放射免疫检测技术.ppt
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1、放射免疫检测技术基本内容基本内容一、一、放射免疫检测技术的基本原理放射免疫检测技术的基本原理二、二、放射免疫分析(放射免疫分析(RIA)三、三、免疫放射分析(免疫放射分析(IRMA)四、四、RIA与与IRMA的比较的比较五、放射免疫分析中造成测量误差的因素五、放射免疫分析中造成测量误差的因素六、核废物的处理六、核废物的处理七、应用七、应用八、课堂小结八、课堂小结九、作业九、作业一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理1、7个基本概念个基本概念2、常用的放射性核素、常用的放射性核素3、放射性核素的选择原则、放射性核素的选择原则4、放射性标记的抗原或抗体的要求、放射性标记的抗原
2、或抗体的要求5、制备放射性核素标记物、制备放射性核素标记物6、放射性标记物的纯化、放射性标记物的纯化7、理想的分离技术、理想的分离技术8、免疫复合物分离常用方法、免疫复合物分离常用方法9、核射线探测仪器的探测原理、核射线探测仪器的探测原理1、7个基本概念个基本概念放射性核素放射性核素:是指原子核能自是指原子核能自发地地产生成分或生成分或能能级的的变化,化,在在变化化时伴有射伴有射线的的发射射(放射(放射性),性),然后然后变成另一种成另一种元素的元素的核素。核素。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理放射量单位有放射量单位有:放射性活度放射性活度 放射性比活度放射性比活度
3、 放射性浓度放射性浓度1、7个基本概念个基本概念放射性活度放射性活度:一定量的放射性核素在一定量的放射性核素在单位位时间内的核衰内的核衰变数,即每秒数,即每秒核核衰衰变次数次数。单位:单位:贝可勒可勒尔(Becquerel,Bq)1Ci=3.71010Bq 一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理1、7个基本概念个基本概念放射性比活度放射性比活度:是指是指固体样品固体样品的放射的放射性活度,即性活度,即单位位质量量样品中所含放射性品中所含放射性活度,以活度,以Bq/g或或Bq/mmol表示表示。放射性放射性浓度度:是指是指液体样品液体样品的放射性的放射性活度,即活度,即单位
4、体位体积溶液中所含放射性活溶液中所含放射性活度,以度,以Bq/ml表示。表示。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理1、7个基本概念个基本概念比活度:比活度:是是单位位质量量标记物的放射物的放射强度,度,单位位为Bq/g。标记抗原的比放射性越高,所需标记标记抗原的比放射性越高,所需标记抗原量越少,实验系统的敏感度越高。抗原量越少,实验系统的敏感度越高。但过高的比放射性可能会损伤抗原的但过高的比放射性可能会损伤抗原的免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为免疫活性。如碘标记化合物以单碘标记为宜。宜。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理1、7个基本概念个基
5、本概念放射化学纯度:放射化学纯度:是指是指结合于抗原上的放合于抗原上的放射射强度占度占总放射放射强度的百分率。度的百分率。影响因素影响因素:被标记物不纯,杂质也被放射性核素标被标记物不纯,杂质也被放射性核素标记;记;标记后的分离纯化不完全;标记后的分离纯化不完全;标记化合物贮存过程中的碘脱落。标记化合物贮存过程中的碘脱落。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理1、7个基本概念个基本概念免疫活性:免疫活性:指指标记抗原抗原结合于抗体的合于抗体的放射放射强度占度占总放射放射强度的百分率。度的百分率。以以检查标记后免疫活性后免疫活性损失失情况情况。一、放射免疫检测技术的基本原理
