DNA重组技术的基本工具.pptx

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1、DNA重组技术的基本工具烟草烟草据据据据WTOWTO调查：调查：调查：调查：20042004年全世年全世年全世年全世界因狂犬病致死人数约界因狂犬病致死人数约界因狂犬病致死人数约界因狂犬病致死人数约5.55.5万万万万人人人人中国卫生部通报：中国卫生部通报：中国卫生部通报：中国卫生部通报：20042004年年年年月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。死亡数之首。死亡数之首。死亡数之首。发病死亡率近发病死亡率近发病死亡率近发病死亡率近100%100%能产生狂犬病抗体能产生狂犬病抗体蛋白的转基因蛋白的转基因抗虫害的玉米抗虫

2、害的玉米转鱼抗寒基转鱼抗寒基因的番茄因的番茄转基因转基因鲑鱼鲑鱼基因工程产品转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激素的转基乳汁中含有人生长激素的转基因牛因牛(阿根廷阿根廷)每每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取45g。1979年，美国将年，美国将人的胰岛素基因人的胰岛素基因重组到重组到大肠杆菌大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药 据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素思考思考：转基因技术转基

3、因技术转基因技术转基因技术实现了实现了实现了实现了一种生物一种生物一种生物一种生物的某些的某些的某些的某些性状性状性状性状在在在在另一种生物另一种生物另一种生物另一种生物中中中中表达表达表达表达。这些性状的表达与我们学这些性状的表达与我们学这些性状的表达与我们学这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！密码子在生物界是的！DNA(DNA(基因基因基因基因)mRNA mRNA 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质(性状性状性状性状)转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译通用通用基

4、因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过计，通过体外体外DNA重组和转基因等技术重组和转基因等技术，赋予，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的要的新的生物类型和生物产品新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一苏云金

5、芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想想一想需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因通过运载体导入通过

6、运载体导入通过运载体导入通过运载体导入转基因棉花含转基因棉花含抗虫基因抗虫基因转基因棉花产生转基因棉花产生伴胞晶体伴胞晶体转基因棉花有转基因棉花有抗虫特性抗虫特性一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些

7、工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体一、一、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具DNA重组技术的基本工具 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”DNA连接酶

8、连接酶“分子缝合针分子缝合针”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运分子运输车输车”思考：思考：自然界是否存在一种生物的自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？进入另一生物的情况？动物容易让外来动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？侵入自身而得以遗传吗？为什么？植物呢？为什么？植物呢？原核生物，容易遭到入侵吗？原核生物，容易遭到入侵吗？原核生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的原核生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？酶来防范。这些酶应该有什么特点？可能酶能识别外来侵入的可能酶能识别外来侵入的可能酶能识别外来侵入的可能酶能

9、识别外来侵入的DNADNA并将其分解，而对自身的并将其分解，而对自身的并将其分解，而对自身的并将其分解，而对自身的DNADNA不能起作用。不能起作用。不能起作用。不能起作用。“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要来源：主要来源：原核生物原核生物限制酶的作用特点作用特点：作用特点：能够识别能够识别双链双链DNADNA分子的某种分子的某种特定特定的的核苷酸序列，并且使核苷酸序列，并且使每一条链中每一条链中特定特定部位部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开断开切点：切点：磷酸二酯键磷酸二酯键举例：举例：EcoEcoRIRI限制酶能识别限制酶能识别GAA

10、TTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开之间切开限制酶的识别序列：限制酶的识别序列：限制酶所识别的序列有什么特点 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基个碱基还是还是4个碱基，都可以找到一条个碱基，都可以找到一条中心轴中心轴线线，中轴线两侧的双链，中轴线两侧的双链DNA上的碱基上的碱基是是反向对称重复反向对称重复排列的。排列的。限制酶切割的结果限制限制酶酶EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端黏性末端和平末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口

11、？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。思考思考?GAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCCTTAAGCTT

12、AAGCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物生物生物A A基因片段基因片段基因片段基因片段生物生物生物生物B B基因片段基因片段基因片段基因片段G G G GAATTCAAT

13、TCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G GG G G GAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G酶切酶切酶切酶切二、二、“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶作用作用:把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成DNA连接酶“分子缝合针”连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为称之为Ecoli连接酶。另一种是从连接酶

14、。另一种是从T4噬菌体中分离噬菌体中分离得到，称为得到，称为T4连接酶。连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链的缺口，而不能连接单链DNA。Ecoli连接酶只能连接黏性末端；连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可连接酶既可“缝合缝合”黏性末端，又可黏性末端，又可“缝合缝合”平末端。平末端。可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶连接酶连接酶或或或或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷

15、酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶比较：比较：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能

16、连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别（二）（二）“分子缝合针分子缝合针”DNA连接连接酶酶DNA聚合酶DNA连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个D

17、NADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将将将单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸通过磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键连接成一条互补连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两两个缺口同时连接个缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板三、三、“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体思考：假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运

18、输车作为分子运输车载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将会怎样？会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？基因的载体“分子运输车”载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：1 1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2 2、具有、具有1-1-多个限制酶切点，以便与外源基因连接；多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产、具有某些标记基因，便于进

19、行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等物具有颜色反应的基因等 ）4 4、对受体细胞无害、对受体细胞无害载体的作用：载体的作用：1 1、将外源基因转移到受体细胞中去。、将外源基因转移到受体细胞中去。2 2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：常用的载体有：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒 质粒是基因工质粒是基因工程最常用的运载体，程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外中，是细菌染色体外能够自主复制的很小能够自主复制的很小的环状的环状

20、DNA分子，分子，大小只有普通细菌拟大小只有普通细菌拟核核DNA的百分之一。的百分之一。要对天然质粒进行人工改造要对天然质粒进行人工改造以下是两种限制酶切割后形成的以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用分子，所用DNA连接连接酶通常是酶通常是 。（2）和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常片段，所用的连接酶通常是是 。反馈练习：反馈练习：