湘南学院分子生物学第8章基因治疗.ppt

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1、 基基 因因 治治 疗疗 随着近代医学的发展，分子生物学的研究和应用已随着近代医学的发展，分子生物学的研究和应用已经逐渐进入临床医学领域。基因治疗是经逐渐进入临床医学领域。基因治疗是8080年代末出现的年代末出现的一种新的治疗技术。我国基因治疗研究专家顾健人教授一种新的治疗技术。我国基因治疗研究专家顾健人教授将基因治疗的发展划分为三个历史阶段，即将基因治疗的发展划分为三个历史阶段，即1980-19891980-1989年的年的“准备期准备期”、1990-19951990-1995年的年的“狂热期狂热期”和和19961996年之年之后后的的“理性期理性期”。19901990年的首例基因治疗获得了

2、成功，为年的首例基因治疗获得了成功，为现现代治疗学开辟了一条新途径。代治疗学开辟了一条新途径。目前，国际上已有目前，国际上已有100100多多个基因治疗方案。个基因治疗方案。内容提要内容提要二、基因治疗的总体策略二、基因治疗的总体策略一、基因治疗的概念与分类一、基因治疗的概念与分类三、基因治疗的基本程序三、基因治疗的基本程序四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究五、基因治疗五、基因治疗目前存在的问题目前存在的问题第一节第一节 基因治疗的概念与分类基因治疗的概念与分类 一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念 基因治疗基因治疗(gene therapy)是以基因转移为基础，是以基因转移为基础，

3、将某种遗传物质导入患者细胞内，使其在体内表达将某种遗传物质导入患者细胞内，使其在体内表达并发挥作用，从而达到治疗疾病目的的一种方法。并发挥作用，从而达到治疗疾病目的的一种方法。基因治疗导入的遗传物质：基因治疗导入的遗传物质：1.与缺陷基因对应的、在体内表达具有特异功能的与缺陷基因对应的、在体内表达具有特异功能的 同源基因；同源基因；2.与缺陷基因无关的治疗基因或其它遗传物质。与缺陷基因无关的治疗基因或其它遗传物质。二、基因治疗分类二、基因治疗分类 1.生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行基因矫行基因矫正正 生殖细

4、胞基因治疗的可能对象生殖细胞基因治疗的可能对象遗传病。遗传病。用显微注射的方法将正常基因导入遗传病患者的用显微注射的方法将正常基因导入遗传病患者的生殖细胞，特别是在受精卵细胞分化之前，可望在其生殖细胞，特别是在受精卵细胞分化之前，可望在其后代不患这种遗传病。后代不患这种遗传病。生殖细胞基因治疗，由于对后代遗传性状会有影响，生殖细胞基因治疗，由于对后代遗传性状会有影响，从而对人类的发展也有着深远影响从而对人类的发展也有着深远影响，涉，涉及医学研究活及医学研究活动中的伦理道德问题。动中的伦理道德问题。因此，目前对于生殖细胞的基因治疗研究仅限于动因此，目前对于生殖细胞的基因治疗研究仅限于动物物，不，

5、不考虑人类。考虑人类。2.体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)。将遗传物质导入患者体细胞，以达到治疗疾病的目将遗传物质导入患者体细胞，以达到治疗疾病的目的，其基因信息不会传至下一代。的，其基因信息不会传至下一代。只限于某一体细胞的基因的改变只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代只限于某个体的当代 目前临床上已采用的基因治疗方案均属于体细胞基因目前临床上已采用的基因治疗方案均属于体细胞基因治疗，如对治疗，如对SCID (重症联合免疫缺陷病重症联合免疫缺陷病 （severe combined immunodeficiency)病人的治疗。病人

6、的治疗。第二节第二节 基因治疗的总体策略基因治疗的总体策略 一、基因治疗的总体策略一、基因治疗的总体策略 通过在适当的通过在适当的“靶细胞靶细胞”中有效表达中有效表达重组目的基因重组目的基因片段片段,实现实现基因治疗基因治疗。原则：原则：1.1.致病基因的原位置换致病基因的原位置换 2.2.基因的异位替代基因的异位替代 3.3.直接抑制有害基因的表达直接抑制有害基因的表达 4.4.增强机体免疫能力的基因治疗增强机体免疫能力的基因治疗（一）基因替代和基因矫正治疗（一）基因替代和基因矫正治疗 基因替代基因替代以正常基因原位替代缺陷基因以正常基因原位替代缺陷基因 （或变异基因）。（或变异基因）。基因