6、一、放射免疫检测技术的基本原理2、常用的放射性核素:、常用的放射性核素:放射性核素依据放射性核素依据衰衰变方式分方式分、三三种,用于放射性种,用于放射性标记的有的有和和两两类;分分别用用液体液体闪烁计数器数器及及计数器数器测定。定。型:型:3 3H H(最常用)、(最常用)、1414C C和和3232P P。型:型:125125I I(最常用)、(最常用)、131131I I、5151CrCr和和6060CoCo。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理125I和和3H标记物特点比较标记物特点比较 125125I I标记标记物物3 3H H标记标记物物标记标记方法方法方法方
7、法简简便,易便,易获获得高得高比放射性比放射性标记标记物物方法方法较难较难,不易,不易获获得高得高比放射性比放射性标记标记物物对标记对标记化合化合物影响物影响标记时标记时以以I I代替代替H1H1改改变变物物质结质结构,可影响抗构,可影响抗原免疫学活性原免疫学活性不改不改变变抗原抗原结结构,一般构,一般不影响抗原免疫活性不影响抗原免疫活性测测量方法量方法方法方法简简便、效率高便、效率高方法复方法复杂杂,效率低,效率低测测量量仪仪器器计计数器数器液体液体闪烁计闪烁计数器数器半衰期半衰期60.260.2天天约约1111年年废废弃物弃物处处理容易理容易较难较难3、放射性核素放射性核素选择原原则 高比
8、活度、适宜半衰期、高比活度、适宜半衰期、对抗原或抗抗原或抗体没体没损害害、容易容易标记。4、放射性放射性标记的抗原的抗原或抗体的或抗体的要求要求 纯度高度高、灵敏、灵敏、有足有足够或完整的免疫或完整的免疫活性活性、高高亲和常数、和常数、特异性强、特异性强、交叉反交叉反应率低。率低。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理5、制备放射性核素标记物、制备放射性核素标记物直接直接标记法法 将将125I直接直接结合在蛋白合在蛋白质侧链的的酪氨酸残酪氨酸残基苯基苯环上,形成上,形成单碘酪氨酸或双碘酪氨酸。碘酪氨酸或双碘酪氨酸。操作操作简便,便,结合效率高,但只能合效率高,但只能标记含
9、酪氨含酪氨酸的化合物,有酸的化合物,有时可能会可能会损害蛋白害蛋白质的活性。的活性。间接接标记法法 先将放射性碘先将放射性碘连接到一个接到一个小分子小分子载体体上,上,再将再将这个小分子个小分子载体与蛋白体与蛋白质结合。合。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理 6、放射性放射性标记物的物的纯化化 可用可用葡聚糖凝胶过滤法葡聚糖凝胶过滤法或或薄层层析法薄层层析法、纸层析法纸层析法、电泳法电泳法、高效液相层析法高效液相层析法等。等。理想的放射性理想的放射性标记物物:高放射化学高放射化学纯度度 适当的比放射性适当的比放射性 高的高的免疫活性。免疫活性。一、放射免疫检测技术的基
10、本原理一、放射免疫检测技术的基本原理7、理想的分离技理想的分离技术简便易行,适于大批量便易行,适于大批量样品分析品分析;分离效果完全、快速,非特异分离效果完全、快速,非特异结合低合低;试剂来源容易、价格低廉、来源容易、价格低廉、稳定性好、可定性好、可长期保存期保存;不受外界因素和不受外界因素和样品中其他品中其他组分的干分的干扰,对标准品和待准品和待测抗原分离效果相同抗原分离效果相同;适合自适合自动化分析的要求。化分析的要求。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理8、免疫复合物分离常用方法免疫复合物分离常用方法.吸附法吸附法 用吸附用吸附剂(如活性炭如活性炭)吸附小分子的游
11、离。吸附小分子的游离。.化学沉淀法化学沉淀法 RIA反反应条件接近抗体的等条件接近抗体的等电点,加入聚乙二醇点,加入聚乙二醇(PEG)等蛋白等蛋白质沉淀沉淀剂可破坏蛋白分子表面的水化可破坏蛋白分子表面的水化层而使蛋白沉淀,从而分离而使蛋白沉淀,从而分离B与与F。.双抗体法双抗体法 利用抗抗体和利用抗抗体和Ag-Ab复合物中的抗体复合物中的抗体结合,形成更大免疫复合物,合,形成更大免疫复合物,离心沉淀即可分离离心沉淀即可分离B与与F。.PR试剂 将双抗体法和将双抗体法和PEG结合起来的沉淀法,可弥合起来的沉淀法,可弥补各自的不足,分离效果各自的不足,分离效果好,适用范好,适用范围广。广。.固相分
