DNA复制,修复和重组.pptx

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1、DNA复制,修复和重组 作为基因产物的蛋白质名称则用第一个字母为大写的正体字，如“RecA 蛋白”。第一节第一节 DNA复制复制 一一.关于模板的概念（关于模板的概念（template）模板分子的概念产生于DNA双螺旋结构建立之前，能指导子代生物大分子按特定顺序合成的母链称模板。二二.DNA复制的基本规律复制的基本规律 a.DNA复制是半保留的；b.DNA复制在一个原点（orgin）开始，双向进行；DNA分子复制的起点称原点，大肠杆菌的复制原点称OriC，终点区是ter。DNA复制点呈分叉状，分叉状复制区域称复制叉。c.DNA复制是半不连续的；I.冈崎片断（Okazaki fragments）

2、；II.复制叉上的前导链（leading strand）和滞后链（lagging strand）；三三.依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶 1.E.coli DNA polymerase I 的发现，Arthur Kornberg，1955，单肽链，Mr103,000。2.DNA聚合酶酶促反应机制 (dNMP)n+d NTP (dNMP)n+1+PPi 引物 任意脱核 延长一个 焦磷酸 苷三磷酸 核苷酸残基 DNA聚合反应的关键是生长链的末端核苷酸的游离3羟基对下一个参加聚合 反应的脱氧核苷三磷酸中的-磷原子发动亲核进攻，建立酯键，释放出焦磷酸。DNA聚合酶催化反应的基本规律：l所有DN

3、A聚合酶都需要模板；l所有DNA聚合酶都需要引物（primer）；引物：互补于模板链的一个寡核苷酸片断，它带有一个游离的3OH，以便建立新的磷酸二酯键。l所有的核酸链聚合反应都从53方向进行。四四.DNA多聚化的热力学多聚化的热力学 DNA聚合酶 (dNMP)n+d NTP (dNMP)n+1+Ppi ppi 焦磷酸酶 2pi 2 KJ/mol 30 KJ/mol 28 KJ/molG0-28 KJ/mol 但由DNA聚合酶催化的上述反应在无焦磷酸酶参与下仍能继续进行。聚合反应导致多重弱相互作用的形成，它们释放的能量促进多聚化反应：CH 约100 KJ/mol；OH OC 约4-5 KJ/mo

4、l；van der Waals 约1 KJ/mol。五五.DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA聚合反应的精确聚合反应的精确性性 E.coli 中的实际错误率 10-910-10；E.coli 基因组4.7 106bp；1.复制的碱基配对可以达到10-410-5的错误率。这错误率相当于碱基上功能基团的互变异构反应的动力学常数。2.DNA多聚酶35外切酶活性对碱基配对的校对作用（proof reading），可以提高精度102103倍，距离细胞内DNA复制精度还差102。校对作用不是合成的逆反应，两种活性是独立的。以上两个过程复制和校对，都依赖碱基配对中的非共价相互作用，这是提高信息分子复制高保真度的

5、根本方法。六六.大肠杆菌有多种大肠杆菌有多种DNA聚合酶聚合酶 1.DNA polymerase I 的特性 53聚合酶活性；35外切酶活性；53外切酶活性。lDNA合成速度不及复制叉移动速度的1/20，16-20 nt/s；l连续性太低；l遗传学证据证明pol A细胞也能存活；2.II 型DNA聚合酶和III 型DNA聚合酶 II 型参加SOS修复；III 型是主要的DNA复制酶；3.E.coli I 型DNA聚合酶的两个主要应用 a.“Nick translation”（切口移位技术），I型DNA聚合酶具有以双链DNA的一个切口开始，用53的外切酶活性降解这条旧链，并合成一条新链代替旧链，

6、用这种技术在试管内把放射性核苷酸导入DNA，用于探针放射性的标记。b.多聚酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction），在试管内扩增一个特定基因组片断的一个方法。4.E.coli 三种DNA聚合酶的比较七七.复制复合物（复制复合物（replisome，复制体）复制体）复制体含有20种以上的蛋白质和酶类，如DNA解螺旋酶（helicases），ssb（单链结合蛋白，single strand binding protein），primase（引物酶），DNA polymerase III，DNA polymerase I，DNA ligase（DNA连接酶），DNA

7、拓扑酶。八八.大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA复制的三个阶段复制的三个阶段 生物大分子的合成都可以分成三个阶段：起始（initiation），延长（elongation），终止（termination）。1.DNA合成的起始合成的起始 a.大肠杆菌复制原点，Ori ClConsensus sequence（交感顺序）：一个理想化了的DNA顺序，这种顺序中的每个位置上的碱基代表着被比较的同功能的许多顺序中最常出现的碱基。b.起始复合物（或预引复合物，prepriming complex）Dna A 蛋白 (20 copies，结合于9bp序列，以打开串联13bp序列）；Dna B（helica

