自然选育和诱变育种精选课件.ppt

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1、关于自然选育和诱变育种第一页，本课件共有65页第四章自然选育和诱变育种第二页，本课件共有65页菌种菌种选育选育经验经验育种育种定向定向育种育种自然自然选育选育诱变诱变育种育种杂交杂交育种育种分子分子育种育种主要通过突主要通过突变和筛选来变和筛选来育种育种常规的杂常规的杂交育种交育种原生质原生质体融合体融合通过通过DNADNA重重组技术来组技术来育种育种第三页，本课件共有65页第一节第一节自然选育自然选育自自然然选选育育：不不经经人人工工处处理理，利利用用微微生生物物的自然突变进行菌种选育的过程的自然突变进行菌种选育的过程一、引起自然选育的因素一、引起自然选育的因素1、低剂量的诱变效应、低剂量的

2、诱变效应2、互变异构效应、互变异构效应第四页，本课件共有65页基因突变基因突变第五页，本课件共有65页二、微生物突变的类型二、微生物突变的类型1、形态突变型2、致死突变型3、抗性突变型4、营养缺陷型突变型 青霉青霉青霉青霉第六页，本课件共有65页三、微生物突变的特点三、微生物突变的特点1 1、不对应性不对应性2 2、自发性自发性3 3、稀有性稀有性4 4、独立性独立性5 5、诱变性诱变性6 6、稳定性稳定性7 7、可逆性可逆性 第七页，本课件共有65页稀释法稀释法（四）、自然选育的程序1.采样2.增殖培养3.纯种分离4.生产性能的测定 划线法划线法第八页，本课件共有65页第二节、第二节、诱变育

3、种诱变育种一一概念：概念：诱诱变变育育种种是是利利用用各各种种诱诱变变剂剂处处理理微微生生物物细细胞胞，提提高高基基因因突突变变频频率率，再再通通过过适适当当的的筛筛选选方方法法获得高产优质菌种的育种方法。获得高产优质菌种的育种方法。第九页，本课件共有65页二二诱变育种的原理诱变育种的原理基基因因突突变变:染染色色体体畸畸变变和和点突变。点突变。染染色色体体畸畸变变：指指的的是是染染色色体体或或DNA片片段段发发生生缺缺失失、易易位位、逆逆位、重复等。位、重复等。点突变：指的是点突变：指的是DNA中的碱基发中的碱基发生变化。生变化。第十页，本课件共有65页三、常用的诱变剂种类三、常用的诱变剂种

4、类1 1、物理诱变剂：紫外线、快中子、物理诱变剂：紫外线、快中子 2 2、化学诱变剂：、化学诱变剂：5 5BUBU（5-5-溴尿嘧啶）溴尿嘧啶）硫酸二乙酯，亚硝基胍硫酸二乙酯，亚硝基胍3 3、生物诱变剂：噬菌体、生物诱变剂：噬菌体第十一页，本课件共有65页3、使用方法：单一诱变剂处理:复合诱变剂处理：第十二页，本课件共有65页诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。第十三页，本课件共有65页 四四、常用诱变、常用诱变剂的具体使用方剂的具体使用方法：法：1 1、紫外线：紫外线：第十四页，本课件共有65页A A、诱诱变变处处理

5、理前前，先先开开紫紫外外灯灯预预热热2020分分钟钟，使光波稳定。使光波稳定。B B、将将3 35ml5ml细细胞胞悬悬浮浮液液置置于于培培养养皿皿,于于诱诱变变箱箱内内的的电电磁磁搅搅拌拌器器上上，照照射射3 35 5分分钟，进行表面杀菌。钟，进行表面杀菌。C C、打打开开培培养养皿皿盖盖，开开启启电电磁磁搅搅拌拌器器，边边照射边搅拌。照射边搅拌。D、处理一定时间后，在红外灯下，吸取一定量菌液，经稀释后，取0.2毫升涂平板。第十五页，本课件共有65页2.5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶：A、称称取取5-溴溴尿尿嘧嘧啶啶，加加入入无无菌菌生生理理盐盐水水微热溶解，使浓度为微热溶解，使浓度为2mg/ml。B

