酵母基因工程精选课件.ppt

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1、关于酵母基因工程关于酵母基因工程关于酵母基因工程关于酵母基因工程第一页，本课件共有40页A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌的分类学特征酵母菌的分类学特征 酵母菌（酵母菌（YeastYeast）是一群以是一群以芽殖芽殖或或裂殖裂殖方式进行方式进行无性繁殖无性繁殖的单细的单细胞胞真核生物真核生物，分属于，分属于子囊菌纲子囊菌纲（子囊酵母菌）、（子囊酵母菌）、担子菌纲担子菌纲（担子酵母（担子酵母菌）、菌）、半知菌类半知菌类（半知酵母菌半知酵母菌），共由），共由5656个属和个属和500500多个种组成。如多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最果说大肠杆菌

2、是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。成熟的真核生物表达系统。第二页，本课件共有40页A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌表达外源基因的优势酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国不

3、含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDAFDA认定为安全的认定为安全的基因工程受体系统（基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRASGenerally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物第三页，本课件共有40页B 酵母菌的宿主系统提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌

4、第四页，本课件共有40页广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属酵母属 如如酿酒酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如如乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactisKluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如如巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastorisPichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如如

5、非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如如多态汉逊酵母多态汉逊酵母（Hansenula polymorphaHansenula polymorpha）其中其中酿酒酵母酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。表达外源基因最理想。第五页，本课件共有40页提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提

6、高或质量改善的突变类型sscssc1 1 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的钙离子依赖型的ATPATP酶酶sscssc2 2 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录后加工转录后加工rgrrgr1 1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平oseose1 1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平sscssc1111 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌 羧肽酶羧肽酶YYrhorho-提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达 转录水平转录水平突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点第六页，本课件共有40页抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌能

7、抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnn mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型alg alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心糖基核心和和外侧糖外侧糖链链两部分组成。两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对

8、异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。基化缺陷株非常重要。第七页，本课件共有40页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysLysHOOCUbiquitin 76 aaUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLysubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLys靶蛋白靶蛋白靶

9、蛋白第八页，本课件共有40页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI UBI 11 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 2 2 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 33 编码编码泛素泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白767

10、6（CEP76CEP76）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 4 4 编码编码泛素五聚体泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC UBC 1 1、UBC UBC 22、UBC UBC 33、UBC UBC 44、UBC UBC 55、UBC UBC 66、UBC UBC 77第九页，本课件共有40页减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由U

11、BI UBI 4 4基因表达，基因表达，UBI UBI 4 4-突变株能突变株能UBI UBI 4 4缺陷型：缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此因此UBI UBI 4 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA UBA 1 1缺陷型：缺陷型：UBAUBA1 1编码编码泛素激活酶泛素激活酶E1E1，UBAUBA1 1突变株是致死性的，但其等位突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4

12、 Ubc4-ubc5 ubc5 双突变型：双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效第十页，本课件共有40页C 酵母菌的载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒第十一页，本课件共有40页酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2m m环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵母中都含有2 2mm双链双链同源重组同源重组REP1REP1RAFRAFSTBSTBorioriREP2REP2FLPFLPIRIRIRIRAABB环状质粒

13、，拷贝数达环状质粒，拷贝数达5050至至100100个。个。IRs IRs 反向重复序列，反向重复序列，600 600 bpbp，重组重组FLPFLP 编码产物驱动编码产物驱动IRsIRs的同源重组的同源重组REPREP 编码产物控制质粒的稳定性编码产物控制质粒的稳定性STBSTB REPREP的结合位点的结合位点接合酵母属中的接合酵母属中的pSR1pSR1和和pSB1pSB1，以及以及克鲁维酵母属中的克鲁维酵母属中的pKD1pKD1等均与等均与22mm质质粒类似。粒类似。第十二页，本课件共有40页酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒乳酸克鲁维酵母中的线乳酸克鲁维酵母中的线状质粒状质粒乳酸

14、克鲁维酵母中含有两种不同乳酸克鲁维酵母中含有两种不同pGKL1 8.9 kbpGKL1 8.9 kbDNADNA聚合酶聚合酶 毒素蛋白毒素蛋白ab ab 免疫蛋白免疫蛋白 g g 亚基亚基的双链线状质粒的双链线状质粒pGKL1pGKL1和和pGKL2pGKL2拷贝数为拷贝数为50-10050-100个，分别携带个，分别携带K1K1K2K2两种能使多种酵母菌致死的毒两种能使多种酵母菌致死的毒反向重复序列反向重复序列素蛋白编码基因（素蛋白编码基因（a b ga b g），），同时含有毒素蛋白抗性基因。同时含有毒素蛋白抗性基因。第十三页，本课件共有40页酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构

