蛋白质的分离纯化及双向电泳精选课件.ppt

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1、关于蛋白质的分离纯化及双向电泳第一页，本课件共有68页蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的变性蛋白质的变性蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收一、蛋白质的性质一、蛋白质的性质第二页，本课件共有68页一、蛋白质的性质一、蛋白质的性质蛋白质与多肽一样，能够发生两性蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，离解，也有等电点。在等电点时也有等电点。在等电点时(Isoelectric Isoelectric point pI)point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。场中不移动。在不同的在

2、不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)Electrophoresis)。1 1 1 1 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的两两两两性性性性离离离离解解解解和和和和电电电电泳泳泳泳现现现现象象象象第三页，本课件共有68页电泳电泳蛋白质在等蛋白

3、质在等电点电点pHpH条件条件下，不发生下，不发生电泳现象。电泳现象。利用蛋白质利用蛋白质的电泳现象，的电泳现象，可以将蛋白可以将蛋白质进行分离质进行分离纯化。纯化。第四页，本课件共有68页由于蛋白质的分子量很大，它在水中能由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。分子杂质除去。2 2 蛋蛋白白质质的的胶

4、胶体体性性质质第五页，本课件共有68页蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。沉淀出来。3 3 蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀作作用用第六页，本课件共有68页在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生在沉淀过程中，结构和

5、性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。剂沉淀法等。3 3 蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀作作用用可逆沉淀可逆沉淀第七页，本课件共有68页在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不质的结构和性质，产生的蛋白质

6、沉淀不可能再重新溶解于水。可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。3 3 3 3 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的沉沉沉沉淀淀淀淀作作作作用用用用不可逆沉淀不可逆沉淀第八页，本课件共有68页蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质

7、改变的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)。4 4 蛋蛋白白质质的的变变性性第九页，本课件共有68页蛋白质的变性蛋白质的变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强

8、碱等。强酸和强碱等。第十页，本课件共有68页大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280280nm nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在收。因此，大多数蛋白质在280280nm nm 附近附近显示强的吸收。显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。鉴定。5 5 蛋蛋白白质质的的紫紫外外吸吸收收第十一页，本课件共有68页二二、蛋蛋白白质质分分离离和和纯纯化化研究蛋白质的结构、性质和功能，研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的

9、蛋白质样品。首先需要得到纯的蛋白质样品。(1)(1)蛋白质来源：微生物细胞、动蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；物细胞和植物细胞；(2)(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。白质含量。(3)(3)分离和纯化过程都必须在温和分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。的条件下进行。第十二页，本课件共有68页1 1蛋蛋白白质质的的分分离离步步骤骤(1)(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行根据蛋白质的特性，选择不

10、同的溶剂进行抽提。抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。提等。(3)(3)粗提粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。制品。(4)(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。品。第十三页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方

11、方法法根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用用(Precipitation)。因为蛋白质分子量大小不同、表面所因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。白质分离出来。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。第十四页，本课件共有68页沉淀法沉淀法膜分离法膜分离法萃取法萃取法层析法层析法电泳法电泳法2 2蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法第十五页，本课件共有6

12、8页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀容易发生沉淀阴离子化合物的效果是：阴离子化合物的效果是：NHNH4 4+KK+NaNa+阳离子化合物的效果是：阳离子化合物的效果是：POPO4 43-3-SOSO4 42-2-ClCl-常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。以将不同的蛋白

13、质加以分离。盐析盐析第十六页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法在蛋白质溶液中，加入一定量的与水在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-(30%-50%)50%)，而且需要在低温条件下进行。，而且需要在

14、低温条件下进行。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法第十七页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的当蛋白质混合物溶液的pH pH 被调到某一被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该或低于该pH pH 的蛋白质仍然留在溶液中。的蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点该法适用于在等电点pHpH稳定的蛋

15、白质。稳定的蛋白质。等电点沉淀法等电点沉淀法第十八页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法DialysisDialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。截止分子量一般为一万。透析法透析法第十九页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法透析是将待纯化的蛋白质溶液装