7、矫正基因矫正将致病基因的异常碱基序列进行将致病基因的异常碱基序列进行 纠正，而正常部分予以保留。纠正，而正常部分予以保留。这两种策略最为理想，因为它们均是对缺陷基这两种策略最为理想，因为它们均是对缺陷基 因精确地原位修复，而不涉及靶细胞基因组的其它因精确地原位修复，而不涉及靶细胞基因组的其它 变化。变化。然而由于技术原因，目前还只停留在细胞然而由于技术原因，目前还只停留在细胞 水平的同源重组的研究阶段，离临床实际应用尚水平的同源重组的研究阶段，离临床实际应用尚 有较长距离。有较长距离。（二）代偿性基因治疗（二）代偿性基因治疗 通过对有代偿功能的基因的正调控，通过对有代偿功能的基因的正调控，开启

8、其关闭状态来代偿功能异常的基因。开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。例如：例如：用某些作用剂提高用某些作用剂提高或或珠蛋白基因的珠蛋白基因的 表达以治疗表达以治疗地中海贫血。地中海贫血。（三）基因补偿性治疗（三）基因补偿性治疗 指将目的基因导入病变细胞或其他细指将目的基因导入病变细胞或其他细 胞，不去除异常基因，而是通过目的基因胞，不去除异常基因，而是通过目的基因 的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因 的功能或使原有的功能得以加强。的功能或使原有的功能得以加强。目前基因治疗多采用此种策略，目前基因治疗多采用此种策略，因为从理论上讲，基因补偿并不去除或因为

9、从理论上讲，基因补偿并不去除或 修正原有的变异基因，故相对来讲较容易。修正原有的变异基因，故相对来讲较容易。（四）基因失活性治疗（四）基因失活性治疗 将特定的反义核酸，包括反义将特定的反义核酸，包括反义RNA、反义、反义DNA和和核酶核酶(ribozyme)导入细胞，在翻译和转录水平阻断某导入细胞，在翻译和转录水平阻断某些些基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。（五）调控性基因治疗（五）调控性基因治疗 通过导人编码调控蛋白的基因以治疗通过导人编码调控蛋白的基因以治疗 基因表达异常的疾病，基因表达异常的疾病，例如：例如：以野生型以野生型P53P53基因治疗肺

10、癌或急性白血病。基因治疗肺癌或急性白血病。（六）应用（六）应用“自杀基因自杀基因”的基因治疗的基因治疗n 将将“自杀自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码基因导入宿主细胞中，这种基因编码n 的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，n 诱导靶细胞产生诱导靶细胞产生“自杀自杀”效应，达到清除肿瘤细胞效应，达到清除肿瘤细胞n 的目的的目的。常用的有：常用的有：HSV-tk基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶、基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶、（EC-CD）基因等。基因等。将将“自杀基因自杀基因”导入肿瘤细胞，该基因表导入肿瘤细胞，该基因表达产物即达产物即 可可催化

11、无毒性的药物前体转变成细胞毒物质，催化无毒性的药物前体转变成细胞毒物质，从而杀死肿瘤细胞；而正常细胞不含这种外源基因，从而杀死肿瘤细胞；而正常细胞不含这种外源基因，故不受影响。目前此种策略已被批准进入临床。故不受影响。目前此种策略已被批准进入临床。自杀基因的作用机制 病毒载体病毒载体酶编码基因酶编码基因肿瘤细胞肿瘤细胞酶酶药物前体药物前体毒素毒素毒素向毒素向邻近邻近肿瘤肿瘤细胞细胞扩散扩散（七）免疫修饰性基因治疗（七）免疫修饰性基因治疗 导入能使机体产生抗病毒或抗肿瘤免疫导入能使机体产生抗病毒或抗肿瘤免疫 力的基因以达到治疗的目的。力的基因以达到治疗的目的。例如：例如：B7 B7共刺激分子基因