15、建含有含有ARSARS的的YRpYRp质粒的构建质粒的构建 ARS ARS为酵母菌中的自主复制序列，为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.50.8-1.5kbkb，染色体上每染色体上每30-4030-40kbkb就有一个就有一个ARSARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子复制子、标标记基因记基因、提供克隆位点的大肠杆菌、提供克隆位点的大肠杆菌质粒质粒DNADNA。以以ARSARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRpYRp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200200个，但培养几代个，但培

16、养几代 以以2 2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEpYEp后，质粒的丢失率高达后，质粒的丢失率高达50%-70%50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。，主要是由于分配不均匀所致。第十四页，本课件共有40页酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建含有含有CENCEN的的YCpYCp质粒的构建质粒的构建 CEN CEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNADNA上与染色体均匀分配有关的序列上与染色体均匀分配有关的序列 将将CEN CEN DNADNA插入含插入含ARSARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp YCp

17、 YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-51-5个个第十五页，本课件共有40页利用酵母菌的端粒利用酵母菌的端粒TEL、CEN和和ARS等等DNA元件构建人工酵母元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源染色体，可以克隆扩增大片段的外源DNA，这是，这是YAC载体构载体构建的基本思路。这类载体一个典型的例子是建的基本思路。这类载体一个典型的例子是pYAC2，它除了，它除了装有两个方向相反的装有两个方向相反的TEL DNA片段外，还包括片段外，还包括SUP4、TRP1和和URA3等酵母菌选择基因以及大肠杆菌的复制子和选择基因等酵母菌选择

18、基因以及大肠杆菌的复制子和选择基因Ap 。SUP4编码编码tRNATyr的赭石抑制的赭石抑制tRNA，在，在ade2基因赭石突变株中，基因赭石突变株中，SUP4基因的表达使转化子呈白色，而非转化子或基因的表达使转化子呈白色，而非转化子或SUP4基因不表达基因不表达时呈红色，因此将外源时呈红色，因此将外源DNA克隆在克隆在YAC载体的载体的SmaI位点上，便位点上，便可灭活可灭活SUP4基因，获得红色的重组克隆。基因，获得红色的重组克隆。pYAC2上的大肠杆菌元上的大肠杆菌元件主要是为了载体质粒在大肠杆菌中的扩增与制备。件主要是为了载体质粒在大肠杆菌中的扩增与制备。YAC载体的载体的装载量可高达

19、装载量可高达800Kb，因而非常适用于构建人的基因文库。，因而非常适用于构建人的基因文库。nn含有含有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建r第十六页，本课件共有40页酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNADNA同源序列的同源序列的YIpYIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNADNA特定序列和标记基因，特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为构建出来的质粒称为YipYip。目的基因表达盒通常插在染色体目的基因表达盒通常插在染色体DNADNA特定特定序列中，这样目的基因就能高效整合入

20、酵母菌特定的染色体序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNADNA区域区域第十七页，本课件共有40页D 酵母菌的转化系统转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因第十八页，本课件共有40页酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌原生质体转化法酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在法，在CaCa2+2+和和PEGPEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%

21、1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%25-33%第十九页，本课件共有40页酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如LiLi+等）、等）、PEGPEG、

22、热休克热休克处理后，也可高效吸收质粒处理后，也可高效吸收质粒DNADNA，而且具有下列特性：而且具有下列特性：吸收线型吸收线型DNADNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNADNA，两者相差两者相差8080倍倍共转化现象极为罕见共转化现象极为罕见第二十页，本课件共有40页酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌电击转化法酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNADNA，但在此过程中应避免使用但在此过程中应避免使用PEGPEG，它对受电击的细胞具有较很大的负它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖

23、于受体细胞的遗传特征及培养条件作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广适用范围广，而且转化率可高达，而且转化率可高达10105 5/m mg g DNA DNA。第二十一页，本课件共有40页转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运单双链单双链DNADNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-3010-30倍倍含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效

24、地同源整合入染色体 这对于体内定点突变酵母基因组极为有利这对于体内定点突变酵母基因组极为有利克隆在克隆在YIpYIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 DNA DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的数的50-80%50-80%第二十二页，本课件共有40页用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因和和显性基因显性基因两大类两大类 营养缺陷型互补基因主要有

25、氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEULEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因第二十三页，本课件共有40页用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙

26、酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型第二十四页，本课件共有40页E 酵母菌的表达系统外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择第二十五页，本

27、课件共有40页酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子：启动子：酿酒酵母酿酒酵母PHO5PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开。启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开。PHO4PHO4基因编码产物是基因编码产物是PHO5PHO5启动子的正调控因子。启动子的正调控因子。因此，装在因此，装在pho4pho4TSTS-PHO5-PHO5启动子下游的外源基因在启动子下游的外源基因在3535时关闭时关闭2323诱导表达诱导表达温度控制型启动子温度控制型启动子PHO4PHO4温度敏感型突变基因温度敏感型突变基因pho4pho4TSTS的编码产物