6、、将将细细胞胞培培养养至至对对数数期期并并重重悬悬于于缓缓冲冲液液或生理盐水中过夜。或生理盐水中过夜。C、将将5-溴溴尿尿嘧嘧啶啶加加入入培培养养基基内内，一一般般为为1020微克微克/ml，倒平板。，倒平板。D、涂涂布布菌菌液液，在在生生长长中中诱诱变变，挑挑单单菌菌落落进行测定。进行测定。第十六页，本课件共有65页五、诱变育种的一般程序第十七页，本课件共有65页出发菌株出发菌株菌种纯化菌种纯化同步培养同步培养制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液诱变剂处理诱变剂处理平板分离平板分离挑选疑似突变菌落纯培养挑选疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选突变体的初步筛选重复筛选重复筛选选出突变体选出突变体第十

7、八页，本课件共有65页1、同步培养、同步培养诱诱变变处处理理前前，菌菌悬悬液液的的细细胞胞应应尽尽可可能能达达到到同同步步生生长长状状态态，培培养养出出生理活性一致的细胞。生理活性一致的细胞。同步生长细胞的培养就及其收集第十九页，本课件共有65页第二十页，本课件共有65页2.孢子或菌体悬浮液的制备孢子或菌体悬浮液的制备用用生生理理盐盐水水或或缓缓冲冲溶溶液液配配制制，先先用用无无菌菌的的玻玻璃珠振荡分开，再用脱脂棉过滤。璃珠振荡分开，再用脱脂棉过滤。第二十一页，本课件共有65页3变异菌株的初步筛选变异菌株的初步筛选1）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。2）利

8、用平皿反应直接挑取高产变异菌株。）利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。第二十二页，本课件共有65页饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固体培指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液如淀粉的平皿上喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性差、固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的利用一些有特别营养要求的微生物作为工

9、具菌，如待筛微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转选菌具有该营养物的前体转化成营养物化成营养物 能力，工具菌能力，工具菌就能围绕该菌生长就能围绕该菌生长 待筛选的菌株能分待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制泌产生某些能抑制工具菌生长的物质工具菌生长的物质 第二十三页，本课件共有65页第第三三节节营营养养缺缺陷陷型型突突变变体体的的筛筛选选及及应用应用一一、营营养养缺缺陷陷型型：指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的丧丧失失了了合合成成某某种种营营养养物物质质的的能能力力，必必须须在在基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应缺缺陷陷的的物物质质才才能能正正常常生生长的变异菌株。长的变异菌株。

10、第二十四页，本课件共有65页二、筛选营养缺陷型的培养基二、筛选营养缺陷型的培养基：基基本本培培养养基基-:凡凡是是能能满满足足某某种种野野生生菌菌株株营养要求最低成分的合成培养基。营养要求最低成分的合成培养基。完完全全培培养养基基:凡凡能能满满足足一一切切营营养养缺缺陷陷株株营营养养需要的培养基需要的培养基+。第二十五页，本课件共有65页补补充充培培养养基基A：只只能能满满足足相相应应的的营营养养缺缺陷型生长需要的组合培养基。陷型生长需要的组合培养基。第二十六页，本课件共有65页三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法1.诱变处理诱变处理2.淘汰野生型淘汰野生型第二十七

11、页，本课件共有65页A、抗菌素法:将抗生素加入到基本培养基中，杀死生长野生型菌株，浓缩营养缺陷型。用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因为在基本培养基中不能繁殖而得以保留。第二十八页，本课件共有65页酵母菌：用加有制霉菌素基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，制霉菌素抑制真菌细胞壁中甾醇合成，从而使繁殖中的细胞产生的子细胞死亡，保留营养缺陷型细胞。第二十九页，本课件共有65页B、菌丝过滤法、菌丝过滤法:诱诱变变后后的的孢孢子子在在中中培培养养一一段段时时间间后后过过滤滤，去除大部分野生型菌株，浓缩营

12、养缺陷型去除大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型 。Sartorius正压式过滤器正压式过滤器 真菌和放线菌等真菌和放线菌等真菌和放线菌等真菌和放线菌等丝状菌丝状菌丝状菌丝状菌的野生型菌株在的野生型菌株在基本基本培养基培养基中产生中产生菌丝体菌丝体，而营养缺陷型菌株以，而营养缺陷型菌株以孢子孢子形式存在，不能萌发。把诱变处理后形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，用用灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体，再培养，再培养，再过滤。重复再过滤

