大肠菌群检验技术.ppt

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1、大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群大肠菌群是作为粪便污

2、染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可

3、以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测目前

4、国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。国家标准采用三步法国家标准采用三步法即：即：乳糖发酵试验乳糖发酵试验 分离培养分离培养 证实试验证实试验样品稀释后，选择三个稀释度，样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。酵管。361培养培养482h，观察，观察是否产气。是否产气。将产气发酵管培养物转种于将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，伊红美蓝琼脂平板上，361培养培养18-24h，观察菌

5、，观察菌落形态。落形态。挑取平板上的可疑菌落，进行革挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管酵管361培养培养242h，观察产，观察产气情况。气情况。根据证实为大肠杆菌阳性的管根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查数，查MPN表，报告每表，报告每100ml（g）大肠菌群的）大肠菌群的MPN值。值。具体操作参见GB4789.3-94 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定 原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行

6、检测。本方法采用两步法菌进行检测。本方法采用两步法.推测试验.证实试验 样品稀释后，选择三个稀释度，每样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管个稀释度接种三管LST肉汤。肉汤。361培养培养482h，观察是否产气。，观察是否产气。将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，）肉汤管中，361培养培养482h，观察是否产气。以，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查产气为阳性。查MPN表，报告每表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。1MPN检索表检索表 2初发酵和证实试验初发酵和证实试验 3产气量与倒管产气量与倒管 4挑选菌

7、落挑选菌落 5抑菌剂抑菌剂 1MPN检索表：检索表：MPN 为最大可能数为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意倍。注意国家标准和行业标准中所附国家标准和

8、行业标准中所附MPN表所用稀释度是表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。不同的，而且结果报告单位也不相同。2初发酵和证实试验：初发酵和证实试验：无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即符合大肠菌群的定义，即“在在37分解乳糖产酸产分解乳糖产酸产气气”。初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时

9、可能成为阴性。有数据表明，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。验是必需的。3产气量与倒管：产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以

10、使气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。4挑选菌落：挑选菌落：国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于平板分离，对典型和可疑菌落进行观察

11、和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密

12、切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。5抑菌剂：抑菌剂：大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标

13、准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。加应严格按照标准方法进行。