12、及各种淋巴细胞因子基共刺激分子基因及各种淋巴细胞因子基因的导入和表达、直接注入抗原基因等。因的导入和表达、直接注入抗原基因等。此种策略花样繁多，已被批准进入临床。此种策略花样繁多，已被批准进入临床。（八）特异性细胞杀伤性基因治疗（八）特异性细胞杀伤性基因治疗 利用利用DNA重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的重组技术构建以特异性杀伤靶细胞为目标的“神奇弹头神奇弹头(magic bullet)”，“弹头弹头”部分是通过分部分是通过分子重组的各种生物来源的细胞毒素。子重组的各种生物来源的细胞毒素。如：如：1.假单胞菌绿脓杆菌外毒素假单胞菌绿脓杆菌外毒素 (pseudomonas exotoxin

13、，PE)、2.白喉毒素白喉毒素(diphtheria toxin，DT)、3.蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白、4.天花粉以及真菌毒素天花粉以及真菌毒素-sarcin等，等，它们以酶催化方式发挥抑制蛋白合成的作用，它们以酶催化方式发挥抑制蛋白合成的作用，造成细胞杀伤，其毒性很强。造成细胞杀伤，其毒性很强。（九）生殖细胞基因治疗（九）生殖细胞基因治疗 生殖细胞或胚胎干细胞补偿性基因治疗。生殖细胞或胚胎干细胞补偿性基因治疗。它是更为有效的基因矫正方式，但因涉及技术复它是更为有效的基因矫正方式，但因涉及技术复杂，受伦理道德的限制，目前只在动物实验中使杂，受伦理道德的限制，目前只在动物实验中使用，尚不能应用于临

14、床。用，尚不能应用于临床。基因治疗的两条途径基因治疗的两条途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞体外途径体外途径体内途径体内途径选择适宜的基因载体和基因转移系统选择适宜的基因载体和基因转移系统获得目的基因获得目的基因合理选择靶细胞合理选择靶细胞外源基因表达的筛检外源基因表达的筛检回输体内回输体内第三节第三节 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序一、获得目的基因一、获得目的基因 目的基因的来源：目的基因的来源：1.1.含目的基因的供体细胞的基因组含目的基因的供体细胞的基因组DNA 2.经限制性内切酶消化后的经限制性内切酶消化后的DNA片段、片段、3.预先分离克隆的基因、经

15、预先分离克隆的基因、经RT-PCR扩增得到扩增得到 的的 cDNA、人工合成的、人工合成的DNA片段。片段。其中分离克隆基因是目前获得目的基因最为其中分离克隆基因是目前获得目的基因最为 常用的一种方法。常用的一种方法。二、合理选择二、合理选择靶细胞靶细胞 已被应用的靶已被应用的靶细胞：细胞：淋淋巴细巴细胞、造胞、造血细血细胞、上胞、上皮细皮细胞、胞、角角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝肝细胞、肌细胞、肿瘤细胞等。细胞、肌细胞、肿瘤细胞等。在选择基因治疗靶细胞时在选择基因治疗靶细胞时，综合考虑以，综合考虑以下下因素因素1 1.发病的器官及位置发病的器官及位置 可以选

16、择病变本身器官的细胞，也可以选择病可以选择病变本身器官的细胞，也可以选择病 变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。变器官以外的细胞来作为基因治疗的靶细胞。例如：在肝脏病的基因治疗中，例如：在肝脏病的基因治疗中，可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞；可以选择肝细胞作为基因治疗的靶细胞；在肝癌的基因治疗中，也可选择肝癌组织中浸润在肝癌的基因治疗中，也可选择肝癌组织中浸润 的淋巴细胞作为其靶细胞；的淋巴细胞作为其靶细胞；有时甚至肿瘤细胞也可作为靶细胞的候选对象。有时甚至肿瘤细胞也可作为靶细胞的候选对象。2.2.靶细胞应容易取出和移植靶细胞应容易取出和移植 基因治疗的一般常规途径是：将靶细胞从体内取基

17、因治疗的一般常规途径是：将靶细胞从体内取出，经基因转化后再移植回人体内，目的基因在体出，经基因转化后再移植回人体内，目的基因在体内特定部位得到表达，以达到基因治疗的目的。内特定部位得到表达，以达到基因治疗的目的。这就要求靶细胞容易从体内取出和植回人体。这就要求靶细胞容易从体内取出和植回人体。最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞。最容易取出和移植的细胞当属血液系统的细胞。3.3.靶细胞容易在体外培养靶细胞容易在体外培养 作为基因治疗的靶细胞要求在体外培养的条件作为基因治疗的靶细胞要求在体外培养的条件下容易存活，而且要有一定的分裂和自我更新能力，下容易存活，而且要有一定的分裂和自我更新能力，因

