实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质.ppt

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1、 实验二实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质(1)学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。实验原理实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和形状等因素。如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质-SDS复合物具有相同

2、的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。n Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。n 化学法化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。n 采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。n这次实验是利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大

3、肠杆菌全蛋白。nSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行；包括浓缩胶（积层胶）和分离胶。材料与试剂材料与试剂n1材料：n标准样BSA（小牛血清白蛋白）,已经与上样缓冲液混合完毕n2试剂n1）30%(Acr)/0.8%N,N-甲叉双丙烯酰胺（BIS）n2）5SDS电泳缓冲液,稀释成1n3）Tris-HCl/SDS,浓缩胶pH 6.8n4）Tris-HCl/SDS,分离胶pH 8.8n5）10%过硫酸铵(AP)n6）TEMED 商品试剂实验步骤实验步骤n1装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。2制分离胶：按所需的浓度配制12.5分离胶分离胶。TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置

4、灌入，注意不能有气泡；灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）30%Acr-Bis Tris-HCl pH 8.8 H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120 l20 ln3制浓缩胶浓缩胶：按所需的浓度配制4%的浓缩胶浓缩胶，配方如下：30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.8 H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul7.5ul 4.4.灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液

5、加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。理。n5加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样7.5L。n6电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，停止电泳。7翘开玻璃板，将浓缩胶切掉,剥下凝胶，准备染 色。8 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟，回收染液至

6、指定容器回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次10分钟。注意事项注意事项 (1)Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。(2)玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。(3)样品槽模板梳齿应平整光滑。(4)灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。(5)切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。(6)电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。(7)稀释5SDS/电泳缓冲液至1浓度灌入电泳槽，需800毫升。移液枪的使用方法移液枪的使用方法移液器

7、量程的调节使用干净的枪头移液器的使用手法，两档位吸液吸液放液放液去去枪枪头头的的方方法法1.将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。2.在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。3.将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。5.将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。6.如图所示将电极架往下压（约12mm），使底面完全接触。7.关上底座开关。8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。