13、。重复3 34 4次，最大限度地除去野生次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分离型菌株，然后再分离第三十页，本课件共有65页三、检出所需缺陷型三、检出所需缺陷型 逐个检出法逐个检出法 经经诱诱变变处处理理后后的的细细胞胞涂涂布布在在平平板板上上，待待长长出出单单个个菌菌落落后后，用用接接种种针针将将这这些些单单个个菌菌落落逐逐个个依依次次地地分分别别接接种种到到基基本本培培养养基基和和另另一一完完全全培培养养基基 。经经培培养养后后，如如果果在在完完全全培培养养基基上上的的某某一一部部位位上上出出现现菌菌落落，而而在在基基本本培培养养基基上上却却不不长长菌菌 ，说明这是一个营养缺陷型。说明这是

14、一个营养缺陷型。第三十一页，本课件共有65页三、检出所需缺陷型三、检出所需缺陷型 影印培养法影印培养法 将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养缺陷型。缺陷型。第三十二页，本课件共有65页第三十三

15、页，本课件共有65页一般从菌落大小也可一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺落较小，即是营养缺陷型陷型 夹层培养法 A A、夹夹层层培培养养法法:先先在在培培养养皿皿中中倒倒一一薄薄层层不不含含菌菌的的基基本本培培养养基基，待待冷冷凝凝后后加加上上一一层层含含诱诱变变处处理理菌菌液液的的基基本本培培养养基基，其其上上再再浇浇一一薄薄层层不不含含菌菌的的基基本本培培养养基基。经经培培养养后后在在培培养养皿皿底底用用笔笔对对首首次次出出现现的的菌菌落落作作记记号号，然然后后再再在在其其上上倒倒一一薄薄层层完完全全培培养养基基。再再经经培培养养后后所所出出现现的的新

16、新菌菌落落，多多数数为营养缺陷型。为营养缺陷型。第三十四页，本课件共有65页四四.鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型生长谱法生长谱法第三十五页，本课件共有65页方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混 合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定菌进行多种营养因子进行测定 方法二：在基本培养基中加入某种营养物方

17、法二：在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定此法可同时对多个菌株进行测定第三十六页，本课件共有65页第三十七页，本课件共有65页五、营养缺陷型突变株的应用1.工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物2.作为杂交、重组育种的遗传标记3.用于微生物代谢途径研究4.在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中用作标记菌株第三十八页，本课件共有65页营养缺陷型的应用实例营养缺陷型的应用实例 利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 第三十九页

18、，本课件共有65页天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶(AK)(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制 通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。突变型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制并且因为消除了反馈抑制 突变型能过量生产突变型能过量生产L-L-赖氨酸赖氨酸 第四十页，本课件共有65页第四节第四节 温度敏感突变株的筛选温度敏感突变株的筛选一、温度敏感突变株（一、温度敏感突变株（temperature-sens

19、itivemutant,TS突变体）：突变体）：突变株在一定温度范围内（许可温度）正常突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型和野生型没有区别，但超出这生长，其表型和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度），则不能生长或一温度范围（非许可温度），则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢停止或减弱。停止或减弱。第四十一页，本课件共有65页二、二、TS突变的原理突变的原理TSTS突变主要是由必需基因发生突变，致突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温度条件下无法正常表使该基因在一定温度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造

20、成细胞不能达，或其编码的酶失活，造成细胞不能正常生长。正常生长。第四十二页，本课件共有65页三、三、TS TS突变株的选育方法突变株的选育方法（一）（一）TS TS突变株的诱发突变株的诱发 TSTS突变主要由基因错义突变所致，要选择突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、化合物，或亚硝酸、UVUV等诱变剂。等诱变剂。（二）（二）淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株/TS/TS菌株富集培养菌株富集培养 抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野培养一定时间

21、，杀灭在该温度下生长的野生型菌株，再离心除去抗生素，分离生型菌株，再离心除去抗生素，分离第四十三页，本课件共有65页四、TS突变株分离筛选富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，再富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度下分用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度下分别培养，对照结果即可检出别培养，对照结果即可检出 TSTS突变体；突变体；也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为TSTS菌株。菌株。第四

