluster of Differentiation(Cluster of Differentiation，CD)CD)，进行编号、，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CDCD抗体群抗体群识别的分化抗原就称为识别的分化抗原就称为CDCD分子分子。目前已有。目前已有339339个分化抗个分化抗体群被鉴定并命名体群被鉴定并命名2、淋巴细胞亚群分析第四十二页，本课件共有77页 流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细类计数淋巴细胞亚群

6、，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志，主要分为及膜表面标志，主要分为T T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)(CD3+)、B B淋淋巴细胞巴细胞(CD19+)(CD19+)、NKNK细胞细胞(CD16+56+/CD3-)(CD16+56+/CD3-)三个亚三个亚群。群。第四十三页，本课件共有77页CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞淋巴细胞 B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+）NK细胞细胞（CD16+56）

7、+第四十四页，本课件共有77页NKNK细胞细胞:CD(16+56)CD(16+56)+/CD3/CD3-B B淋巴细胞淋巴细胞:CD19CD19+/CD3/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-第四十五页，本课件共有77页 50ul+10ul50ul+10ul相应抗体相应抗体 避光孵育避光孵育15min 15min 加加OptiLyes COptiLyes C溶血素溶血素250ul 250ul 室温室温10min 10min PBS PBS洗一次洗一次 上机分析上机分析抗体抗体:CD4-FITC/CD8-P

8、E/CD3-PE-CY5CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体三标抗体CD19-PE/CD3-FITCCD19-PE/CD3-FITC二标抗体二标抗体CD16+56-PE/CD3-FITCCD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体二标抗体IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照同型对照外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）第四十六页，本课件共有77页淋巴细胞亚群检测临床淋巴细胞亚群检测临床意义：意义：CD3CD3+、CD4CD4+、CD8CD8+总数降低总数降低：细胞免疫功能低下细胞免疫功能低下

9、CD4CD4+（CD4CD4+/CD8/CD8+）降低或）降低或CD8CD8+(CD8+/CD4(CD8+/CD4+)升高：升高：AIDSAIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等障碍性贫血等 CD4CD4+(CD4(CD4+/CD8/CD8+)升高或升高或CD8CD8+(CD8(CD8+/CD4/CD4+)降低降低：自身：自身 免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血 CD3CD3+CD4CD4+CD8CD8+T T细胞减少细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发

10、育不良、严重免疫缺陷病。腺发育不良、严重免疫缺陷病。第四十七页，本课件共有77页 NK CD(16+56)NK CD(16+56)+活性低下：活性低下：肿瘤、白血病、自身免肿瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等疫病、免疫缺陷病等 NK+CD(16+56)NK+CD(16+56)+活性增高：活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（移植感染、感染性疾病（B B病毒、疱疹病毒、肺病毒、疱疹病毒、肺TBTB）、习惯性流产等）、习惯性流产等 CD19CD19+B B细胞减少：细胞减少：体液免疫抑制体液免疫抑制 CD19CD19+B B细胞增高细胞增高：B B细胞恶性增殖性疾病（白血病）

11、细胞恶性增殖性疾病（白血病）第四十八页，本课件共有77页 FCMFCM作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、抗原表达的特异性进行分型：髓系、B B淋巴系、淋巴系、T T淋淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆（髓系（髓系-MPOMPO，B B淋巴系淋巴系-CD79a,T-CD79a,T淋巴系淋巴系-cyCD3-cyCD3

12、）,胞膜胞膜(髓系髓系-CD13-CD13、CD117CD117，B B淋巴系淋巴系-CD19-CD19、CD10,TCD10,T淋巴系淋巴系-CD3-CD3、CD2)CD2)等等3、白血病免疫分型第四十九页，本课件共有77页 采用采用CD45CD45和侧向散射和侧向散射(SSC(SSC）设门技术可将各）设门技术可将各细胞群分开，荧光从强细胞群分开，荧光从强大到弱：大到弱：淋巴细胞群淋巴细胞群 单核细胞单核细胞 成熟粒细胞成熟粒细胞 原原/幼细胞幼细胞(白血病细胞白血病细胞)，而成，而成熟的红细胞和血熟的红细胞和血小板小板不表达。不表达。第五十页，本课件共有77页正常骨髓流式细胞分布图第五十一

13、页，本课件共有77页各系表达的抗原各系表达的抗原造血干细胞：造血干细胞：CD34CD34、CD33CD33髓系表达髓系表达 ：CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33巨核细胞巨核细胞 ：CD61CD61、CD41CD41B B细胞系：细胞系：CD10 CD10、CD19CD19、CD20CD20T T细胞系：细胞系：CD2CD2、CD3CD3、CD5CD5、CD7CD7NKNK细胞细胞:CD16:CD16、CD56CD56、CD57CD57第五十二页，本课件共有77页 细胞因子（细胞因子（CKCK）主要由免疫细胞产生，也主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等可