8、se）DNA解螺旋；Dna C 蛋白 促进Dna B蛋白的结合；HU 类组蛋白，刺激起始；Dna G（primase）引物酶，合成RNA物；SSB 单链DNA结合蛋白；RNA polymerase 促进Dna A的活性；DNA Topoisomerase II 释放由DNA解螺旋产生的扭转力（torsinal strain）；c.复制起始的调节 2.复制中复制中DNA链的延长链的延长 a.前导链的延长 两条链合成共同需要的酶：DNA helicase，DNA Topoisomerase，SSB，DNA polymerase III，primase。b.滞后链的延长 引物体（primosome）

9、含有Dna B，Dna A Dna G等七种蛋白，引物体间隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸残基长地RNA引物，DNA polymerase III 加接脱氧核苷l图12-9l图12-10 酸，DNA polymerase I 除去RNA引物，并合成DNA链代替，所留下的nick（切口）由DNA连接酶连接。c.DNA连接酶 连接具有5磷酸和3OH的切口形成磷酸二酯键，连接酶以NAD或ATP为能源。3.终止终止 在原核细胞中，两个方向相反的复制叉在染色体对相遇时复制的终止过程开始。八八.真核细胞真核细胞DNA的复制的复制 1.真核细胞染色体上有许多复制原点（起点），称自体复制顺序（auton

10、omously replicating sequences，ARS），长约150bp，在yeast中，400ARS，in 17 chr。2.复制叉移动速度仅及细菌的1/10。3.有多个DNA聚合酶（,等）。第二节第二节 DNA修复（修复（repair）一一.关于突变的一些概念关于突变的一些概念1.天然突变和诱变天然突变和诱变 天然突变：如碱基的互变异构，宇宙线造成的突变。天然突变率称突变的本底水平（background）。诱导突变（induced mutation）：补加诱变剂诱发的突变。诱变剂：引起突变的任何物理因子或化学因子称诱变剂或诱变因子。一些生物学过程也引起突变，如病毒的感染（在染色

11、体上的整合等）。2.突变的分类突变的分类 点突变：用一个碱基对替换另一个碱基对的突变。插入（insertion）和缺失（deletion）：插入和缺失都可以造成基因的框移突变（frame shift mutation）。无意义突变（nonsense mutation）：有意义密码改变成终止密码的突变。3.点突变的渗漏性点突变的渗漏性 a.沉默突变（silent mutation）l突变不改变氨基酸残基，CUX对应Leu，CCX对应Pro；l改变氨基酸残基但不影响基因产物的活性，如Phe Tyr，Leu Ile；l正向突变 灭活一个基因的突变称正向突变（forward mutation）。l突变

12、的回复 能克服原始突变造成的影响的第二次突变称回复突变（reversion mutation）l真回复 true reversionl第二点回复：回复突变发生在同一基因内的第二个位点。4.突变的抑制作用（突变的抑制作用（suppression）a.基因内抑制（或基因内回复，intragenic reversion），指一个补偿突变恢复了原突变蛋白的活性构象；或在一个框移突变之后恢复正确的读码框架。b.突变的基因间回复（或基因间的抑制）第二个基因的突变排除或抑制了第一个基因突变的影响，如抑制子tRNA抑制无意义突变和错义突变。二二.肿瘤发生和肿瘤发生和Ames检测检测 DNA核苷酸顺序的永久性改

13、变称为突变，突变的积累导致动物肿瘤的发生。一般的说诱变剂是致癌物。Ames检测法检出致癌物：利用一株 沙门氏杆菌组氨酸合成酶缺陷株。诱变剂（致癌物）可导致基因突变的回复，使之成为野生型，这原理可用检出诱变剂。三三.细胞中的细胞中的DNA修复系统修复系统 细胞有多个DNA修复系统，为遗传信息的完整性不惜代价。DNA修复的主要根据是以正确的互补链修复损伤的或错误的链。1.错配修复（错配修复（mismatch repair）a.DNA复制后错配碱基在模板链指导下的修复过程称错配修复，可提高复制精确率102-103倍；b.区分模板链和新合成链依靠识别亲本 链中GATC序列中的甲基化标签（tag）；c.

14、Dam 甲基化酶甲基化DNA（A碱基的N6甲基化）；d.错配修复所需的酶类 Dam 甲基化酶；Mut H，Mut L，Mut S蛋白；DNA helicase II；SSB；DNA polymeras III；exonuclease I；外切酶VII；Rec J 核酸酶；DNA ligase。e.修复过程图解2.碱基的切割修复碱基的切割修复 主要酶类：核酸糖基化酶（glycosylase），AP内切核酸酶，DNA polymerase I，DNA ligase 核酸糖基化酶识别损伤碱基，切割损伤碱基产生AP位点，由AP内切核酸酶切割AP位点的磷酸二酯键。3.核苷酸切割修复核苷酸切割修复 由uv

15、r A，uvr B，uvr C编码的“ABC切割核酸酶”，ABC excinuclease切去碱基光促合成产物，切去损伤点上游8nt，下游4-5nt。4.直接修复（直接修复（direct repair）a.光复活修复 DNA光解酶（photolyase）b.O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶去甲基化5.差错倾向修复（差错倾向修复（error-prone repair）SOS反应反应 a.SOS反应 当细胞DNA受到大量的严重的损伤时，诱发细胞的应急反应（SOS respone）。此时细胞诱导产生大量应急反应所需的蛋白和酶。这种反应使细胞分裂受到抑制，溶源状态的噬菌体被诱导进入溶菌周期，正常的DN