22、十四页，本课件共有65页五、五、TS突变株在发酵工业中应用突变株在发酵工业中应用1 1、在谷氨酸发酵中的应用在谷氨酸发酵中的应用 增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷构和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸非积累型转变为积累型。氨酸非积累型转变为积累型。如：以乳糖发酵杆菌如：以乳糖发酵杆菌NO2256NO2256为出发菌株，选育出细胞为出发菌株，选育出细胞膜结构或功能缺损的膜结构或功能缺损的TSTS突变株突变株8888号，通过温度来调节号，通过温度来调节细胞膜透性。当在许可温度细胞膜透性。当在许

23、可温度(30(30)下培养繁殖得到一下培养繁殖得到一定量菌体后，升温致非许可温度定量菌体后，升温致非许可温度(37(37)培养，使细培养，使细胞膜的合成、结构或功能发生障碍，结果突变株能胞膜的合成、结构或功能发生障碍，结果突变株能在高浓度生物素培养基中分泌大量谷氨酸。在高浓度生物素培养基中分泌大量谷氨酸。第四十五页，本课件共有65页2、TS突变株在丝氨酸发酵中的应用以C1化合物为唯一碳源的微生物合成细胞组分是通过丝氨酸途径来实现的。要提高丝氨酸产量，关键在于阻断丝氨酸降解。日本味之素公司的Moringga筛选到TS突变株，它们在30丝氨酸降解正常，但在3840失去降解丝氨酸的能力，因而大量分泌

24、丝氨酸第四十六页，本课件共有65页第五节 诱变育种实例 第四十七页，本课件共有65页一、产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育 前言：环己酰亚胺（前言：环己酰亚胺（cycloheximide）,又名放线酮（Actidione），是于19481948年德国化学家年德国化学家B.E.LeachB.E.Leach等等分离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物分离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物.它对多种真菌具有拮抗作用，其制剂具有水溶解性良好、作用剂量低的优点,在植物保护方面得到广泛应用。云南大学省微生物研究所教育部微生物资源重点实验室）发现一株产生具有产生环己酰亚胺类化合物的放线菌新种Strept

25、omyces yunnanensis,典型菌株为YIM41004第四十八页，本课件共有65页（一）产环己酰亚胺新菌株产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育的复合诱变选育为了选育出活性物质为了选育出活性物质产量高、遗传性状稳定、培养要求产量高、遗传性状稳定、培养要求低、工艺简单低、工艺简单的优良菌株,作者采用紫外线（作者采用紫外线（UVUV）、）、亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）、UV+LiCl和和6060Co对对YIM41004YIM41004进进行了复合诱变研究行了复合诱变研究。经过八代诱变育种，。经过八代诱变育种，到一株生产特性和生长特性均有所改善的变异菌株到一株生产特性和生长

26、特性均有所改善的变异菌株F8-439.第四十九页，本课件共有65页（二）孢子悬液预培养（二）孢子悬液预培养 用种子培养基刮洗下用种子培养基刮洗下57d成熟斜面孢子，并稀释到成熟斜面孢子，并稀释到1千千万至万至1 1亿个孢子每毫升，置于亿个孢子每毫升，置于50mL带玻璃珠和搅拌子的三角瓶中，28磁力搅拌培养到大多数孢子开磁力搅拌培养到大多数孢子开始萌发（约始萌发（约34h).34h).60CoCo诱变时不做预培养诱变时不做预培养.第五十页，本课件共有65页（三）诱变处理方法诱变处理方法1UV1UV诱变诱变一切操作在红光下或避光进行一切操作在红光下或避光进行.取经预培养的取经预培养的孢子悬液孢子悬

27、液8mL8mL于直径于直径9cm9cm带搅拌子平皿中，在诱变箱带搅拌子平皿中，在诱变箱中中(提前开紫外灯0.5h)0.5h)磁力搅拌，15W30cm15W30cm照射一定时间.收集于试管中，冰水浴收集于试管中，冰水浴2h，钝化修复酶.涂布基础培养基分离平板，2828避光培养避光培养23d.第五十一页，本课件共有65页2、亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）诱变于通风橱中准确称量NTGNTG，加助溶剂甲酰胺或丙酮少许（12mL）,用pH6.0pH6.0磷酸缓冲液溶解成1mgmL-1，保存于棕色瓶中，保存于棕色瓶中.NTG.NTG不用灭菌，现配现用不用灭菌，现配现用.采用混合平板涂菌法：先倒好含采用