28、在的编码产物在3535时失活时失活第二十六页，本课件共有40页酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酿酒酵母酿酒酵母超诱导型启动子超诱导型启动子GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导时，GAL4GAL4高效表达，高效表达，GAL1GAL1、GAL1GAL1、GAL10GAL10超高效表达超高效表达GAL10GAL10PromoterP

29、romoter的半乳糖的半乳糖利用酶系利用酶系由由GAL1 GAL1 GAL7GAL7和和 GAL10GAL10基因编码基因编码第二十七页，本课件共有40页外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因稳态外源基因稳态mRNAmRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNAmRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶PKGPKG、乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶ADHADH）中中96%96%以上的氨基酸是由

30、以上的氨基酸是由2525个密码子编码的个密码子编码的第二十八页，本课件共有40页酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因PKGPKG、乙醇脱氢乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酶基因酶基因ADHADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化超糖基化能力，往往使得能力，

31、往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。第二十九页，本课件共有40页酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1pKD1已被广泛用作重组异源已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传能稳定遗传4040代

32、以上。代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。于酿酒酵母表达系统。第三十页，本课件共有40页酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母是一种巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生，能在低廉的甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统长，长，甲醇甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长生长迅速、乙醇氧化酶基因迅速、乙醇氧化酶基因AOXAOX1 1所属强启动子、表达的可诱导性所属强启

33、动子、表达的可诱导性是巴斯是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。德毕赤酵母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体的表达序列一般整合入受体的染色体DNADNA上。在此情况下，外源基因上。在此情况下，外源基因具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有2020余种余种第三十一页，本课件共有40页酵母

34、菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择 多型汉逊酵母也是一种多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌甲基营养菌。其自主复制序列。其自主复制序列HARSHARS已被已被多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARSHARS质粒质粒能高频自发地整合在受体的染色体能高频自发地整合在受体的染色体DNADNA上，甚至可以连续整合上，甚至可以连续整合100100多多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的

35、数种外源蛋白在该系统中获目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。得成功表达。得成功表达。第三十二页，本课件共有40页F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 由由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBVHBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有的传染病，每年约有200200万万病人死亡，并有病人死亡，并有3 3亿亿人成为人成为HBVHBV携带者，其携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒中相当一部分人可能转化为

36、肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。广泛应用提供了可靠的保证。第三十三页，本课件共有40页F 利用重组酵母生产乙肝疫苗产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母第三十四页，本课件共有40页乙型肝炎病毒的结

37、构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链双链DNADNA病毒病毒，具有感染力的病毒，具有感染力的病毒乙型肝炎病毒的结构乙型肝炎病毒的结构颗粒呈颗粒呈球面球面状，直径为状，直径为42 42 nmnm，基因组仅为基因组仅为3.2 3.2 kbkb。病毒颗粒的主要病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的结构蛋白是病毒的表面抗原表面抗原多肽（多肽（HBsAgHBsAg）或）或S S多肽，它具有糖基化多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原核心抗原（HBcAgHBcAg ）、）、除此之外，被乙肝病毒

38、感染的人的肝脏还能合成并释放大量的除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的2222病毒病毒DNADNA聚合酶聚合酶、微量病毒蛋白微量病毒蛋白。nmnm的的空壳亚病毒颗粒，空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的10001000倍倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S S、MM、L L多肽多肽。第三十五页，本课件共有40页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因ATGATGATGATGATGATGTAATAA108 aa108 aa55

39、aa55 aa226 aa226 aapreS1preS1preS2preS2SSS S 多肽多肽226 aa226 aaM M 多肽多肽281 aa281 aaL L 多肽多肽399 aa399 aa第三十六页，本课件共有40页乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫传统乙肝疫苗的制备传统乙肝疫苗的制备苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模

40、产业化。疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。第三十七页，本课件共有40页产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 2020世纪世纪8080年代开始选择酿酒酵母表达重组年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAgHBsAg，主要工作包括主要工作包括将将S S多肽的编码置于多肽的编码置于ADH1ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为均颗粒直径为 22 22 nmnm，其结构和形态均与慢性乙

41、肝病毒携带者血清中其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAgHBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化，颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%1%-2%。进一步的研究表明，进一步的研究表明，MM多肽和多肽和L L多肽对多肽对S S型疫苗具有显著的增效作型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S S抗抗原缺乏响应的人群的免疫反应。原缺乏响应的人群的免

42、疫反应。第三十八页，本课件共有40页产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2PARS2Bgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1Bgl IIBgl IIpBSAG151pBSAG15111 kb11 kbBgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1hishis+的转化子的转化子重组分子重组分子转化转化hishis-的受体细胞的受体细胞染色体染色体DNADNA第三十九页，本课件共有40页感感谢谢大大家家观观看看第四十页，本课件共有40页