18、为一般情况下基因治疗要求的转染细胞数量在因为一般情况下基因治疗要求的转染细胞数量在108108以上。以上。但目前常用的几种基因转移方法其效率不同，但目前常用的几种基因转移方法其效率不同，逆转录病毒载体包装细胞系基因转移系统效率最高，逆转录病毒载体包装细胞系基因转移系统效率最高，但也不总是能够达到但也不总是能够达到100%100%。因此，在实际应用中，。因此，在实际应用中，要求靶细胞的数量要大于这个数字。要求靶细胞的数量要大于这个数字。4.4.对靶细胞容易实现基因转化对靶细胞容易实现基因转化 将目的基因转移入靶细胞的手段包括物理法、将目的基因转移入靶细胞的手段包括物理法、化学法、融合法及病毒载体

19、法四大类。化学法、融合法及病毒载体法四大类。目前广泛应用且前景广阔的基因转移方法：目前广泛应用且前景广阔的基因转移方法：病毒载体介导途径。病毒载体介导途径。5.5.靶细胞应具有较长的寿命靶细胞应具有较长的寿命 基因治疗，特别是某些单基因遗传缺陷性基因治疗，特别是某些单基因遗传缺陷性疾病的基因治疗，最终目标是要求外源基因长期、疾病的基因治疗，最终目标是要求外源基因长期、稳定的表达，甚至是终生的。稳定的表达，甚至是终生的。因此，必须使基因治疗的靶细胞具有较长的寿命。因此，必须使基因治疗的靶细胞具有较长的寿命。体内许多干细胞能够满足这一条件。体内许多干细胞能够满足这一条件。三、选择适宜的基因载体和基

20、因转移系统三、选择适宜的基因载体和基因转移系统 目前使用的基因载体有病毒载体和非病毒目前使用的基因载体有病毒载体和非病毒载体两大类。载体两大类。在基因治疗的临床实施中，一般多选用病毒载在基因治疗的临床实施中，一般多选用病毒载体。在体外实验研究中，将目的基因导入哺乳动体。在体外实验研究中，将目的基因导入哺乳动物细胞的方法有两类：物细胞的方法有两类：非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移在实际应用中不同方法各有优缺点。在实际应用中不同方法各有优缺点。（一）（一）非病毒介导的基因转移方法非病毒介导的基因转移方法 1.1.物理方法物理方法 1 1）显微注射法：）

21、显微注射法：利用显微注射仪，将目的基因直接注入利用显微注射仪，将目的基因直接注入 靶细胞，其转化效率高。但所需设备昂贵。靶细胞，其转化效率高。但所需设备昂贵。2 2）电穿孔法：）电穿孔法：利用外部高压短脉冲作用使受体细胞膜出利用外部高压短脉冲作用使受体细胞膜出 现瞬间可逆性孔隙，允许一定大小的现瞬间可逆性孔隙，允许一定大小的DNA分子分子 进入细胞。具有简便、快速、对质粒进入细胞。具有简便、快速、对质粒DNA纯度纯度 要求不高等优点，但高压电击可杀死部分细胞，要求不高等优点，但高压电击可杀死部分细胞，故只能在体外进行。故只能在体外进行。3 3）显微注射法和微粒子轰击（又称基因枪）法：）显微注射

22、法和微粒子轰击（又称基因枪）法：显微注射法是在显微镜直视下，向细胞核内显微注射法是在显微镜直视下，向细胞核内 直接注射外源基因，这种方法应是有效的。直接注射外源基因，这种方法应是有效的。不需要进行基因工程的繁琐操作，不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因直接将裸露基因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动动物物实实验验表表明明：接接受受注注射射外外源源DNADNA的的小小鼠鼠能能够够按按其其基基因因编编码码合合成成相相应应的的蛋蛋白白质质，并并能能维维持持数月之久。数月之久。*将促进心脏血管生长的基因直接注入将促进心脏血管生长的基因直接注入 实验鼠的心

