基因工程大实验.pptx

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1、基因工程及分子生物学基因工程及分子生物学基因工程及分子生物学基因工程及分子生物学大实验大实验大实验大实验邢万金邢万金 苏慧敏苏慧敏内蒙古大学生命科学学院生物系内蒙古大学生命科学学院生物系一、实一、实 验验 目目 的的n n学习基因操作的基本技术学习基因操作的基本技术n n熟悉基因克隆常规仪器的使用熟悉基因克隆常规仪器的使用n n学习科研项目的开题论证学习科研项目的开题论证n n培养科学实验的独立操作能力培养科学实验的独立操作能力n n建立做好原始实验记录的习惯建立做好原始实验记录的习惯n n练习撰写研究论文练习撰写研究论文二、教二、教 学学 组组 织织n n学生自主设计方案学生自主设计方案n

2、n教师审查方案可行教师审查方案可行n n学生独立实验操作学生独立实验操作n n教师现场巡回指导教师现场巡回指导n n学生失败互相救助学生失败互相救助n n教师把关实验结果教师把关实验结果三、实三、实 验验 内内 容容目的基因的亚克隆、表达载体的构建、目的基因的亚克隆、表达载体的构建、在大肠杆菌中诱导表达。在大肠杆菌中诱导表达。1.目目 的的 基基 因因n n纳豆激酶成熟肽（纳豆激酶成熟肽（纳豆激酶成熟肽（纳豆激酶成熟肽（NKNK）（原核）（原核）（原核）（原核）位于位于位于位于pMD18-T-NK(full)pMD18-T-NK(full)n n绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（绿色荧

3、光蛋白（EGFPEGFP）（真核）（真核）（真核）（真核）位于位于位于位于pEGFP-N1pEGFP-N1上上上上n n红色荧光蛋白（红色荧光蛋白（红色荧光蛋白（红色荧光蛋白（DsRed2DsRed2）（真核）（真核）（真核）（真核）位于位于位于位于pDsRed2-1pDsRed2-1上上上上n n其它基因（教师在研课题）其它基因（教师在研课题）其它基因（教师在研课题）其它基因（教师在研课题）pMD18-T-NK(full):3.8kp 纳豆激酶全长纳豆激酶全长1181bpDNA已插入已插入pMD18-T2.载载 体体n npMD19-T （TA克隆）克隆）n npUCm-T （TA克隆）克隆

4、）n npET-Trx （融合表达）（融合表达）n npGEX-4T1（融合表达）（融合表达）克隆载体：克隆载体：表达载体：表达载体：pMD18/19-TpUCm-TpET-Trx3.3kbMCSAmpT7PT7 RBS TRX(his-patch)CTC GAA GTT CTG TTT CAG GGT CCA GCAGGA TCC GCA GAA TTC AGC GCT AGC TAA CAT CAT CAT CAT CAT TAA GCTT Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly ProBamHI EcoRI NheI HindIIIBamHI EcoRI NheI sto

5、p HindIIIP3C cut site pGEX-4T1pGEX-4T14950 bpLacIAmpPtacGSTBamHI EcoRI SmaI XhoI SalI NotIGTC GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC CCG GGT CGA CTC GAG CGG CCG CAT CGT GAC TGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg AspThrombine四、四、实实 验验 流流 程程提取目的基因模板提取目的基因模板提取表达载体质粒提取表达载体质粒

6、PCR扩增目的基因扩增目的基因EcoRI+BamHI双酶切回收双酶切回收T载体载体目的基因亚克隆载体目的基因亚克隆载体EcoRI+BamHI双酶切回收双酶切回收目的基因片段目的基因片段目的基因表达载体目的基因表达载体IPTG诱导表达诱导表达酶酶 切鉴定切鉴定酶酶 切鉴定切鉴定SDS-PAGE检测检测感受态感受态DH5感受态感受态BL21(DE3)参考计划参考计划参考计划参考计划观观观观察，察，察，察，转转转转入清水，照相入清水，照相入清水，照相入清水，照相下午下午下午下午灌胶加灌胶加灌胶加灌胶加样电样电样电样电泳，染色泳，染色泳，染色泳，染色45min45min，脱色，脱色，脱色，脱色过过过过

7、夜夜夜夜上午上午上午上午第九天第九天第九天第九天ODOD600600=0.5=0.5时诱导时诱导时诱导时诱导表达表达表达表达3h3h，离心集菌离心集菌离心集菌离心集菌下午下午下午下午早晨早晨早晨早晨7 7：0000摇摇摇摇菌菌菌菌 包括空包括空包括空包括空BL21BL21（DE3DE3），练习组练习组练习组练习组装装装装SDSSDS电电电电泳模具泳模具泳模具泳模具上午上午上午上午第八天第八天第八天第八天讲讲讲讲解解解解实验论实验论实验论实验论文写作要求文写作要求文写作要求文写作要求下午下午下午下午提重提重提重提重组组组组表达表达表达表达载载载载体体体体质质质质粒，粒，粒，粒，酶酶酶酶切切切切验

8、证验证验证验证，转转转转化化化化BL21(DE3)BL21(DE3)，涂平板，涂平板，涂平板，涂平板过过过过夜夜夜夜上午上午上午上午第七天第七天第七天第七天挑重挑重挑重挑重组组组组表达表达表达表达载载载载体体体体转转转转化克隆，化克隆，化克隆，化克隆，摇摇摇摇菌菌菌菌过过过过夜夜夜夜 下午下午下午下午作感受作感受作感受作感受态态态态BL21(DE3)BL21(DE3)上午上午上午上午第六天第六天第六天第六天摇摇摇摇BL21(DE3)BL21(DE3)下午下午下午下午“目的基因目的基因目的基因目的基因-表达表达表达表达载载载载体体体体”连连连连接液接液接液接液转转转转化化化化DH5aDH5a，涂