28、混合平板涂菌法：先倒好含525gmL-1NAG的混合平板,再用预培养好的孢子再用预培养好的孢子悬液涂布分离平板，悬液涂布分离平板，28避光培养34d.第五十二页，本课件共有65页3 36060Co诱变每支试管中装3mL3mL用生理盐水稀释到用生理盐水稀释到106107106107孢子孢子/mL的孢子悬液，整个过程置于装有冰水的烧杯中，照射剂量以处理总剂量计算.第五十三页，本课件共有65页 4UV+LiCl4UV+LiCl复合诱变孢子悬液按UV诱变常规处理后涂布于含0.11.0%LiCl(W/V)0.11.0%LiCl(W/V)的分离平板上，的分离平板上，2828培养34d.第五十四页，本课件共

29、有65页（三）筛选步骤1预筛1 1琼脂块法预筛琼脂块法预筛 琼脂块制备琼脂块制备:在直径在直径9cm9cm平皿中定量加入平皿中定量加入30mL30mL基础培养基基础培养基,冷冷却凝固后用直径却凝固后用直径6mm6mm打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块移至直径移至直径9cm9cm空平皿中空平皿中单菌落点接琼脂块和培养单菌落点接琼脂块和培养:挑取挑取型菌落，或形态变异明显的型菌落，或形态变异明显的菌落，点接到琼脂块上菌落，点接到琼脂块上.每次诱变最少挑每次诱变最少挑200200株株.把以上平皿置把以上平皿置于保湿盒内，于保湿盒内，2828培养培养2d2d，使活

30、性物质积累于琼脂块中，使活性物质积累于琼脂块中;琼脂块生测琼脂块生测:把培养好的琼脂块移到生测平板上，把培养好的琼脂块移到生测平板上，2828培养培养2d,2d,测测量抑菌圈直径量抑菌圈直径.每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落2323个，接个，接种斜面种斜面,每次诱变最少挑每次诱变最少挑5050株株.第五十五页，本课件共有65页（三）筛选步骤2小瓶发酵初筛预筛所得菌株斜面培养57d，待孢，待孢子成熟，刮取约子成熟，刮取约1/41/4斜面孢子，接种于装有斜面孢子，接种于装有20mL发酵发酵培养基的培养基的250mL250mL三角瓶中，200r/min，28培养培养969

31、6h.h.发酵液4000r/min4000r/min离心离心10min10min，取，取40L上清液用杯碟法生测初筛出抑菌圈最大的20株用于复筛和菌种保藏.第五十六页，本课件共有65页（三）筛选步骤3复筛3大瓶复发酵复筛大瓶复发酵复筛用初筛出的用初筛出的5858株菌成熟斜面孢子接株菌成熟斜面孢子接种于装有种于装有100mL100mL种子培养基的500mL三角瓶，200200r/minr/min，2828培养48h，得种子液，得种子液.取种子液取种子液10mL接种接种于装有于装有80mL80mL发酵培养基的发酵培养基的500mL三角瓶中，三角瓶中，200r/min，28培养96h.96h.复发酵

32、复筛复发酵复筛3 3批次，每次每株批次，每次每株重复接种重复接种3瓶瓶.发酵液用HPLCHPLC法测定发酵液放线酮含量，筛选出2424株产量高的变异菌株用于下一轮诱株产量高的变异菌株用于下一轮诱变处理和菌种保藏变处理和菌种保藏.第五十七页，本课件共有65页（四）测定方法测定方法1 1 1指示菌平板生物活性测定法（生测）指示菌平板生物活性测定法（生测）指示菌：用放线酮敏感菌株赭色掷孢酵母菌（指示菌：用放线酮敏感菌株赭色掷孢酵母菌（Sporolomyces Sporolomyces salmonicolorsalmonicolor）.生测平板生测平板制备：制备：用直径用直径20cm20cm平皿平皿

