基因工程抗体和抗体工程.pptx

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1、第五节第五节第五节第五节 抗体工程抗体工程抗体工程抗体工程 抗体研究进展抗体研究进展抗体研究进展抗体研究进展3 3 3 3个阶段：个阶段：个阶段：个阶段：1890189018901890年白喉抗毒素，多克隆抗体；年白喉抗毒素，多克隆抗体；年白喉抗毒素，多克隆抗体；年白喉抗毒素，多克隆抗体；1975197519751975年杂交瘤技术单克隆抗体；年杂交瘤技术单克隆抗体；年杂交瘤技术单克隆抗体；年杂交瘤技术单克隆抗体；1994199419941994年基因工程抗体；年基因工程抗体；年基因工程抗体；年基因工程抗体；C genes code for the constant regions of im

2、munoglobulin protein chains.V gene is sequence coding for the major part of the variable(N-terminal)region of an immunoglobulin chain.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes Figure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete doma

3、ins.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytesFigure 24.4 Heavy and light chains combine to generate an immunoglobulin with several discrete domains.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytesTable 24.1 Each immunoglobulin family consists of a cluster o

4、f V genes linked to its C gene(s).Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytes FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098Figure 24.5 The lambda C gene segment is preceded by a J segment,so that V-J recombination generates a functional lambda light-chain gene.Immuno

5、globulin genes are assembled from their parts in lymphocytesFigure 24.6 The kappa C gene segment is preceded by multiple J segments in the germ line.V-J joining may recognize any one of the J segments,which is then spliced to the C gene segment during RNA processing.Immunoglobulin genes are assemble

6、d from their parts in lymphocytesFigure 24.7 Heavy genes are assembled by sequential joining reactions.First a D segment is joined to a J segment;then a V gene segment is joined to the D segment.Immunoglobulin genes are assembled from their parts in lymphocytesFigure 24.8 The lambda family consists

7、of V gene segments linked to a small number of J-C gene segments.The diversity of germline information Figure 24.9 The human and mouse kappa families consist of V gene segments linked to 5 J segments connected to a single C gene segment.The diversity of germline information Figure 24.10 A single gen

8、e cluster in man contains all the information for heavy-chain gene assembly.The diversity of germline information Figure 24.12 Consensus sequences are present in inverted orientation at each pair of recombining sites.One member of each pair has a spacing of 12 bp between its components;the other has

9、 23 bp spacing.Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangements Figure 24.13 Breakage and reunion at consensus sequences generates immunoglobulin genes.Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangementsFigure 15.8 Reciprocal recombina

10、tion between direct repeats excises the material between them;each product of recombination has one copy of the direct repeat.Recombination between V and C gene segments generates deletions and rearrangementsFigure 15.9 Reciprocal recombination between inverted repeats inverts the region between the

11、m.一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的一、噬菌体抗体库技术的基本方法基本方法基本方法基本方法获取目的基因获取目的基因获取目的基因获取目的基因抗体库技术的载体抗体库技术的载体抗体库技术的载体抗体库技术的载体淘筛淘筛淘筛淘筛表达与鉴定表达与鉴定表达与鉴定表达与鉴定 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P 或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。噬菌体抗体库技

12、术 19901990年年Mc CaffertyMc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fdfd噬菌体基因噬菌体基因3 3的下游，使的下游，使ScFvScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达用亲和层析，两轮富集达10106 6倍。该技术的成功给抗体基倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。因的筛选工作带来了革命性的变革。噬菌体表面展示系统(phage surface display systemphage

13、surface display system)噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点:外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N N端端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3 g3或或g8 g8 的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接

14、、数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后，转入大肠杆菌，切除后，转入大肠杆菌，该项技术的优点:将将抗体的基因型和表型紧密联系抗体的基因型和表型紧密联系起来起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术;抗体基因筛选的范围广

15、抗体基因筛选的范围广;技术稳定、可靠、生产周期短技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。激素、酶、药物、随机多肽等的生产。噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。二、噬菌体抗体库技术的二、噬菌体抗体库技术的特点特点 模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 避开了人工免

16、疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术宿主细胞宿主细胞:杂交瘤杂交瘤 细菌细菌筛选范围筛选范围:10:103 3 10 107 7 10109 9时间时间:几个月几个月 几周几周操作操作:繁杂繁杂 相对简单相对简单免疫免疫:必须必须 可避免可避免人源抗体人源抗体:+费用费用:高高 低低生产量生产量:有限有限 无限无限基因获取基因获取:再克隆再克隆 直接直接应用前景应用前景:有限有限 不可估不可

