目的基因获取.ppt
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1、第四章第四章 目的基因的获得目的基因的获得目的基因目的基因准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和研究某基因结构和功能的关系功能的关系研究某基因与疾研究某基因与疾病的关系病的关系一、基因的基本结构特征一、基因的基本结构特征 一个能转录、翻译的结构基因依次包括一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分:以下几部分:转录启动区转录启动区、核糖体识别区核糖体识别区、编码区编码区(包括起始密码子包括起始密码子ATG、开放阅读框、开放阅读框、终止密码子终止密码子TAG、TAA或或TGA)和和转录终止转录终止区区。(一)原核生物
2、基因的组成(一)原核生物基因的组成操纵子操纵子启动子启动子启动子启动子:RNARNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段;聚合酶识别、结合和开始转录的片段;聚合酶识别、结合和开始转录的片段;聚合酶识别、结合和开始转录的片段;SDSD区区区区:糖体:糖体:糖体:糖体16S rRNA16S rRNA识别、结合识别、结合识别、结合识别、结合mRNAmRNA的位置;的位置;的位置;的位置;转录终止子和终止因子转录终止子和终止因子转录终止子和终止因子转录终止子和终止因子:分别指基因或操纵子:分别指基因或操纵子:分别指基因或操纵子:分别指基因或操纵子3 3 端提端提端提端提供转录终止信号的供转录终止信号的供转
3、录终止信号的供转录终止信号的DNADNA序列;协助序列;协助序列;协助序列;协助mRNAmRNA聚合酶识别聚合酶识别聚合酶识别聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。终止信号的辅助蛋白。终止信号的辅助蛋白。终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构,转录物形原核的终止子在终止点之前有一回文结构,转录物形原核的终止子在终止点之前有一回文结构,转录物形原核的终止子在终止点之前有一回文结构,转录物形成茎环发夹成茎环发夹成茎环发夹成茎环发夹 。基因区基因区基因区基因区:ATG+extrons+introns+TAAATG+extrons+introns+TAA(TGATGA或或或或TAGTAG)转
4、录启动区转录启动区转录启动区转录启动区:编码蛋白的启动子:编码蛋白的启动子:编码蛋白的启动子:编码蛋白的启动子(RNA(RNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶识别识别识别识别)可寻找三个保守区:可寻找三个保守区:可寻找三个保守区:可寻找三个保守区:TATAA/TATATAA/TA区(区(区(区(HognessHogness框框框框)、)、)、)、CAATCAAT框、框、框、框、GCGC框框框框。转录终止区转录终止区转录终止区转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。真核生物转录的终止信号并不清楚。真核生物转录的终止信号并不清楚。真核生物转录的终止信号并不清楚。(二)真核生物基因的组成(二)真核生物基
5、因的组成二、目的基因的获得方法二、目的基因的获得方法目前克隆目的基因常用的方法有四种方法:目前克隆目的基因常用的方法有四种方法:化学合成法、化学合成法、cDNA文库法、文库法、PCR法和法和RT-PCR法法。将将已知序列已知序列的目的基因利用化学合成的方法直的目的基因利用化学合成的方法直接合成。接合成。特点:特点:只能合成小于只能合成小于100个碱基特定序列;个碱基特定序列;自动化程度较高;自动化程度较高;合成速度较快。合成速度较快。方法:磷酸二酯法、磷酸三酯法、方法:磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷固相亚磷酸三酯法酸三酯法(一)化学合成法(一)化学合成法化学合成法的用途化学合成法的用途合成天
6、然基因:合成天然基因:如生长激素释放抑制素基因、如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因:修饰改造基因:如组织型纤溶酶原激活剂基因、如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等尿激酶原基因等设计新型基因设计新型基因制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头(二)(二)cDNA文库法文库法cDNA(complementary DNA,互补,互补DNA):由:由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNA。cDNA文库:文库:利用某种生
7、物的总利用某种生物的总mRNA合成合成cDNA,再将这些,再将这些cDNA与载体连接,转入细菌与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩增,称细胞中进行保存和扩增,称cDNA文库文库。基因组DNA文库cDNA文库基因组基因组DNA文库与文库与cDNA文库的比较文库的比较构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤1.总总RNA(total RNA)提取)提取提取总提取总RNA有商业化的试剂盒(有商业化的试剂盒(kit)。)。mRNA约占总约占总RNA的的15,所以应选用,所以应选用目目的基因的基因mRNA表达最丰富的组织细胞表达最丰富的组织细胞为材料为材料来源,如获胰岛素基因,由应以胰岛来源,如获
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