基因工程的酶学基础.pptx

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1、Enzymes1 1本章节内容本章节内容第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第二节第二节 DNA连接酶连接酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶第五节第五节 核酸外切酶核酸外切酶第六节第六节 单链核酸内切酶单链核酸内切酶2 2本章学习内容本章学习内容 重点讨论限制性核酸内切酶和重点讨论限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶在连接酶在DNADNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。与基因克隆有关的其它的重要的酶。3 3一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸

2、内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNADNA分子中的某种分子中的某种特特定核苷酸序列定核苷酸序列，并由此处，并由此处切割切割DNADNA双链双链的的核酸核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）4 42.2.性质性质内切酶内切酶主要来源于原核生物主要来源于原核生物即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。形成形成5-P5-P和和3-OH3-OH末端末端 自我保护作用自我保护作用3.3.功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）1.1.来源来源5 56 6限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵

3、入细菌体内的外源外源DNADNA进行分解，进行分解，切成小片断。切成小片断。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction）7 7细菌自身的细菌自身的DNADNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化修饰所甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2 2）修饰（）修饰（ModificationModification）Dam Dam甲基化酶甲基化酶(DNA Adenine MethylaseDNA Adenine Methylase)G GA ATC TC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm Dcm甲基化酶

4、甲基化酶(DNA cytosine MethylaseDNA cytosine Methylase)C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列在第二个C C上上C C5 5位置上位置上引入甲基引入甲基8 89 9（3 3）限制与修饰系统相关的三个基因）限制与修饰系统相关的三个基因 hsd hsd R:R:编码限制性内切酶编码限制性内切酶 hsd hsd M:M:编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶 hsd hsd S:S:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别这类酶能识别DNADNA分子上的特定位点，并将双分子上的特定位点

5、，并将双链链DNADNA切断切断这类酶使这类酶使DNADNA分子特定位点上的碱基甲基化，分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰即起修饰 DNA DNA的作用。的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。101019731973年年H.O SmithH.O Smith和和D.NathansD.Nathans提议的命名系统，提议的命名系统，命名原则如下：命名原则如下：二、限制性内切酶的命名二、限制性内切酶的命名1.1.用用属名属名的第一个字母和的第一个字母和种名种名的头两个字母组成的头两个字母组成3 3个字母的略语表示个字母的略语表示寄主菌寄主菌的物种名，

6、组成酶的基的物种名，组成酶的基本名称。本名称。大肠杆菌（大肠杆菌（E Escherichia scherichia cocolili）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae）用）用HinHin表示表示11112.2.如果酶存在于一种如果酶存在于一种特殊的菌株特殊的菌株中，则将该菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于位于噬菌体（病毒）或质粒噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分

7、。表示此染色体外遗传成分。如如 HinHind d ：d d菌株菌株 Eco EcoR R I I：抗药性：抗药性R R质粒质粒 12123.3.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序先后次序。如如HinHind d：d d菌株中发现的第二个酶菌株中发现的第二个酶4.4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称系统名称。限制性内切酶的系统命名为限制性内切酶的系统命名为R R，甲基化酶为，甲基化酶为M M。如如 R R.HinH

8、ind d 表示限制性内切酶表示限制性内切酶表示限制性内切酶表示限制性内切酶 M M M M.HinHinHinHind d d d 表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶实际应用中，实际应用中，实际应用中，实际应用中，R R R R常被省略。常被省略。常被省略。常被省略。1313 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出四种不同类型四种不同类型的限制性内切酶。主要的的限制性内切酶。主要的三种：三种：三、限制性内切酶的类型三、限制性内切酶的类型 型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶 型限制性内切酶型限制性内切酶型限制性内切酶型限制

9、性内切酶 1414首先由首先由M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在19681968年从大肠杆菌年从大肠杆菌 B B株株和和 K K株株分离的。分离的。（1 1）识别位点序列）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1.1.型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 如如 EcoEcoB B和和 EcoEcoK K。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。1515需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子辅助因子在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500