17、估 三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达三、基因工程抗体表达原核细胞表达原核细胞表达原核细胞表达原核细胞表达真核细胞表达真核细胞表达真核细胞表达真核细胞表达转基因植物表达转基因植物表达转基因植物表达转基因植物表达转基因动物表达转基因动物表达转基因动物表达转基因动物表达第六节第六节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂 常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途常用诊断血清的品种和用途常用

18、诊断血清的品种和用途 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清诊断血清的制备步骤诊断血清的制备步骤制备细菌抗原制备细菌抗原免疫动物和制备抗体血清免疫动物和制备抗体血清诊断血清诊断方法诊断血清诊断方法乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂反向被动血凝诊断试剂妊娠诊断试剂妊娠诊断

19、试剂妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂抗抗抗抗ABOABO血型系统血清血型系统血清血型系统血清血型系统血清二、免疫标记技术用的抗体二、免疫标记技术用的抗体二、免疫标记技术用的抗体二、免疫标记技术用的抗体类试剂类试剂类试剂类试剂荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂 荧光抗体的制备荧光抗体的制备荧光抗体的制备荧光抗体的制备 免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂 免疫酶染色法用抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂免疫酶染色法用抗体诊断试剂 酶免疫测定用抗体

20、诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂 HBsAgHBsAg酶标诊断试剂酶标诊断试剂酶标诊断试剂酶标诊断试剂 HBeAgHBeAg酶标诊断试剂酶标诊断试剂酶标诊断试剂酶标诊断试剂HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）（甲型肝炎病毒抗原）酶标诊断试剂酶标诊断试剂测定测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗（人免疫缺陷病毒）抗 原的酶标抗体诊断试剂原的酶标抗体诊断试剂甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊）酶标抗体诊 断试剂断试剂癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）的酶标抗体）的酶标抗体 诊断试剂诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂 放射免疫技术是将放射性核素放射免

21、疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测应的特异性结合起来建立的检测技术。技术。放射性核素标记抗体的方法：放射性核素标记抗体的方法：氯胺氯胺-T法法 Iodogen氏法氏法抗原的测定有：抗原的测定有：抗原的测定有：抗原的测定有：夹心法夹心法夹心法夹心法间接法间接法间接法间接法竟争法竟争法竟争法竟争法3.3.竞争法竞争法 Ag Ag AgAgAbAb +Ab +Ab Ag(Ag(标本标本)()(定量定量)AgAb)AgAb E E终止液标本酶标抗体底物显色显色固相固相标本酶标二抗底物 1.夹心法2.间接法HBsAg放射性核素标记抗体

22、放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂HBeAg放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂HAV抗原放射性核素标记抗体抗原放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂AFP放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂CEA放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 诊断试剂诊断试剂常用标记抗体试剂有：常用标记抗体试剂有：三、导向诊断药物三、导向诊断药物三、导向诊断药物三、导向诊断药物 放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体放射性核素标记抗体 肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像肿瘤放射免疫显像 放射免疫显像优点：放射免疫显像优点：放射免疫显像优点：放射免疫显像

23、优点：在体内确切肿瘤定位作用，准确性达在体内确切肿瘤定位作用，准确性达在体内确切肿瘤定位作用，准确性达在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%90%，灵敏度达，灵敏度达，灵敏度达，灵敏度达100%100%。在体内可检出在体内可检出在体内可检出在体内可检出0.5cm0.5cm大小的病灶，并大小的病灶，并大小的病灶，并大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。可检出肺脑的转移灶。可检出肺脑的转移灶。可检出肺脑的转移灶。小分子抗体易到达肿瘤部位，小分子抗体易到达肿瘤部位，小分子抗体易到达肿瘤部位，小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著提高可显著提高可显著提高可显著提高N/NTN/NT值。值。值。值。抗体在肿瘤部位可

24、保留抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留6 6 6 69 9 9 9日日日日能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和能观擦抗体在血中的半衰期和 可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。可能出现的不良反应。放射免疫显像定位技术放射免疫显像定位技术 将抗肿瘤单克隆抗体（将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基）与二乙基三胺五乙酸（三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成）在体外偶联成Ab-DTPA，再注入体内后，就能与体，再注入体内后，就能与体内组织相结合。由于抗体分子量大，内组织相结合。由于抗体分子量大，需需3天完成。天完成。

25、3天后注入放射性核素天后注入放射性核素In-113M（半衰期（半衰期100m），因），因DTPA是重是重金属离子络合剂，所以金属离子络合剂，所以In-113M可以结可以结合到合到DTPA分子上，使肿瘤组织显像。分子上，使肿瘤组织显像。这一过程在这一过程在2小时内可完成。小时内可完成。建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决建立预定位技术需解决3 3 3 3个问题：个问题：个问题：个问题：抗体在肿瘤组织滞留要抗体在肿瘤组织滞留要抗体在肿瘤组织滞留要抗体在肿瘤组织滞留要7 7 7 7天以上。天以上。天以上。天以上。Ab-DTPAAb-DTPAAb-DTPAAb-DTPA偶联物比