12、离法固相分离法 将抗体或抗原将抗体或抗原结合在固相合在固相载体(如磁体(如磁颗粒、聚苯粒、聚苯烯管子或珠等)上,管子或珠等)上,利用固相抗体或抗原分离利用固相抗体或抗原分离B和和F,具有,具有简便、快速、适合于自便、快速、适合于自动化分析等化分析等特点,已逐步取代特点,已逐步取代传统的液相分离方法。的液相分离方法。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理9、核射核射线探探测仪器器的探测原理的探测原理 核射线探测器是个能量转化器,其检测原理是当射线作用于闪烁体,闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发,当受激的原子或分子退激时,则发出光子进入光电倍增管光阴极,转换
13、为光电子,光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极,形成电脉冲。转换模式:放射能转换模式:放射能光能光能电电能能脉冲。脉冲。一、放射免疫检测技术的基本原理一、放射免疫检测技术的基本原理二、放射免疫分析(二、放射免疫分析(RIA)1、基本原理基本原理 抗原抗体抗原抗体竞争性争性结合反合反应,即待,即待测抗原抗原(Ag)和定量的和定量的标记抗原抗原(Ag)与限量的抗体与限量的抗体(Ab)进行特异性反行特异性反应,其中,其中Ab的的结合位点数合位点数小于小于AgAg的的结合位点合位点总数,数,则Ag和和Ag与与Ab发生生竞争性争性结合。如待合。如待测Ag含量多,含量多,则Ag-Ab复合物形成得多,复合物
14、形成得多,Ag-Ab复合物复合物(B)形成少,游离的形成少,游离的Ag(F)多,反之亦然。)多,反之亦然。二、放射免疫分析(二、放射免疫分析(RIA)2、分类、分类 根据加根据加样顺序不同,序不同,RIA可分可分为2个个类型:型:平衡法平衡法 将将Ag和和Ag同同时与与Ab反反应,达到平衡后,达到平衡后分离分离Ag-Ab和和Ag,方法,方法稳定,但敏感度定,但敏感度稍差;稍差;顺序序饱和法和法 先将待先将待测Ag与与Ab充分反充分反应,达平衡后再加,达平衡后再加入入Ag,敏感度提高,敏感度提高,稳定性不如平衡法。定性不如平衡法。二、放射免疫分析(二、放射免疫分析(RIA)3、数据数据处理理根据
15、放射性核素的根据放射性核素的类型分型分别选用液体用液体闪烁计数数仪(型)和型)和计数数仪(型),型),测定定各待各待测标本和本和备抗原抗原标准品的准品的Ag-Ab放射性放射性强度度(B)或游离或游离Ag放射性放射性强度度(F)。制作制作标准曲准曲线时,纵坐坐标为放射性反放射性反应参数,有各种表示方参数,有各种表示方式,可式,可选用用B/F、B/(BF)、)、F/B、B/B0(零标准管)(零标准管)等比等比值或或B或或F的的cpm(脉冲)(脉冲)值,常,常选用用B/B0比比值作作为参数。横参数。横坐坐标为已知已知测定物定物标准品的准品的浓度,以算度,以算术数或数或对数表示。放数表示。放射免疫分析
16、的射免疫分析的标准曲准曲线为双曲双曲线。根据待根据待测抗原管的放射性抗原管的放射性强度度计算相算相应反反应参数参数值,再,再从从标准曲准曲线图上上查得待得待测抗原相抗原相应含量含量。二、放射免疫分析(二、放射免疫分析(RIA)RIA标准曲线的类型标准曲线的类型(1)以测定物标准品浓度为横坐标,)以测定物标准品浓度为横坐标,B%或或B/F、B/B0、计数(、计数(cpm)为纵坐标,呈双曲函数;为纵坐标,呈双曲函数;(2)以测定物标准品浓度的对数为横坐标,)以测定物标准品浓度的对数为横坐标,B%或或B/F、B/B0、cpm为为 纵坐标,曲线呈反纵坐标,曲线呈反S型;型;(3)以标准品浓度的算术数(
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