10、bp处处随随机机切开一条切开一条单链单链，不产生，不产生特异片断，特异片断，应用不大应用不大Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点切割位点1616首先由首先由H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在在19701970年从流年从流感嗜血菌中分离出来。感嗜血菌中分离出来。（1 1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNADNA上的特殊靶序列（多数上的特殊靶序列（多数是呈典型的是呈典型的旋转对称型的回文结构旋转对称型的回文结构）。）。与与DNADNA的来源无关，即的来源无关，即没有种的特异性没有种的特异性。

11、2.2.类限制性内切酶的基本特性类限制性内切酶的基本特性 分离的第一个酶是分离的第一个酶是HinHind d 基因工程用途最大基因工程用途最大1717稀有切割限制酶（稀有切割限制酶（rare cutterrare cutter）可以识别可以识别6 6个以上的核苷酸序列的少个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。数的限制内切酶。如如NotNot I I I I （GCGGCCGCGCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。碱基并非严格专一。如如HinHind d 可识别可识别4 4种核苷酸序列：种核苷酸序列：Y Y:C:C

12、或或T T R R:A:A 或或G GGTGTYRYRAC AC-3-35 5-1818EcoEcoEcoEcoR I 5-R I 5-R I 5-R I 5-G G G GAATTCAATTCAATTCAATTC-3 3 3 3 3-3-3-3-CTTAACTTAACTTAACTTAAG G G G-5555PstPstPstPst I 5-CTGCA I 5-CTGCA I 5-CTGCA I 5-CTGCAG G G G-3 3 3 3 3-G 3-G 3-G 3-GACGTCACGTCACGTCACGTC-5555 产生粘性末端产生粘性末端产生粘性末端产生粘性末端EcoEcoEcoEc

13、oR V 5-R V 5-R V 5-R V 5-GATGATGATGATATCATCATCATC-3333 3-3-3-3-CTACTACTACTATAGTAGTAGTAG-5555 产生平齐末端产生平齐末端产生平齐末端产生平齐末端（2 2）切割位点切割位点切开切开双链双链DNADNA，形成，形成粘性末端粘性末端（sticky endsticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt endblunt end）。如：）。如：识别位点处识别位点处1919含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型：G GAATTCAATTC CTTAACTTAA G GG

14、G AATTCAATTCCTTAACTTAAG G5-5-3-33-3-555-5-333-3-5-51 1 粘性末端粘性末端（sticky ends，cohensive ends）5 5端凸出（如端凸出（如EcoEcoR IR I切点）切点）2020CTGCAG GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC）3 3端凸出（如端凸出（如Pst Pst I I切点）切点）2121i i）不同的不同的DNADNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。iiii）同一个同一个DNADNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成

15、通过两个相同的粘性末端可以连接成环环形分子形分子。这比连接两个平齐末端容易得多。这比连接两个平齐末端容易得多。2 2 粘性末端的意义粘性末端的意义 连接便利连接便利22222323B B 末端末端可以通过可以通过末端转移酶末端转移酶添加几个多聚核苷酸添加几个多聚核苷酸的尾巴（如的尾巴（如dAdA和和dTdT），即），即同聚物加尾同聚物加尾造成人工粘造成人工粘性末端。性末端。A A 末端可用末端可用DNADNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶进行进行3232P P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。末端标记末端标记 补平成平齐末端补平成平齐末端

16、24243 3 平齐末端（平齐末端（blunt endblunt end）在识别序列的在识别序列的对称轴上对称轴上同时切割同时切割5-GATATC-33-5CTATAG 如如EcoR V25254 4 平齐末端的特点平齐末端的特点连接困难，连接困难，连接效率低连接效率低，只有粘性末端连接，只有粘性末端连接效率的效率的1%1%，这种连接常出现，这种连接常出现多联体连接多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法粘性末端与平齐末端连接的处理方法）添补法：）添补法：利用利用DNADNA聚合酶聚合酶(klenow fragment）将碱基将碱基添补到目的基因的粘性末端上。添补到目的基因的粘性末端上。2