23、脏，可使其心脏壁内毛细实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细 血管增加血管增加30%30%40%40%；*将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细 胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；*肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血基因，可产生血 友病所需的凝血因子等等。友病所需的凝血因子等等。2.化学方法化学方法 1）DNA-磷酸钙共沉淀法：磷酸钙共沉淀法：DNA与磷酸钙形成沉淀物，通过细胞与磷酸钙形成沉淀物，通过细胞 的内吞作用的内吞作用进入细胞质，然后再进入细胞核并整合到染色体上。进入细胞质，然后再进入细胞核并整合到染色体上。该法的优点：该法的优

24、点：目的基因的制备较容易，不必构建复杂的载体。目的基因的制备较容易，不必构建复杂的载体。不足之处：不足之处：转移效率低，一般转移效率低，一般1000100000个细胞中只有一个个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要细胞可结合导入的外源基因。要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。从病人获得大量所需的受体细胞。2 2）多聚阳离子（）多聚阳离子（polycation）-DNA复合物法：复合物法：多聚阳离子如多聚赖氨酸（多聚阳离子如多聚赖氨酸（polylysine）带正电带正电 荷，可与带负电荷的荷，可与带负电荷的DNADNA分子结合形成复分子结合形成复合物，经

25、合物，经 细胞内吞作用而导入细胞。细胞内吞作用而导入细胞。DNA-多聚赖氨酸多聚赖氨酸+复合物复合物吞饮吞饮特异性受体特异性受体的靶细胞的靶细胞受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图 3 3）脂质体）脂质体-DNA复合物法：复合物法：脂质体是由脂质双层分子组成的环形封闭囊泡，脂质体是由脂质双层分子组成的环形封闭囊泡，无毒、无免疫原性，无毒、无免疫原性，DNA被包裹于中。这种脂质体被包裹于中。这种脂质体外壳可使外壳可使DNADNA保持完整，通过一种内吞噬过程进入细保持完整，通过一种内吞噬过程进入细胞。胞。（二）（二）病毒介导的基因转移病

26、毒介导的基因转移 以病毒为载体，将目的基因导入靶细胞或器官，以病毒为载体，将目的基因导入靶细胞或器官，并使之表达。并使之表达。使用的病毒载体：使用的病毒载体：*经过改建的有复制缺陷的病毒。经过改建的有复制缺陷的病毒。（缺失了其自身复制所必需的一些基因）（缺失了其自身复制所必需的一些基因）*插入了治疗性基插入了治疗性基因或一因或一些基因的调控成份些基因的调控成份 (如启动子和增强子如启动子和增强子)。目前在基因转移中所使用的病毒主要有以下几类。目前在基因转移中所使用的病毒主要有以下几类。1 1）逆转录病毒）逆转录病毒（Retrovirus，RV）载体）载体 RV是小的单股是小的单股RNA病毒，是

27、目前基因转移中应用病毒，是目前基因转移中应用 最为广泛的一类病毒。最为广泛的一类病毒。逆转录病毒转染效率高，理论上可高达逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%100%。转染后，前病毒基因组转染后，前病毒基因组(经逆转录后形成的经逆转录后形成的DNA)可与靶细胞基因组随机整合，因而能较稳定地表可与靶细胞基因组随机整合，因而能较稳定地表 达外源基因。达外源基因。*只能转染处于增殖状态的细胞，对静止期细胞无效。只能转染处于增殖状态的细胞，对静止期细胞无效。*所携带的外源基因不能太大，否则会影响病毒的效所携带的外源基因不能太大，否则会影响病毒的效 价和稳定性。价和稳定性。*理论上讲，从包装细胞释放

28、出来的复制缺陷的逆转录理论上讲，从包装细胞释放出来的复制缺陷的逆转录 病毒，只能一次性感染靶细胞，不会扩散到其它细胞。病毒，只能一次性感染靶细胞，不会扩散到其它细胞。但在某种情况下，也会造成野生型病毒的爆发。但在某种情况下，也会造成野生型病毒的爆发。*由于病毒的基因组是随机整合到靶细胞基因组的，由于病毒的基因组是随机整合到靶细胞基因组的，因而具有致细胞癌变的可能。因而具有致细胞癌变的可能。该类载体也有一定的缺陷，表现在：该类载体也有一定的缺陷，表现在：2 2）腺病毒（）腺病毒（Adenovirus,AV）载体）载体 AV双链双链DNA病毒病毒,约约38kb。通过受体介导的内吞作用通过受体介导的