14、由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种产生。一种细胞可产生多种CKCK，一种，一种CKCK也可也可由多种细胞产生。细胞因子分为由多种细胞产生。细胞因子分为4 4类：白细类：白细胞介素（胞介素（lLlL）；干扰素（）；干扰素（IFNIFN）；造血生长因）；造血生长因子；肿瘤坏死因子（子；肿瘤坏死因子（TNFTNF）。）。4、细胞因子的检测第五十三页，本课件共有77页血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加并不断分泌到细胞外而发挥作用。因

15、此，要测定细胞并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困难。通常应用内的细胞因子较为困难。通常应用刺激剂刺激剂（如：佛波脂）（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌来刺激细胞因子分泌 ，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌泌抑制剂抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。各种细胞内合成的细胞因子。第五十四页

16、，本课件共有77页第五十五页，本课件共有77页全血或单细胞全血或单细胞+刺激素刺激素(佛波脂佛波脂)和阻断剂和阻断剂(莫能霉素莫能霉素)3737培养培养4-6h 4-6h 加入细胞加入细胞表面抗体表面抗体(如如CD3CD3、CD4/CD8)CD4/CD8)孵育孵育20-20-30min PBS30min PBS洗洗1 1次次 加固定破膜剂加固定破膜剂 室室温温15min 15min 加入加入IFN-rIFN-r和和IL-4IL-4抗体抗体 孵育孵育30min PBS30min PBS洗两次洗两次 FCMFCM。细胞因子检测（IFN-r IFN-r，IL-4IL-4）：第五十六页，本课件共有77

17、页结果分析：结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（运用流式设门技术，先利用前向散射（FSFS）和侧向）和侧向散射（散射（SSSS）圈出淋巴细胞，再用）圈出淋巴细胞，再用CD3+CD3+和和SSCSSC设门圈出设门圈出T T淋巴细胞，淋巴细胞，再用再用CD8-/CD3+CD8-/CD3+设门选定设门选定T T淋巴细胞亚群，再分析淋巴细胞亚群，再分析IL-4+IL-4+和和CD4+/IFN-rCD4+/IFN-r淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4第五十七页，本课件共有77页 检测检测 Fluo-3/AmFluo-3/Am是高特异性是

18、高特异性CaCa2+2+荧光指示剂，能与荧光指示剂，能与CaCa2+2+特异结特异结合。合。Fluo-3Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性AMAM（乙酰氧甲基）乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内，酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去酯酶的作用下，脱去AMAM重新生成亲水性形式，一方面不能再进重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离过检测其荧光强度可反映出细胞内游离C

19、aCa2+2+浓度的变化。浓度的变化。单细胞悬液单细胞悬液+flour-3/AM 37+flour-3/AM 37C C避光孵育避光孵育40min 40min PBS PBS洗洗1 1次次 上机检测上机检测 5、细胞内Ca2+浓度Ca2+2+超载是细胞损伤的重要标志，导致超载是细胞损伤的重要标志，导致DNADNA降解，促使降解，促使细胞凋亡。细胞凋亡。第五十八页，本课件共有77页6、线粒体膜电位 线粒体膜电位（线粒体膜电位（MMPMMP）是线粒体功能的重要）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，接反映线

20、粒体功能及数量，MMPMMP下降，其氧化磷下降，其氧化磷酸化功能障碍，使酸化功能障碍，使ATPATP产生减少，导致细胞凋产生减少，导致细胞凋亡和坏死。亡和坏死。第五十九页，本课件共有77页Rhodamine123Rhodamine123（罗丹明（罗丹明123123）、）、DiOC6DiOC6、JC-1JC-1等多种等多种亲脂性的阳离子亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测测 MMPMMP的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒

21、体内膜的线粒体内膜的内侧带内侧带负电荷负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。线粒体膜电位成正比。MMP检测原理及方法：第六十页，本课件共有77页 当当MMPMMP降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和线粒体数量和MMPMMP的降低或丧失。的降低或丧失。操作：操作：单细胞悬液（单细胞悬液（1*10 1*10

22、 6 6 ）+1umol/L+1umol/L的的Rh123 Rh123 37 37 C,30minC,30min PBS PBS洗两次洗两次 上机检测上机检测 第六十一页，本课件共有77页 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病

23、的目的。从而达到防病、治病的目的。7、FCM检测细胞凋亡第六十二页，本课件共有77页 半胱氨酸蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶（CaspaseCaspase）以无活性的酶原形）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的段。活化的CaspaseCaspase进一步激活其他的进一步激活其他的CaspaseCaspase前体，前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现解体的蛋白酶系统，目前已发现1515个个CaspaseCaspase家家族成员，分别命名为族成