16、A复制停止。同时诱发产生许多正常的DNA修复酶和特殊的 DNA修复差错倾向修复所需的酶类。b.DNA polymerase V和translesion replication DNA聚合酶V能复制DNA链的损伤位点，造成高突变率。第三节第三节 细胞内细胞内DNA的遗传重组的遗传重组（Genetic recombination，或称基，或称基因重排因重排 Gene rearrangement）一一.普通重组（普通重组（General recombination）和和位点特异性重组（位点特异性重组（site-specific recombination）1.普通重组（依赖同源顺序的重组）普通重组（

17、依赖同源顺序的重组）亲本的双链DNA在同源顺序区域并排（联会），通过互换同源DNA片断形成新组合的DNA分子，这个过程称为普通 遗传重组。2.位点特异重组位点特异重组 无需同源顺序的遗传重组，包括：a.外来DNA在特殊染色体特殊位点的整合，如HIV，；b.基因转座（transposition）转座是基因或某DNA顺序从一个染色体转移到另一染色体或从同一染色体的一个座位转移到另一座位的遗传学事件。3.遗传重组的生物学意义遗传重组的生物学意义 a.普通重组在DNA损伤的修复中起重要作用；b.重组扩大生物界遗传多样性，产生新的基因组合，对进化有重要意义；c.调节基因表达，一个基因的沉默或激活可因它在

18、染色体上的位置和取向的改变而改变，如酵母性别转换，菌毛基因类型的改变（phase variation）；d.遗传重组使抗体多样化。二二.普通遗传普通遗传重组机制重组机制1.依赖于同源依赖于同源顺序遗传重组顺序遗传重组的细胞学证据：的细胞学证据：染色体的交叉染色体的交叉互换互换2.普通重组的普通重组的Holliday模型（模型（Robin Holliday，1964）a.同源DNA（homologous duplexes）并排在一起（“联会”）；b.内切酶切割两并列双链中各一条链；c.交叉互换（crossing over）；d.交叉点移动；e.重组中间体切割分解产生两种不同的重组产物；3.同源同

19、源DNA双链配对形成双链配对形成Chi（）型重组型重组中间体的证据。中间体的证据。a.单体（monomer）质粒DNA在细胞内可产生头尾相连的环形二聚体（dimer）；b.质粒同源重组中间体限制酶切割产生臂长相等的型产物；4.遗传重组需要特殊的酶遗传重组需要特殊的酶 a.在大肠杆菌细胞中普通遗传重组依赖于一组rec系列基因产物，其中有recA，rec B，recC，recD以及其它一些酶类，如 topo酶，DNA聚合酶，分解酶等。遗传学证据：recA（缺陷）细胞使细胞的重组率下降10-4，recA细胞在紫外光照射后的存活率降低为10-210-3。b.RecA蛋白对单链DNA的结合（形成丝状体）

20、促进与同源双链DNA之间的DNA链互换。lRecA蛋白在体外（in vitro）诱发的DNA链交换反应；lRecA蛋白介导的DNA链交换模型；5.E.coli Rec BCD酶有解螺旋和内切酶活性，Rec BCD复合物有ATP driven helicase和nuclease活性，RecD具有内切酶活性，能切开双链DNA中的Chi位点（重组热点），产生单链DNA，Chi位点的碱基顺序为5GCTGGTGG3。6.重组修复（复制后修复，postreplication repair），当受损伤的DNA链的配偶链不存在时，同源重组可提供修复所需的信息。7.位点特异重组（位点特异重组（site spec

21、ific recombination）一一.噬菌体噬菌体DNA在寄主染色体上的整合在寄主染色体上的整合和切出和切出 a.的两种生活周期 溶菌生长周期（lytic cycle）溶原状态（lysogenic state）b.的整合和切出时位点特异重组事件 整合位点 att（attachment sites）att P（phage 位点）att B（Bacterial site）其O顺序是att P和att B共有的顺序（同源），P，P和B，B为各自的侧接顺序（flanking sequence）。二二.位点特异重组依赖于重组酶和由重组位点特异重组依赖于重组酶和由重组酶识别的特殊顺序（酶识别的特殊顺序（20200bp），），重组重组酶的识别顺序的取向可能导致不同的重酶的识别顺序的取向可能导致不同的重组结果。组结果。a.重组导致基因顺序颠倒；b.重组导致缺失和插入；三.免疫球蛋白基因的重组 a.哺乳动物，人抗体的多样性 数以百万计；b.免疫球蛋白的结构 分重链，轻链（两个家族Kappa链，lambda链，重链轻链都由可变区，连接区和不变区三部分组成；c.抗体的多样性是由抗体基因片段的位点特异重组造成的不同组合导致的；以IgG Kappa轻链为例