17、626）削除）削除(平平)法法 利用利用S1S1和和BalBal3131等等核酸酶核酸酶将目的基因粘性末将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端2727不同来源的酶，不同来源的酶，识别相同的序列，识别相同的序列，切割方式切割方式相同或不同。相同或不同。识别位点和切点完全相同识别位点和切点完全相同如如HinHind d 和和HsuHsu I IHind5-AAGCTT-33-TTCGAA-5HsuI5-AAGCTT-33-TTCGAA-55 5 同裂酶（同裂酶（Isoschizomer)Isoschizomer)完全同裂酶：完全同裂酶：2828

18、XmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5SmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如XmaXma I I 和和 SmaSma I I。不完全同裂酶：不完全同裂酶：2929识别的序列不同，但能识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端切出相同的粘性末端。如。如BamBamH IH I、BglBgl 、Bcl Bcl I I、XhoXho 等等5-G5-GGGATCATCC-3 C-3 3-3-CCTAGCCTAGGG-5-5BamBamH IH IBclBcl I I5-T5-TGGATCATCA-3 A-3 3-3-ACTAGAC

19、TAGT T-5-5 5-5-A AGATCGATCT-3 T-3 3-3-TCTAGTCTAGA A-5-5Bgl Bgl 5-5-U UGATCGATCY-3 Y-3 3-Y3-YCTAGCTAGU U-5-5 XhoXho U U代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；Y Y代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。6 6 同尾酶同尾酶(Isocaudamers(Isocaudamers）30305-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。5-G3-CCTAG

20、GATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamH IBgl Sau 3A3131限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、温度、离子强度、pHpH等条件下才表现最佳切割等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割专一性和切割效率效率，称为星号（，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。7 7 限制酶的酶活性限制酶的酶活性 星号（星号（*）活性）活性3232EcoEc

21、oR IR I和和BamBamH IH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pHpH（88）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！73333 诱发星号（诱发星号（*）活性的原因）活性的原因）高甘油含量）高甘油含量）内切酶用量过大）内切酶用量过大）低离子强度）低离子强度）高）高pHpH）含有机溶剂，如乙醇）含有机溶剂，如乙醇）MnMn2+2+、MgMg2+2+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+等二价阳离子的存在等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件酶量不宜

22、过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件3434在离它的在离它的不对称识别位点不对称识别位点一侧的一侧的特定距离特定距离处切割处切割DNADNA双链。双链。移动切割（移动切割（shifted cleavage):shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN538s8s型限制性内切酶型限制性内切酶3535（3 3）型限制性内切酶不具有甲基化功能型限制性内切酶不具有甲基化功能型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别它们识别相同相同的的DNADNA序列，但序列，但功能不同功能不同。如如 EcoEcoR

23、 IR I限制性内切酶和限制性内切酶和EcoEcoR IR I甲基化酶甲基化酶前者：前者：5-GGAATTCAATTC-3-3 3-3-CTTAACTTAAGG-5-5后者：后者：后者：后者：5-5-GGAAAA*TTCTTC-3-3 3-3-CTTCTT*AAAAGG-5-5作用的位点也不相同作用的位点也不相同作用的位点也不相同作用的位点也不相同3636（4 4）II型限制性内切酶对单链型限制性内切酶对单链DNADNA的切割的切割定义为切割双链定义为切割双链DNADNA，但有一些还可以特，但有一些还可以特异识别并切割单链异识别并切割单链DNADNA的相应位点，只是的相应位点，只是切割效率比较

24、低切割效率比较低如：如：如：如：H H H Hhahahaha切割单链切割单链DNADNA比比切割双链切割双链DNADNA效率低效率低505037373.3.类限制性内切酶类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNADNA，但反应需要，但反应需要ATPATP、MgMg2+2+和和SAMSAM（S-S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG3838核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性特性特性类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶

25、类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶限制和修限制和修限制和修限制和修饰活性饰活性饰活性饰活性单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶单一多功能的酶内切酶和甲基内切酶和甲基内切酶和甲基内切酶和甲基化酶分开化酶分开化酶分开化酶分开共同亚基的双功共同亚基的双功共同亚基的双功共同亚基的双功能酶能酶能酶能酶内切酶的内切酶的内切酶的内切酶的蛋白结构蛋白结构蛋白结构蛋白结构3 3 3 3种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分单一成分单一成分2 2 2 2种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基种不同的亚基限制作用限制作用限制作用限制作用所需要的所需要的所需要的所需要的辅助因子辅助因子辅助

26、因子辅助因子ATPATPATPATP、Mg Mg Mg Mg2+2+2+2+和和和和SAMSAMSAMSAMMgMgMgMg2+2+2+2+ATPATPATPATP、Mg Mg Mg Mg2+2+2+2+和和和和SAMSAMSAMSAM寄主特异寄主特异寄主特异寄主特异性位点识性位点识性位点识性位点识别序列别序列别序列别序列EcoEcoEcoEcoB B B B：TGA(N)TGA(N)TGA(N)TGA(N)8 8 8 8TGCT TGCT TGCT TGCT EcoEcoEcoEcoK K K K：AAC(N)AAC(N)AAC(N)AAC(N)6 6 6 6GTGCGTGCGTGCGTGC

27、 回文序列回文序列回文序列回文序列（s s s s型除外）型除外）型除外）型除外）EcoEcoEcoEcoP1:AGACCP1:AGACCP1:AGACCP1:AGACCEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAG3939切割位点切割位点切割位点切割位点在距离识别位点在距离识别位点在距离识别位点在距离识别位点至少至少至少至少1000100010001000bpbpbpbp处随机切开一处随机切开一处随机切开一处随机切开一条单链条单链条单链条单链位于寄主特位于寄主特位于寄主特位于寄主特异性位点或异性位点或异性位点或异性位点或其附近其附近其

28、附近其附近距寄主特异距寄主特异距寄主特异距寄主特异性位点性位点性位点性位点3333端端端端2424242426bp26bp26bp26bp处处处处酶催转换酶催转换酶催转换酶催转换不能不能不能不能能能能能能能能能DNADNADNADNA易位作用易位作用易位作用易位作用能能能能不能不能不能不能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点 寄主特异性寄主特异性寄主特异性寄主特异性位点位点位点位点寄主特异性寄主特异性寄主特异性寄主特异性位点位点位点位点识别未甲基化的序识别未甲基化的序识别未甲基化的序识别未甲基化

29、的序列进行切割列进行切割列进行切割列进行切割能能能能能能能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割序列特异的切割序列特异的切割不是不是不是不是是是是是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用无用无用十分有用十分有用十分有用十分有用用处不大用处不大用处不大用处不大4040四、限制性内切酶酶解反应条件四、限制性内切酶酶解反应条件1.1.标准酶解体系的建立标准酶解体系的建立 一个单位（一个单位（U U）的限制性内切酶定义：）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在在合适的温度和缓冲液中，在2020ll的反应体系中，的反应体系中，1h1h完全酶解完全酶解1g

30、DNA1gDNA所需要的酶量。所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（推荐：稍过量的酶（2-52-5倍）和较长的反应时间倍）和较长的反应时间41412.2.酶解过程酶解过程 配酶解体系配酶解体系 混匀混匀 反应终止反应终止 酶解结果鉴定酶解结果鉴定4242 酶解体系酶解体系一般一般2020ll，保证酶液体积不超过反应总体积的，保证酶液体积不超过反应总体积的10%10%前提下，尽量降低反应总体积。前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：加样顺序一般是：ddHddH2 2O buffer DNA O buffer DNA 酶酶 4343大部分大部分大部分大部分大部分大部分IIIIII型核酸内切酶需要相

31、似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgClMgCl2 2210 mM10 mM10 mMNaClNaClNaCl0-150 mM0-150 mM0-150 mMDTTDTTDTT1 mM1 mM1 mM0-50mM0-50mM0-50mM低盐酶低盐酶低盐酶低盐酶低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶中盐