9、平板，涂平板，涂平板，涂平板过过过过夜夜夜夜上午上午上午上午第五天第五天第五天第五天回收目的基因片段，与表达回收目的基因片段，与表达回收目的基因片段，与表达回收目的基因片段，与表达载载载载体体体体连连连连接接接接过过过过夜夜夜夜下午下午下午下午提重提重提重提重组组组组T T载载载载体，体，体，体，EcoEcoRIRI和和和和BamBamHIHI双双双双酶酶酶酶切切切切验证验证验证验证上午上午上午上午第四天第四天第四天第四天挑重挑重挑重挑重组组组组T T载载载载体平板克隆，体平板克隆，体平板克隆，体平板克隆，摇摇摇摇菌菌菌菌过过过过夜夜夜夜下午下午下午下午上午上午上午上午第三天第三天第三天第三天

10、“目的基因目的基因目的基因目的基因-T-T载载载载体体体体”连连连连接液接液接液接液转转转转化涂板，回收化涂板，回收化涂板，回收化涂板，回收pET-TrxpET-Trx，下午下午下午下午作感受作感受作感受作感受态态态态DH5aDH5a，EcoEcoRIRI和和和和BamBamHIHI双双双双酶酶酶酶切并回收表达切并回收表达切并回收表达切并回收表达载载载载体体体体上午上午上午上午第二天第二天第二天第二天PCRPCR扩扩扩扩增目的基因，然后与克隆增目的基因，然后与克隆增目的基因，然后与克隆增目的基因，然后与克隆载载载载体体体体连连连连接接接接过过过过夜，倒平板，夜，倒平板，夜，倒平板，夜，倒平板，

11、摇摇摇摇DH5aDH5a下午下午下午下午提提提提质质质质粒（表达粒（表达粒（表达粒（表达载载载载体和目的基因模板体和目的基因模板体和目的基因模板体和目的基因模板质质质质粒）粒）粒）粒）上午上午上午上午第一天第一天第一天第一天讲讲讲讲解解解解仪仪仪仪器，器，器，器，发发发发放移液器等，放移液器等，放移液器等，放移液器等，摇摇摇摇菌管和培养皿菌管和培养皿菌管和培养皿菌管和培养皿灭灭灭灭菌，菌，菌，菌，摇摇摇摇表达表达表达表达载载载载体和目的基因菌体和目的基因菌体和目的基因菌体和目的基因菌第零天下午第零天下午第零天下午第零天下午实验一实验一 质粒质粒DNA的小量制备的小量制备（1）提取目的基因）提取

12、目的基因载载体（作体（作PCR模板）模板）pMD18-T-NK(full)pEGFP-N1 pDsRed2-1（2）提取表达载体）提取表达载体pET-Trx（备酶切）（备酶切）pET-Trx pGEX-4T1 实验二实验二 质粒质粒DNA电泳鉴定电泳鉴定实验三实验三 质粒质粒DNA的酶切的酶切37实验四实验四 PCR扩增制备目的基因扩增制备目的基因 dd water 32l 10PCR buffer（不含（不含MgCl2）5l 25mM MgCl2 3l 2.5mmol/L dNTP 4l 10mol/L Primer1 2l 10mol/L primer2 2l 模板质粒模板质粒 1l 3U

13、/l Taq酶酶 1l（3u）总体积总体积 50l1.PCR体系体系2.PCR仪的循环程序设置：仪的循环程序设置：94 5min 94 1min 60 1min 72 1min30s goto 34 cycles 72 10min复性温度比引物的复性温度比引物的Tm值低值低2-5。3.PCR产物电泳产物电泳实验五实验五 从琼脂糖凝胶中回收从琼脂糖凝胶中回收DNA片断片断表达载体表达载体T载体载体目的基因目的基因EBEBno EB表达载体表达载体BamHI+EcoRIT载体载体+目的基因目的基因BamHI+EcoRI实验六实验六 目的基因片段与载体连接目的基因片段与载体连接表达载体表达载体Bam

14、HI+EcoRI目的基因目的基因BamHI+EcoRI重组表达载体重组表达载体T4 ligase，14目的基因目的基因（PCR产物）产物）T载体载体重组克隆载体重组克隆载体14实验七实验七 感受态菌的制备感受态菌的制备DH5a 和和 BL21（DE3）4实验八实验八 细菌转化细菌转化42重组载体重组载体感受态菌感受态菌3737实验九实验九 转化克隆的筛选和鉴定转化克隆的筛选和鉴定提取质粒提取质粒酶切酶切3737电泳鉴定结果电泳鉴定结果载体载体目的基因目的基因PCR产物产物重组载体滞后重组载体滞后BamHI+EcoRI实验十实验十 外源基因的诱导表达外源基因的诱导表达OD600IPTG实验十一实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白检测表达蛋白1.低分子量蛋白低分子量蛋白Marker2.BL21(DE3)对照对照3.BL21(DE3)诱导诱导4.4-8.重组表达载体诱导重组表达载体诱导5.9.表达载体诱导表达载体诱导20.1314366.297.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9