蛋白质的测定课件课件精选课件.ppt

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1、关于蛋白质的测定课件关于蛋白质的测定课件第一页，本课件共有36页第一节第一节 概述概述1.1.蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（The elements of The elements of proteinprotein）C C C C：50-55%N50-55%N：15-18%O15-18%O：20-23%20-23%H H：6-8%S6-8%S6-8%S6-8%S：0-4%0-4%0-4%0-4%微量元素：微量元素：P P P P、FeFeFeFe、ZnZn、CuCu2 2、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸3 3、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。第二页，本课件共有36页4

2、、蛋白质分析的重要性、蛋白质分析的重要性生物活性测定生物活性测定功能性质调查功能性质调查营养标签营养标签营养标签营养标签 总蛋白质含量总蛋白质含量 氨基酸组成氨基酸组成 蛋白质的营养价值蛋白质的营养价值第三页，本课件共有36页5、蛋白质的测定方法、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法福林酚法福林酚法染色法染色法第四页，本课件共有36页第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电电泳泳或或纸纸层层析析之之后后用用一一些些染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合并并变变色。书中列举

3、了色。书中列举了 5 种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2种方法）种方法）种方法）种方法）第五页，本课件共有36页第三节 蛋白质的定量测定关于氮关于氮-蛋白质换算等数蛋白质换算等数6.25=6.25=6.38=5.95第六页，本课件共有36页一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法 1.1.原理原理 样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分

4、解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与与硫硫酸酸结结合合成成硫硫酸酸铵铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。第七页，本课件共有36页2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 消化消化(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点作为增温剂，提高溶液沸点加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂、消化终点指示剂作为催化剂、消化终点指示剂加氧化剂加氧化剂 加速有机物氧化速度加速有机物

5、氧化速度第八页，本课件共有36页第九页，本课件共有36页 蒸馏蒸馏NH4+OH-=NH3+H2O第十页，本课件共有36页影响氨化完全和速度的因素影响氨化完全和速度的因素（1 1）KK氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量（2 2）分解剂）分解剂 1g1g样品样品 K K2 2SOSO4 4 4 4：H H H H2 2SOSO4 4 4 4 =7g:=7g:12ml12ml 还有一种比例：还有一种比例：K K2 2SOSOSOSO4 4：H H H H2 2 2 2SOSOSOSO4 4 =10g:20ml=10g:20ml第十一页，本课件共有36页用用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收，用盐酸标

6、准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿）溴甲基酚绿）指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸）（碱）（碱）（酸）（酸）吸收与滴定吸收与滴定反应式为：反应式为：NHNH3 3+H+H3 3BOBO3 3=NH=NH4 4+H+H2 2BOBO3 3-H H2 2BOBO3 3-+H+H+=H=H3 3BOBO3 3 用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再用标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。标准溶液滴定过剩的酸液。第十二页，本课件共有36页 现测定某一种食品的蛋白质的含量，现测定某一种食品的蛋白质的含量，这

7、种样品含有大量的脂肪，样品经过处理这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分结合，经振摇后大火加热进行消化；消化结合，经振摇后大火加热进行消化；消化2h2h后，估计消化完全，取出消化液加入少后，估计消化完全，取出消化液加入少量量NaOHNaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲基红基红-溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对溴甲基酚绿）作为吸收液，最后对吸收液进行滴定。吸收液进行滴定。大量的脂肪大量的脂肪振摇振摇振摇振摇大火加热大火加热大火加热大火加热消化消化2h2h后，估计消化完全后，估计消化完全量量NaOH

8、NaOH少少第十三页，本课件共有36页 计 算X =X为样品中蛋白质的含量为样品中蛋白质的含量V1为样品消耗盐酸标准液的体积为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C C为盐酸标准液的浓度为盐酸标准液的浓度MN为氮的摩尔质量为氮的摩尔质量为氮的摩尔质量为氮的摩尔质量W为样品的质量为样品的质量K为氮换算为蛋白质的系数为氮换算为蛋白质的系数第十四页，本课件共有36页1.装水至装水至 2/3 容积处，容积处，加甲基橙加甲基橙数滴及硫数滴及硫酸数毫升酸数毫升以保持酸以保持酸性性7.水蒸气蒸馏至