29、内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，宿主细腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。如神经元等。腺病毒的优点腺病毒的优点*基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；*宿主范围广；宿主范围广；*基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；*重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、

30、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；*腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；3）腺相关病毒（）腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体）载体 AAV 属于微小病毒家族成员，是一类小的单链属于微小病毒家族成员，是一类小的单链DNA病毒（基因组约病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒性，需辅助病毒(常为常为AV)存在时才能复制。存在时才能复制。AAV可感可感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。大部分染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。大部分AAV基因组可去除，

31、从而可使外源基因得以大量补足。基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。AAV Virus ParticlesAAV的特点的特点*以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；*病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；*只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAVAAV基因表达就处于抑基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；制而维持潜伏状态；*若细胞受刺激，表达应激基因，若细胞受刺激，表达应激基因，AAVAAV基因表基因表达从而使达从而使AAVAAV病毒复制；病毒复制；*产生子代病毒并释放，又感染新的细胞产生子代病毒并释放，又感染新的细胞 （四）外源基因表达的筛检四）外源基因表达的筛检 在体外培养细胞中，基因

32、转化效率很难达到在体外培养细胞中，基因转化效率很难达到100%100%，故需利用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。故需利用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。在较多的表达载体中都在较多的表达载体中都有有neor（抗新霉素）标（抗新霉素）标记记基因的存在，若向培养基中加入药物基因的存在，若向培养基中加入药物G418，未被转，未被转化的细胞则因不存在化的细胞则因不存在neor标记基因而不能存活，最后标记基因而不能存活，最后只有转化细胞存活下来。只有转化细胞存活下来。在筛选出转化细胞后仍需检测转化细胞中外源基在筛选出转化细胞后仍需检测转化细胞中外源基因的表达状况。只有稳定表达外源基因的细胞在病人因

33、的表达状况。只有稳定表达外源基因的细胞在病人体内才能发挥治疗效应。体内才能发挥治疗效应。G418G418:氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成。当当neoneo基因被整合进真核细胞基因被整合进真核细胞DNADNA后后,启动启动neoneo基因编码的序列转录为基因编码的序列转录为,从而获得抗性产物从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达的高效表达,使细胞获得抗性使细胞获得抗性，而能在含有而能在含有418418的选择性培养基中生长。的选

34、择性培养基中生长。（五）（五）回输体内回输体内 将治疗性基因修饰的靶细胞以不同的方式将治疗性基因修饰的靶细胞以不同的方式 回输体内以发挥治疗效果，回输体内以发挥治疗效果，如：淋巴细胞可以静脉回输入血；如：淋巴细胞可以静脉回输入血；造血细胞可采用自体骨髓移植的方法；造血细胞可采用自体骨髓移植的方法；皮肤成纤维细胞经胶原包裹后可埋入皮皮肤成纤维细胞经胶原包裹后可埋入皮 下组织中等等。下组织中等等。第四节第四节 基因治疗的应用研究基因治疗的应用研究第一例基因治疗第一例基因治疗 腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（ADA ADA）缺乏症缺乏症 1990 1990年年9 9月月4 4日美国日美国国立卫生研究院国立卫

35、生研究院 BlaeseBlaese博士博士对一位患对一位患ADAADA缺乏症的缺乏症的4 4岁女孩进行首例基因治疗。岁女孩进行首例基因治疗。该病是一种该病是一种ADAADA单基因功能缺陷的遗传性疾病。单基因功能缺陷的遗传性疾病。多见于儿童，发病率在欧美为十万分之一，亚洲较多见于儿童，发病率在欧美为十万分之一，亚洲较少见。少见。临床表现为严重免疫功能低下。临床表现为严重免疫功能低下。ADA ADA是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，它使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最它使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸排出体外。当腺苷脱氨酶