16、在用半透膜制成的透析袋透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。进行透析。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。透析法透析法第二十页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法超过滤技术是在一定的密封容器，施超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。超滤膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器、板式超滤器。式超滤器、板式超滤器。超滤膜的截止

17、分子量有超滤膜的截止分子量有100100万、万、5050万、万、3030万、万、1010万、万、5 5万、万、1 1万、万、5 5千和千和1 1千千超过滤法超过滤法第二十一页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法超过滤法超过滤法第二十二页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法两种亲水性高分子或一种高分子聚合两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因疏水性差物与一种盐溶液混合后，因疏水性差异而分层。不同的蛋白质在疏水层的异而分层。不同的蛋白质在疏水层的溶解能力不同而被萃取。溶解能力不同而被萃取。目前主要采用两种体系目前主要采用两种体系聚乙二醇葡聚

18、糖聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇磷酸钾聚乙二醇磷酸钾双水相萃取法双水相萃取法第二十三页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。白质。将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。胶束内。反相胶束萃取法反相胶束萃取法第二十四页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化

19、方方法法最常用的是二氧化碳，在最常用的是二氧化碳，在78.378.3M Mpapa压力压力下，下，COCO2 2处于液体状态，温度为处于液体状态，温度为31.131.1C C，当压力或温度发生改变时，当压力或温度发生改变时，COCO2 2处于气液中间态，具有溶剂性能，处于气液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。可分离出来。超临界流体萃取法超临界流体萃取法第二十五页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法超临界流体萃取法超临界流体萃取法第二十六页，本课件共

20、有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。（如二乙基氨基乙基纤维素等）。带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如阳离子洗脱液，

21、如NaClNaCl溶液进行梯度洗脱，通溶液进行梯度洗脱，通过过NaNa+的离子交换作用，可以将带有不同正电的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法离子交换层析法第二十七页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法离子交换层析法离子交换层析法第二十八页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。网状结

22、构。Sephadex-Sephadex-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G10-G200G10-G200Sepharose-Sepharose-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2 2B,4B,6BB,4B,6BSephacryl-Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400S100,S200,S300,S400凝胶过滤法凝胶过滤法第二十九页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法凝胶过滤法凝胶过滤法第三十页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附

23、到连接有疏水基团的层析小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。洗脱。正丁基正丁基-Sepharose、正辛基正辛基-Sepharose苯基苯基-Sepharose疏水层析疏水层析第三十一页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上

24、的是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层它蛋白质则流出柱外。被特

25、异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。液洗脱。亲和层析法亲和层析法第三十二页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。凝胶等。亲和层析法亲和层析法第三十三页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液反的电极移动，这种现象称为电

26、泳。蛋白质溶液的的pHpH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（移动的速度（v v）取决于电场强度取决于电场强度(E)E)，所带的所带的净电荷净电荷(q)q)以及与介质的摩擦系数以及与介质的摩擦系数(f)f)。第三十四页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法SDSSDS（十二烷基

27、磺酸钠）是一种阴离子型表面活十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约大约1 1 2 2比例结合。比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDSSDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，荷密度也大体相同，因此，E E q q值接近一个值接近一个常数。所以该法主要利用了

28、蛋白质分子量大常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。出不同蛋白质的分子量。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法第三十五页，本课件共有68页2 2蛋蛋白白质质的的纯纯化化方方法法将两性电解质将两性电解质(pH3-9,pH3-9,或其它范围的如或其它范围的如pH5-7)pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经同蛋白质样品一起加入到已经铺好的凝胶上，在电场下，两性电解铺好的凝胶上，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质首先达到它

29、的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。极移动，最后也达到平衡。等电聚焦等电聚焦第三十六页，本课件共有68页3.3.蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定定氮法：灵敏度较低定氮法：灵敏度较低双羧脲法：样品量双羧脲法：样品量0.2-1.70.2-1.7mg/Lmg/LFolin-LowryFolin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合结合起来，

30、蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在物老绿色，在650650nmnm具有特定的吸收。灵具有特定的吸收。灵敏度较高敏度较高2525 g-250g-250 g/ml.g/ml.第三十七页，本课件共有68页考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（BradfordBradford法）法）考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250是一种带有负电荷的染料，是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在合，形成蓝色化合物，在595595nmnm具有特定吸具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 5-50 g/ml.g

