11DNA重组技术的基本工具文.pptx

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1、11DNA重组技术的基本工具文转基因抗虫棉转基因抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉DNA重组技术的基本工具1.1.复习：复习：（1 1）基因工程的概念基因工程的概念基因工程又叫做基因工程又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNA重组技术重组技术。通俗地说，。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种就是按照人们的意愿，把一种生物的某种生物的某种基因基因提取出来，加提取出来，加以以修饰改造修饰改造，然后放到另一种，然后放到另一种生物的细胞里，生物的细胞里，定向地定向地改造生改造生物的遗传性状。物的遗传性状。基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结

2、果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接导入导入 表达表达基因重组基因重组（2 2）有关基因工程概念理解）有关基因工程概念理解2.2.复习：复习：（1 1）基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的简要过程普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)问题

3、问题1：上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？：上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？（2 2）基因工程培育抗虫棉的关键步骤：）基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNA连接连接关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体(棉花棉花)细胞细胞问题问题2：解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：基因的基因的

4、剪刀剪刀限制酶限制酶基因的基因的针线针线DNA连接酶连接酶基因的基因的运载工具运载工具运载体运载体DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具本节知识内容1 DNA1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具新授课：专题一新授课：专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀”限制酶限制酶“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 识别双链识别双链识别双链识别双链DNA DNA 分子的某种分子的某种分子的某种分子的某种特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸特定的核苷酸序列序列序列序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中，并且使

5、每一条链中，并且使每一条链中特定部位特定部位特定部位特定部位的两的两的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。断开。断开。主要是从主要是从主要是从主要是从原核生物中分离纯化原核生物中分离纯化原核生物中分离纯化原核生物中分离纯化4000种。种。1、来源：、来源：2、种类：、种类：3、作用：、作用：4、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端形成两种末端形成两种末端一、一、“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶粘性末端粘性末端平末端平末端专一性专一性 大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶的一种限制酶能

6、识别能识别GAATTC序列序列，并在，并在G和和A之间切开。之间切开。限制酶限制酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？限制限制限制限制酶酶酶酶什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处从识别序列的中心轴线处切开时，切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平整的，这样的切口

7、叫平末端平末端。要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。二、二、“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶连接酶1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键

8、磷酸二酯键 DNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。分子就形成了。问题问题3：DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？为什么？为什么？答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连连接酶。另一种是从接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。这两种连接酶催

9、化反应基本相同，都是连连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链接双链DNA的缺口（的缺口（nick），而不能连接单链），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间片段之

10、间形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的板链互补的DNA链；而链；而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。外源基因外源基因(如抗虫基因如抗虫基因)怎样才能导入受体细怎样才能导入受体细胞胞(如棉花细胞如棉花细胞)？“分子运输车分子运输车”载体。载体。载体的作用有哪些？载体的作用有哪些？作用一：将目的基因转移到受体细胞中去。作用一：将目的基因转移到受体

11、细胞中去。作用二：目的基因随载体的复制而复制。作用二：目的基因随载体的复制而复制。三、三、“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体：基因进入受体细胞的载体：常用的载体主要有两类：常用的载体主要有两类：1）质粒）质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒）噬菌体或某些动植物病毒原理：病毒，细菌等的侵染性。原理：病毒，细菌等的侵染性。三、三、“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载体：基因进入受体细胞的载体：了解质粒：了解质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于是一种裸露的、结构简单、独立于是一种裸露的、结构简单、独立于是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核细菌拟核细菌拟核细菌拟核DNADNA之外，且

12、具有自我复制能力的双之外，且具有自我复制能力的双之外，且具有自我复制能力的双之外，且具有自我复制能力的双链链链链环状环状环状环状DNADNA分子分子分子分子。质粒是基因工程。质粒是基因工程。质粒是基因工程。质粒是基因工程最常用最常用最常用最常用的运的运的运的运载体。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌载体。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌载体。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌载体。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。中有多个。中有多个。中有多个。提问：所有的质粒都可以作为运载体吗？提问：所有的质粒都可以作为运载体吗？作为运载体必须具备哪些条件？作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿

13、主细胞中自我）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存复制并稳定地保存。2）具有一个或）具有一个或多个限制酶切点多个限制酶切点，以便与外源基，以便与外源基因连接。因连接。3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行筛选。，便于进行筛选。4）对受体细胞无害。）对受体细胞无害。5）大小应适合，便于提取和体外操作）大小应适合，便于提取和体外操作为什么质粒可以作为基因工程为什么质粒可以作为基因工程为什么质粒可以作为基因工程为什么质粒可以作为基因工程最常用最常用最常用最常用的运载体呢？的运载体呢？的运载体呢？的运载体呢？基因操作的工具基因操作的工具一一.“分子手术刀分子手术刀:限制性核酸内切酶限制性核酸

14、内切酶来源来源:主要来自原核生物主要来自原核生物作用作用:将外来的将外来的DNA切断切断结果结果:产生黏性末端或产生黏性末端或 平末端平末端二二.“分子缝合针分子缝合针”:DNA连接酶连接酶分类分类:Ecoli DNA连接和连接和T4 4 DNA连接连接酶酶 作用作用:把黏性末端之间的缝隙把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起起来来三三.“分子运输车分子运输车”:基因进入受体细胞的载基因进入受体细胞的载体体种类种类:质粒、动植物病毒等质粒、动植物病毒等条件条件:自我复制、限制酶切点、标记基因、自我复制、限制酶切点、标记基因、安全的、大小应适合安全的、大小应适合1.有关基因工程的叙述中，错误的是（有

15、关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基基因因工工程程技技术术能能定定向向地地改改造造生生物物的的遗遗传传性性状状，培育生物新品种培育生物新品种 B、重组、重组DNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体B D练习练习2）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个个限制酶切点

16、，以便与外源基因连接限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C3）下列不是基因载体具备的条件的是）下列不是基因载体具备的条件的是 A、能自我、能自我 复制复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD4）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性核酸内切酶可用于目的基因的获得限制性核酸内切酶可用于目的基因的获得 C、目的基因须由载体导入受体细胞、目的基因须由

17、载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。教材教材P7思考与探究思考与探究12.2.提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断以识别和切断DNADNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身之所以不切断自身DNADNA，是因

18、为微生物在长期的进化，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的的DNADNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者不具备这种限制分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNADN

19、A被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵的入侵 3.3.提示：基因工程中作为载体使用的提示：基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是质粒，即独分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体立于细菌拟核处染色体DNADNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的裸露的DNADNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1 1）载体载体DNADNA必需有一个或多个限制酶的切割位

20、点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。因目的基因的插入而失活。（2 2）载体载体DNADNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的复制而同步复制。的复制而同步复制。（3 3）载体载体DNADNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4 4）载体载体DNADNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5 5）载体载体DNADNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，都要进行分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。人工改造后才能用于基因工程操作。