36、缺乏时，脱后代谢为尿酸排出体外。当腺苷脱氨酶缺乏时，脱氧腺苷不能脱氨，在淋巴细胞内大量堆积，造成其氧腺苷不能脱氨，在淋巴细胞内大量堆积，造成其死亡，机体免疫功能缺乏。死亡，机体免疫功能缺乏。位于位于2020号染色体的号染色体的ADAADA基因缺陷基因缺陷 ADAADA酶缺乏酶缺乏 脱氧腺苷不能脱氨而含量增高脱氧腺苷不能脱氨而含量增高 对淋巴细毒性或淋巴细胞死亡对淋巴细毒性或淋巴细胞死亡 免疫球蛋白合成减少和细胞免疫削弱免疫球蛋白合成减少和细胞免疫削弱ADAADA缺乏症治疗步骤缺乏症治疗步骤：（体外基因修饰骨髓移植法（体外基因修饰骨髓移植法）1 1、麻醉下，从病人髂嵴抽取骨髓液，、麻醉下，从病人

37、髂嵴抽取骨髓液，分离淋巴细胞。分离淋巴细胞。2 2、将病人的淋巴细胞与携带、将病人的淋巴细胞与携带ADA基因基因 的逆转录病毒混合培养，经病毒转移的逆转录病毒混合培养，经病毒转移 ADA 基因进入淋巴细胞。基因进入淋巴细胞。3、清洗淋巴细胞；去除多余的病毒筛选带、清洗淋巴细胞；去除多余的病毒筛选带 有有ADA基因的淋巴细胞，检测其基因的淋巴细胞，检测其ADA含含 量，确定量，确定ADA基因在淋巴细胞中有满意基因在淋巴细胞中有满意 表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回 病人体内。病人体内。4、密切观察病人各项免疫指标的变化，必、密切观察病人各项免疫指标的变化，必

38、要时重复。要时重复。该女童共接受了该女童共接受了7次自体细胞输注，其次自体细胞输注，其ADA水平稳定升高，从不到正常人的水平稳定升高，从不到正常人的1增至增至25，转，转移的移的ADA基因在体内长时间持续表达。免疫功能基因在体内长时间持续表达。免疫功能增强，临床症状改善，基本恢复正常。增强，临床症状改善，基本恢复正常。SCID病人的治疗病人的治疗ADA基因缺陷临床治疗的潜在问题：基因缺陷临床治疗的潜在问题：淋巴细胞是淋巴细胞是ADA缺乏症基因治疗的常用靶细缺乏症基因治疗的常用靶细胞，但淋巴细胞的寿命为一个月到数个月不等，胞，但淋巴细胞的寿命为一个月到数个月不等，随着转染淋巴细胞的死亡，随着转染

39、淋巴细胞的死亡，ADA表达量下降，表达量下降，必要时重复基因治疗。必要时重复基因治疗。选择寿命长的骨髓造血干细胞。选择寿命长的骨髓造血干细胞。法国成功地治疗了法国成功地治疗了5 5例患儿，但不久发现例患儿，但不久发现这些患儿出现了类白血病症状而被迫停止。这些患儿出现了类白血病症状而被迫停止。近来，来自美国、意大利和奥地利的科学家们联合近来，来自美国、意大利和奥地利的科学家们联合公布了一项关于公布了一项关于ADAADA缺乏症基因治疗试验的最新研究成果。缺乏症基因治疗试验的最新研究成果。研究者们对研究者们对1010名有严重的联合性免疫缺陷症的名有严重的联合性免疫缺陷症的ADAADA缺乏症缺乏症患进

40、行了基因治疗。患进行了基因治疗。他们将携带有他们将携带有ADAADA基因的逆转录病毒转导至患者自体基因的逆转录病毒转导至患者自体CD34+CD34+骨髓细胞，并将这些细胞重新输回患者体内。骨髓细胞，并将这些细胞重新输回患者体内。在经过平均在经过平均4 4年的随访后，所有转导的细胞均稳定存在于年的随访后，所有转导的细胞均稳定存在于血液中并分化成含有血液中并分化成含有ADAADA的骨髓细胞和淋巴细胞。其中的骨髓细胞和淋巴细胞。其中8 8名名患者体内持续表达患者体内持续表达ADAADA，不再需要酶替代治疗，没有嘌呤，不再需要酶替代治疗，没有嘌呤代谢异常的症状。代谢异常的症状。9 9名患者名患者T T