33、.下层：下层：水琼脂水琼脂100mL100mL（含（含2 2 琼脂）；上层：取新鲜酵母菌斜面琼脂）；上层：取新鲜酵母菌斜面1 1支，用支，用5mL5mL生理盐水刮洗下生理盐水刮洗下菌体，倒入已熔化并冷却到菌体，倒入已熔化并冷却到45504550的的80mL80mL指示菌培养基中，指示菌培养基中，摇匀，迅速倒入平皿中摇匀，迅速倒入平皿中.冷却后用于生测，现制现用冷却后用于生测，现制现用.第五十八页，本课件共有65页（四）测定方法测定方法22HPLC2HPLC法复筛时菌株发酵液用浓硫酸调酸至pH23，摇匀后静置30min,4000r/min离心10min.10min.上清液上清液用用2 2倍体积氯

34、仿萃取倍体积氯仿萃取2 2次，有机相合并蒸干，甲醇洗脱并定容，用HPLC法测定放线酮含量.含量根据色谱峰面积与标准品的峰面积对比进行计算.第五十九页，本课件共有65页（五）诱变剂量的确定诱变剂量的确定为确定各诱变剂合适的处理剂量，每一种诱变剂设置了一为确定各诱变剂合适的处理剂量，每一种诱变剂设置了一系列不同的处理剂量，对孢子悬液按诱变处理操作进行处理，系列不同的处理剂量，对孢子悬液按诱变处理操作进行处理，平板分离后统计致死率。由于实验菌株平板分离后统计致死率。由于实验菌株YIM41004YIM41004为初次受诱为初次受诱变，本实验拟选择致死率在变，本实验拟选择致死率在90909999的高致死

35、率来确定各的高致死率来确定各诱变剂合适的处理剂量诱变剂合适的处理剂量.根据实验结果，拟定各诱变剂合适的根据实验结果，拟定各诱变剂合适的处理剂量为：处理剂量为：UVUV诱变时诱变时UVUV照射时间选照射时间选40s60s40s60s，NTGNTG诱变时选诱变时选分离平板培养基中加分离平板培养基中加15gmL-1NTG15gmL-1NTG，6060CoCo诱变时选照射总诱变时选照射总剂量为剂量为1.0105R1.0105R，UV+LiClUV+LiCl复合处理时选复合处理时选UVUV照射时间照射时间4050s4050s、分离平板培养基中加分离平板培养基中加0.10.1 LiCl(w/w).LiCl

36、(w/w).第六十页，本课件共有65页（六）（六）YIM41004菌落形态筛选菌落形态筛选 诱变处理前对出发菌株诱变处理前对出发菌株YIM41004YIM41004进行了平板分离纯化，并考进行了平板分离纯化，并考察了不同菌落类型菌株的放线酮生产特性察了不同菌落类型菌株的放线酮生产特性.结果发现，出发结果发现，出发菌 株菌 株 YIM41004YIM41004在平板上主要形成在平板上主要形成3 3种菌落类型，分别称其种菌落类型，分别称其为为型、型、型 和型 和型型第六十一页，本课件共有65页（七）诱变线路（七）诱变线路 本实验采用了如下诱变线路：YIM41004YIM41004出发菌株UVUV诱

37、变筛选F1F1UVUV诱变筛选F2F2UV+LiCl诱变筛F3F3UV+LiCl诱变筛选F4F4NTGNTG诱变F5F5NTGNTG诱变筛选F6F660Co诱诱变变筛选筛选F7UV诱变诱变筛选筛选F8F8 第六十二页，本课件共有65页（八）F8-439菌株特性研究菌株特性研究 经过连续经过连续8代的诱变育种，选育得到一株生产特性和生代的诱变育种，选育得到一株生产特性和生长特性均有所改善的变异菌株长特性均有所改善的变异菌株F8-439.F8-439F8-439.F8-439菌株摇瓶发酵放线酮产量产量平均达538.7mgL-1,比出发菌株（450mgL450mgL-1-1）提高）提高19.71.而且，F8-439F8-439菌株产生的放线酮HPLCHPLC峰形狭长，无杂峰，说明峰形狭长，无杂峰，说明产物较单一。产物较单一。F8-439F8-439菌株菌株生长周期缩短，液体种子培养36h达对数期达对数期中后期，即可用做种子液，而出发菌株发酵种子培养中后期，即可用做种子液，而出发菌株发酵种子培养需需48h.48h.第六十三页，本课件共有65页作业：1、什么是诱变育种？2、检出营养缺陷型的方法有哪些？第六十四页，本课件共有65页感感谢谢大大家家观观看看第六十五页，本课件共有65页