31、/ml.紫外吸收法紫外吸收法由于核酸在由于核酸在260260nmnm具有光吸收，对测定干具有光吸收，对测定干扰较大，可采用扰较大，可采用280280nmnm、260nm260nm同测法。同测法。蛋白质浓度蛋白质浓度mg/mlmg/ml1.45A280-0.74A2601.45A280-0.74A260第三十八页，本课件共有68页4.4.蛋白质纯度等的测定蛋白质纯度等的测定纯度和分子量的测定纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等技术

32、测定。等电点的测定等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。：利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定亚基个数的测定：采用：采用SDSSDS聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。胶电泳方法测定。第三十九页，本课件共有68页双向电泳简介及其在园艺学中的应用第四十页，本课件共有68页第四十一页，本课件共有68页第四十二页，本课件共有68页第四十三页，本课件共有68页第四十四页，本课件共有68页第四十五页，本课件共有68页第四十六页，本课件共有68页第四十七页，本课件共有68页第四十八页，本课件共有68页生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型的实验模型的设计设计实验组和对照组样实验组和对照组样品的制备品的

33、制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验的其它实验的进一步验证进一步验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋蛋白白质质组组分分析析流流程程第四十九页，本课件共有68页蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上

34、的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定第五十页，本课件共有68页第五十一页，本课件共有68页第五十二页，本课件共有68页第五十三页，本课件共有68页第五十四页，本课件共有68页第五十五页，本课件共有68页第五十六页，本课件共有68页第五十七页，本课件共有68页第五十八页，本课件共有68页第五十九页，本课件共有68页氮胁迫条件下稻瘟病菌致病性分泌蛋白的鉴定 项目编号：31060021起止时间：2011年1月-

35、2013年12月第六十页，本课件共有68页利用二维凝胶电泳技术（2DE）和定量质谱技术对氮胁迫与非氮胁迫条件下该稻瘟病菌分泌蛋白表达谱进行研究,通过肽质量指纹图谱（PMF）和蛋白质数据库同源性分析对差异蛋白进行鉴定,结合稻瘟病菌全基因组测序结果和生物信息学资源,分析出其中具有信号肽,属于典型分泌蛋白的基因,经RT-PCR扩增克隆后,利用购自Invitrogen公司的酵母表达系统获得有生物活性的分泌蛋白。将该蛋白接种国际水稻所（IRRI）提供的水稻单基因鉴别品系进行功能验证与互作分析,从而有效解析这些蛋白在病菌致病过程中的作用。该研究对于深入了解氮营养胁迫条件下稻瘟病菌致病性分泌蛋白与水稻之间的

36、相互识别，信号传导和应答过程，阐明水稻对稻瘟病菌的抗性机制、水稻与稻瘟病菌互作的分子机理具有重要意义。第六十一页，本课件共有68页第六十二页，本课件共有68页第六十三页，本课件共有68页今日实验Taq DNA polymerase 和Pfu DNA polymerase的煮沸法纯化第六十四页，本课件共有68页目的：获得纯的，无DNA污染的Taq和pfu聚合酶，用于PCR反应。原理利用Taq和pfu酶耐高温不变性的原理。第六十五页，本课件共有68页操作步骤取1.5ml过夜培养并经IPGE诱导的菌种于离心管中，4000rpm离心5min收集菌体；重复收集1次；用4X Taq或pfu buffer，0.5ml清洗菌体1次；加入100l 4X Taq buffer,剧烈振荡重悬菌体；第六十六页，本课件共有68页沸水煮沸8 min，期间颠倒2-3次；13000rpm,离心30分钟；转上清入新管（约100l);加入10l平衡好磷酸二氢钾（pH 10.3);加入110l无水乙醇，振荡10秒，3000 rpm，2 min;转上清入新管，加100l无菌甘油，混匀，保存于-20备用。第六十七页，本课件共有68页感感谢谢大大家家观观看看第六十八页，本课件共有68页