24、员，分别命名为Caspase1-15Caspase1-15。在。在CaspaseCaspase家家族成员中，族成员中，Caspase-3Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。是最重要的指示蛋白酶。（1）Caspase家族第六十三页，本课件共有77页操作：操作：单细胞悬液（单细胞悬液（1*10 1*10 6 6）固定和破膜剂固定和破膜剂 冰浴冰浴20min Perm/Wash Buffer20min Perm/Wash Buffer洗两次洗两次 20ul20ul单抗单抗 室温孵育室温孵育30min 30min Perm/Wash BufferPerm/Wash Buffer洗洗1 1次次 加加

25、0.5ml 0.5ml Perm/Wash Buffer Perm/Wash Buffer 上机检测上机检测。第六十四页，本课件共有77页细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有基因。主要有bcl-2bcl-2家族、家族、P53P53、cedced基因家族基因家族等。等。抗凋亡基因抗凋亡基因:bcl-2:bcl-2、bcl-XLbcl-XL、BadBad 等 促凋亡基因促凋亡基因:bax:bax、bakbak、bcl-XSbcl-XS等等 染色标记同Caspase

26、Caspase（2）凋亡相关基因蛋白第六十五页，本课件共有77页 FasFas又称又称APO-1APO-1，即，即CD95CD95分子，是细胞膜上的跨膜分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。Fas/FasLFas/FasL是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子组织发育和体内平衡的重要分子,Fas/FasL,Fas/FasL结合结合,可向可向细胞传递死亡信号细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。引起细胞凋亡。检测：同表面标记检测：同表面标记（3）Fas/FasL

27、第六十六页，本课件共有77页被认为比较成熟的方法：被认为比较成熟的方法：（4）凋亡率检测PIPI单染色法单染色法Annexin VAnnexin VPIPI双染法。双染法。TUNELTUNEL法法第六十七页，本课件共有77页碘化丙啶（碘化丙啶（PIPI）单染法）单染法（DNADNA周期分析）周期分析）：由于凋亡细胞由于凋亡细胞DNADNA被降解，小分子被降解，小分子DNADNA可通可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分带走部分DNADNA，造成凋亡细胞，造成凋亡细胞DNADNA含量减少，与含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在荧光染料结

28、合减少，荧光强度减弱，在DNADNA直方直方图上显示在图上显示在G0/G1G0/G1峰前出现一个峰前出现一个DNADNA含量减少的含量减少的亚亚二倍体峰二倍体峰，称凋亡细胞峰。，称凋亡细胞峰。第六十八页，本课件共有77页第六十九页，本课件共有77页第七十页，本课件共有77页Annexin VAnnexin VPIPI双染法：双染法：在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PSPS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期

29、凋亡的重要生化特征，构成早期凋亡的重要生化特征，PSPS被特异的被特异的Annexin Annexin V-FITCV-FITC探针所标记，而探针所标记，而PIPI对细活细胞和早期凋亡细对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故胞是拒染的，故Annexin V-FITC/PIAnnexin V-FITC/PI双染法能区分活双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。第七十一页，本课件共有77页机械损伤细胞：机械损伤细胞：Annexin V-/PI+Annexin V-/PI+晚期凋亡、坏死细晚期凋亡、坏死细胞：胞：Annexin V Annexin V+/PI+/PI+

30、早期凋亡细胞：早期凋亡细胞：Annexin V+/PI-Annexin V+/PI-活细胞：活细胞：Annexin V-/PI-Annexin V-/PI-第七十二页，本课件共有77页第七十三页，本课件共有77页TUNELTUNEL法：法：细胞凋亡时，双链细胞凋亡时，双链DNADNA会出现断裂点，即产生一会出现断裂点，即产生一系列系列3 3 端。在脱氧核糖核酸转移酶端。在脱氧核糖核酸转移酶(TdT)(TdT)催化的反催化的反应下，能将荧光素应下，能将荧光素-脱氧尿苷三磷酸脱氧尿苷三磷酸(dUTP)(dUTP)标记标记到断裂的到断裂的DNADNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。末端，从而使凋亡的

31、细胞具有荧光。第七十四页，本课件共有77页第七十五页，本课件共有77页HLA-B27HLA-B27淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群（CD3CD3、CD4CD4、CD8CD8、CD16+56CD16+56、CD19CD19）白血病免疫分型（白血病免疫分型（CD2CD2、CD3CD3、CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33、CD34CD34、CD117CD117、CD79aCD79a、cCD3cCD3、MPOMPO等）等）阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（CD55CD55、CD59CD59）血小板活化指标（血小板活化指标（CD62PCD62P、CD63CD63）细胞周期分析细胞周期分析FCM的临床检测项目第七十六页，本课件共有77页感感谢谢大大家家观观看看第七十七页，本课件共有77页