41、细胞数量增加，功能恢复。细胞数量增加，功能恢复。家族型高胆固醇症家族型高胆固醇症 病因：病因：因为因为(LDLR)基因突变，肝脏缺乏低密度脂蛋白基因突变，肝脏缺乏低密度脂蛋白受体受体(LDLR)，LDL不能正常代谢，造成血浆不能正常代谢，造成血浆LDL和胆和胆固醇升高的遗传病。患者可在较年轻时会出现冠心病固醇升高的遗传病。患者可在较年轻时会出现冠心病或心肌梗死。或心肌梗死。1992年年Michgan大学的研究人员对一例大学的研究人员对一例28岁的岁的加拿大该病女性患者进行了基因治疗加拿大该病女性患者进行了基因治疗。A：手术第一天切除病人三分之一左肝叶；手术第一天切除病人三分之一左肝叶；B B：

42、对切下的肝进行胶原蛋白酶灌流，分离肝细胞；：对切下的肝进行胶原蛋白酶灌流，分离肝细胞；C C：导入逆转录病毒：导入逆转录病毒LDLR复合体于肝细胞中复合体于肝细胞中(手术第三天手术第三天)；D D；收集导入后的肝细胞；收集导入后的肝细胞(手术第四天手术第四天)；E E：向下腔系静脉注射肝细胞：向下腔系静脉注射肝细胞(手术第四天手术第四天)基因疗法基因疗法治疗治疗LDLLDL受体缺陷症受体缺陷症1991年年12月我国成功治疗乙型血友病月我国成功治疗乙型血友病 凝血因子凝血因子基因基因巨细胞病毒基因巨细胞病毒基因凝血因子凝血因子基因基因与与巨细胞病毒基巨细胞病毒基因重组体因重组体患者皮肤患者皮肤成

43、纤维细胞成纤维细胞患者皮下患者皮下凝血因子凝血因子重组重组植入植入表达表达导入导入1998年年1月美国波士顿圣伊丽莎白医学中心治疗月美国波士顿圣伊丽莎白医学中心治疗下肢循环障碍性疾患下肢循环障碍性疾患，严重者靠截肢治疗。，严重者靠截肢治疗。血管内皮血管内皮生长因子生长因子基因基因患者肌肉患者肌肉注射注射患者肌肉长出新血管患者肌肉长出新血管第五节第五节 基因治疗基因治疗目前存在的问题目前存在的问题（一）安全性（一）安全性 1 1、感染、感染 2 2、有益基因的丢失、有益基因的丢失 3 3、诱发癌变、诱发癌变（二）稳定性（二）稳定性 1 1、基因转录系统不稳定、基因转录系统不稳定 2 2、形成不正

44、确的信息、形成不正确的信息RNARNA 3 3、基因表达的控制因素复杂、基因表达的控制因素复杂 4 4、靶细胞死亡、靶细胞死亡（三）免疫性（三）免疫性（四）伦理问题（四）伦理问题第第1 1个基因治疗死亡的病例个基因治疗死亡的病例1999年年9月月17日日 美国宾夕法尼亚大学吉姆美国宾夕法尼亚大学吉姆.威尔逊教授基因治疗威尔逊教授基因治疗“尿素循环障碍尿素循环障碍”病病病人：病人：Jesse，男，男，18岁，岁，患患鸟氨酸氨基甲酰转移酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶 不足症的罕见遗传性疾病不足症的罕见遗传性疾病，先天性尿素循环障碍先天性尿素循环障碍治疗方案：治疗方案：1、鸟氨酸转氨甲酰鸟氨酸转氨甲酰酶基因

45、与腺病毒酶基因与腺病毒DNA重组重组 2、38万亿携带万亿携带鸟氨酸转氨甲酰鸟氨酸转氨甲酰酶基因的腺病毒酶基因的腺病毒 注入注入Jesse肝脏肝脏Jesse病情恶化：高热病情恶化：高热40oC,血氨含量升高，肝性脑病，血氨含量升高，肝性脑病，肺功能衰竭，第肺功能衰竭，第4天死亡。天死亡。宾夕法尼亚大学承认治疗程序有错宾夕法尼亚大学承认治疗程序有错不能用病毒直接注入人体！不能用病毒直接注入人体！基因治疗的应用与展望基因治疗的应用与展望应用：应用：展望：展望：遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病感染性疾病、神经系统疾病进进一步寻找切实有效的基因一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响减少外源基因对机体的不利影响