9、指示剂变绿色开始水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时，蒸馏计时，蒸馏10min，将管尖端提，将管尖端提离液面再蒸馏离液面再蒸馏1min，用水冲洗，用水冲洗管尖后停止蒸馏管尖后停止蒸馏同时做空白同时做空白8.吸收液用吸收液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至标准溶液滴定至微红色为终点微红色为终点2.管下端插管下端插入液面下入液面下(瓶内先装瓶内先装硼酸液及混硼酸液及混合指示剂合指示剂2滴滴)3.消化液消化液 10mL4.NaOH溶液溶液5.水洗漏水洗漏斗数次斗数次6.夹好漏斗夹，夹好漏斗夹，水封。水封。4.5.6步操步操作要作要迅速迅速微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法第十五页，本课件共有36页

10、凯氏定氮仪凯氏定氮仪第十六页，本课件共有36页凯氏定氮仪凯氏定氮仪第十七页，本课件共有36页二二、双缩脲法双缩脲法NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH2150160双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性溶能和硫酸铜的碱性溶液生成液生成紫色络和物紫色络和物。紫色络合物。紫色络合物。第十八页，本课件共有36页操作方法操作方法1 1、制作标准曲线、制作标准曲线取取1010支干试管分成两组，按下表平行操作：支干试管分成两组，按下表平行操作：0 0 0 01 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 45 5 5 5标准蛋白液标准蛋白液标准蛋白液标准蛋

11、白液/ml/ml/ml/ml0.20.20.20.20.40.40.40.40.60.60.60.60.80.80.80.81.01.01.01.0蛋白浓度蛋白浓度蛋白浓度蛋白浓度/(mg/ml)/(mg/ml)/(mg/ml)/(mg/ml)2.02.02.02.04.04.04.04.06.06.06.06.08.08.08.08.010.010.010.010.0蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水/ml/ml/ml/ml1.01.01.01.00.80.80.80.80.60.60.60.60.40.40.40.40.20.20.20.20.00.00.00.0双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲

12、试剂/ml/ml/ml/ml4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0 A A A A540540 取两组测定的取两组测定的A A540值的平均值，即值的平均值，即A A540540为纵坐标，蛋白为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。质浓度为横坐标，绘制标准曲线。第十九页，本课件共有36页2 2、样品测定、样品测定取取4 4支试管分成两组，按下表平行操作：支试管分成两组，按下表平行操作：0 0 0 01 1 1 1样品稀释液样品稀释液样品稀释液样品稀释液/ml/ml/ml/ml0.50.

13、50.50.5蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水/ml/ml/ml/ml1.01.01.01.00.50.50.50.5双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂双缩脲试剂/ml/ml/ml/ml4.04.04.04.04.04.04.04.0A A A A540540第二十页，本课件共有36页取两组测定的平均值计算：取两组测定的平均值计算：取两组测定的平均值计算：取两组测定的平均值计算：Y Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/mlmg/ml）N N N N为稀释倍数为稀释倍数c c为样品原浓度（为样品原浓度（mg/mlmg/ml）。）。3、计算、计算第二十一页，本课件共有36页福林-酚

14、法（双缩脲法的发展）两步反应两步反应(1)(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质铜络合物。铜络合物。(2)(2)此络合物将试剂磷钼酸此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸磷钨酸(olinolin试剂试剂)还原，混合物深蓝色还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。第二十二页，本课件共有36页杜马斯法（燃烧法）杜马斯法（燃烧法）样品在高温下（样品在高温下（700-800700-800）燃烧，释放的氮气）燃烧，释放的氮气）燃烧，释放的氮气）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（由带热导检测器（由带热导检测器（由带热导检测器（TCD)TCD)的