26、较稳定；偶联物比较稳定；偶联物比较稳定；偶联物比较稳定；内源性金属离子对内源性金属离子对内源性金属离子对内源性金属离子对DTPADTPADTPADTPA的封闭的封闭的封闭的封闭作用要小。作用要小。作用要小。作用要小。第六节第六节第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物抗体治疗药物抗体治疗药物以抗体为载体的导向治疗药物，还不成以抗体为载体的导向治疗药物，还不成以抗体为载体的导向治疗药物，还不成以抗体为载体的导向治疗药物，还不成熟。熟。熟。熟。一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物一、放射性核素标记的抗体治疗药物抗体作为放射性核素的导向载体，

27、标记抗体作为放射性核素的导向载体，标记抗体作为放射性核素的导向载体，标记抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的操作简便用量小。放射性核素标记的操作简便用量小。放射性核素标记的操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。抗体对肿瘤细胞杀伤较大。抗体对肿瘤细胞杀伤较大。抗体对肿瘤细胞杀伤较大。二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物二、抗癌药物偶联的抗体药物常用的抗癌药物常用的抗癌药物常用的抗癌药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤（氨甲喋呤（氨甲喋呤（氨甲喋呤（MTXMTX）、阿霉素）、阿霉素）、阿霉素）、阿霉素（ADMADM）

28、、丝裂霉素（）、丝裂霉素（）、丝裂霉素（）、丝裂霉素（MMCMMC）等。）等。）等。）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可以人血浆白蛋白作为中间载体，可以人血浆白蛋白作为中间载体，可以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的明显提高每分子抗体所携带的明显提高每分子抗体所携带的明显提高每分子抗体所携带的MTXMTX量，使体外细胞毒性体高二倍。量，使体外细胞毒性体高二倍。量，使体外细胞毒性体高二倍。量，使体外细胞毒性体高二倍。抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性 肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药肿瘤细胞对抗原药

29、物可产生多药耐药肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（性（性（性（MDRMDR）。）。）。）。MDR MDR是由基因调控的，其编码蛋白是由基因调控的，其编码蛋白是由基因调控的，其编码蛋白是由基因调控的，其编码蛋白称为称为称为称为P P糖蛋白，其中糖蛋白，其中糖蛋白，其中糖蛋白，其中P170P170是与肿瘤耐是与肿瘤耐是与肿瘤耐是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由药相关的主要蛋白，由药相关的主要蛋白，由药相关的主要蛋白，由Mdr1Mdr1基因编基因编基因编基因编码，码，码，码，12801280氨基酸残基，分子量氨基酸残基，分子量氨基酸残基，分子量氨基酸残基，分子量170K170K。认为认为P蛋白是蛋白是

30、ATP酶依赖性药泵，药物酶依赖性药泵，药物进入细胞后与进入细胞后与P蛋白结合，利用蛋白结合，利用ATP水水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。内药物蓄积减少，因而产生耐药性。三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物三、毒素偶联的抗体药物 免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品 在导向药物中，毒素和抗体的交联物称在导向药物中，毒素和抗体的交联物称在导向药物中，毒素和抗体的交联物称在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。为免疫毒素。为免疫毒素。为免疫毒素。第一代免疫

31、毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有第一代免疫毒素是包含有A A、B B链完整链完整链完整链完整毒素和抗体的交联物，其中毒素和抗体的交联物，其中毒素和抗体的交联物，其中毒素和抗体的交联物，其中B B链非特异链非特异链非特异链非特异性结合，使其仅在体外应用。性结合，使其仅在体外应用。性结合，使其仅在体外应用。性结合，使其仅在体外应用。第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的段与毒素的A链或与链或与A链相似的单链核链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体一代免疫毒素的非特异性

32、，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。内有一定的抗肿瘤作用。第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。免疫毒素的制备方法免疫毒素的制备方法毒素的来源毒素的来源 细菌毒素细菌毒素 植物毒素植物毒素载体的种类载体的种类小分子抗体小分子抗体FV或或SCFV细胞生长因子细胞生长因子激素激素CD4 制备方法制备方法 先克隆毒素基因，再利用基因重组技术先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因，再与载体基因。经改造的毒素基因，再与载体基因重组，转入受体菌中表达，形成融因重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。毒素。免疫毒素的临床应用免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病治疗肿瘤、自身免疫病 并能克复组织移植排斥反应，可单独给并能克复组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。药。