15、气相色谱仪测定。测得的含的气相色谱仪测定。测得的含的气相色谱仪测定。测得的含的气相色谱仪测定。测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。氮量转换成样品中的蛋白质含量。氮量转换成样品中的蛋白质含量。氮量转换成样品中的蛋白质含量。第二十三页，本课件共有36页几种蛋白质测定方法比较几种蛋白质测定方法比较凯式定氮法凯式定氮法凯式定氮法凯式定氮法双缩脲双缩脲双缩脲双缩脲杜马斯杜马斯杜马斯杜马斯福林福林福林福林-酚酚酚酚原理原理原理原理装置装置装置装置溶剂溶剂溶剂溶剂时间时间时间时间灵敏灵敏灵敏灵敏度度度度干扰干扰干扰干扰总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮凯式定氮装置凯式定氮装置分光光度计分光光

16、度计高温装置、高温装置、GCGC分光光度计分光光度计浓硫酸浓硫酸用量较少用量较少不需要不需要福林福林-酚试剂酚试剂长长简单快速简单快速3min3min简单快速简单快速较低较低较低较低低低低低高高高高高高高高较小较小较小较小有干扰有干扰有干扰有干扰较小较小较小较小酸类及柠檬酸类及柠檬酸类及柠檬酸类及柠檬酸类酸类酸类酸类第二十四页，本课件共有36页其他方法其他方法染色法染色法紫外紫外吸收法吸收法水杨酸比色法水杨酸比色法第二十五页，本课件共有36页 采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：列记录的数据计算：水份含量水份含量=8.0%，1

17、号样品重量号样品重量=1.015g，2号样品号样品号样品号样品重量重量重量重量=1.025g，用于滴定的标准，用于滴定的标准，用于滴定的标准，用于滴定的标准HCl浓度浓度浓度浓度=0.1142mol/L=0.1142mol/L，1 1号样品所用的号样品所用的HClHCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22.0mL，2号样品的号样品的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数溶液的毫升数溶液的毫升数=22.5mL=22.5mL，空白的，空白的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有假定该蛋白质含有17.5%的氮。的

18、氮。第二十六页，本课件共有36页第四节第四节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定第二十七页，本课件共有36页一、甲醛滴定法一、甲醛滴定法 氨基酸本身有碱性氨基酸本身有碱性-NH-NH2 2基，又有酸性基，又有酸性-COOHCOOHCOOHCOOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与与-NH-NH-NH-NH2 2结合，碱性消失，再用强碱来滴定结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOHCOOH基。基。基。基。第二十八页，本课件共有36页反应式（有几种不同的推论）如下：反应式（有几种不同的推论）如下：第二十九页，本课件共有36页双指示剂：百里酚酞双指示剂：百里酚酞+中性红指示

19、剂中性红指示剂同时取两份样同时取两份样+中性红，用中性红，用NaOHNaOH滴定滴定+百里酚酞百里酚酞+中性甲醛中性甲醛+NaOH+NaOH滴定滴定第三十页，本课件共有36页二、非水溶液滴定法二、非水溶液滴定法在水溶液中在水溶液中1 1、能溶解的物质有限，尤其是有机物质、能溶解的物质有限，尤其是有机物质2 2、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄、水的两性太强，能在水中滴定酸、碱范围较窄3 3 3 3、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。、本身会与水起反应而生成酸的某些物质不能滴定。第三十一

20、页，本课件共有36页溶剂选择原则溶剂选择原则1 1、不引起副反应、不引起副反应2 2、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物、溶剂应能溶解试样及滴定反应产物3 3、应考虑溶剂的酸碱性、应考虑溶剂的酸碱性 对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好对于酸的滴定，溶剂的酸性应越弱越好第三十二页，本课件共有36页氨基酸的非水溶液滴定氨基酸的非水溶液滴定1 1、选择冰乙酸作为溶剂、选择冰乙酸作为溶剂2 2、选择高氯酸进行滴定、选择高氯酸进行滴定第三十三页，本课件共有36页三、电位滴定法三、电位滴定法 根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的标准溶液滴定，根据酸度计指示的标准溶液滴定，根据酸度计指示的标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH pH 值判值判断和控制滴定的终点。断和控制滴定的终点。pH8.28.29 9.2.2第三十四页，本课件共有36页氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法 第三十五页，本课件共有36页感感谢谢大大家家观观看看第三十六页，本课件共有36页