32、酶中盐酶中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶高盐酶高盐酶高盐酶高盐酶VolumeVolumeVolume20-100 ml20-100 ml20-100 mlTTTTTT373737 1-1.5hr1-1.5hr1-1.5hr4444 混匀混匀移液枪吹打移液枪吹打或或手指轻弹管壁手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组若底物分子很大（如基因组DNADNA），），应避免强烈振荡。应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。暂离心，使管壁液体全部下沉。4545反应终止反应终止三种方法：三种方法：）加乙二胺四乙酸（）加乙二

33、胺四乙酸（EDTAEDTA）至终浓度）至终浓度 10mmol/L;10mmol/L;加十二烷基硫酸钠（加十二烷基硫酸钠（SDSSDS）至终浓度至终浓度0.1%(W/V)0.1%(W/V)）6565加热加热20min20min或者或者7070加热加热10min10min）酚）酚/氯仿氯仿抽提抽提4646 酶解结果鉴定酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察观察然后决定是否终止反应然后决定是否终止反应4747酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的DNADNADNADNA条带外，还有其它条带条带外，还有其它条带条带外，还有其它条带条带外，

34、还有其它条带酶存在酶存在酶存在酶存在“星号星号星号星号”活性，造成非特异性切割；活性，造成非特异性切割；活性，造成非特异性切割；活性，造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物底物底物底物DNADNADNADNA中可能存在其它中可能存在其它中可能存在其它中可能存在其它DNADNADNADNA污染。污染。污染。污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 底物底

35、物底物底物DNADNADNADNA不纯；不纯；不纯；不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNADNADNADNA结合在一起使电结合在一起使电结合在一起使电结合在一起使电泳条带移动距离异常泳条带移动距离异常泳条带移动距离异常泳条带移动距离异常48483.3.限制性内切酶对限制性内切酶对DNADNA分子的消化分子的消化 19861986年年J.A.McClarinJ.A.McClarin等通过等通过X X射线晶体衍射射线晶体衍射发现发现型限制酶是以型限制酶是以同型二聚体同型二聚体的形式

36、与靶的形式与靶序列结合。序列结合。CTTAAGGAATTC（1 1）内切酶与识别序列的结合模式）内切酶与识别序列的结合模式 4949内切酶在内切酶在DNADNA上的上的所有所有识别位点都被切开识别位点都被切开12 341234（2 2）完全消化完全消化5050只有有限数量的酶切位点被切开只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。12 3414（3 3）局部消化局部消化5151（4 4）几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点52525353AATTAAT

37、TACGTACGT AGCTAGCT ATATATATCATGCATG CCGGCCGG *MaeIIMaeIIHpaHpac cMspIMspIc c*AluIAluI*A A *T*TNlaNla A*A*T*TApoIApoI HindHind AflIIIAflIII AgeIAgeIBsrFIBsrFIA*A*T*TA*A*T*TSspISspIA*A*TT（5 5）限制性内切酶识别序列的交叉列表）限制性内切酶识别序列的交叉列表 5454AATTAATTACGTACGT AGCTAGCT ATATATATCATGCATGCCGGCCGGA*A*TTNsp75Nsp752424C C

38、*G*GNcoINcoIStyIStyIDsaIDsaI XmaIXmaIAvaIAvaIC*C*G*GNdeINdeIC*C*G*GPmlIPmlIBsaAIBsaAIPvuIIPvuIINspBINspBII I SmaISmaIC*C*G*GC*C*GGGG *C*CEcoRIEcoRIApoIApoINgoMINgoMIBsrFIBsrFI5555AATT AATT ACGT ACGT AGCT AGCT ATAT ATAT CATG CATG CCGG CCGG G*G*C*CBseHI BseHI G*G*C*CEcl136II Ecl136II EcoRVEcoRV NaeI N

39、aeI G*G*C*CG*G*C C AatII AatII SacISacIBanIIBanIIHgiAIHgiAIBsp1286Bsp1286 SphISphINsp752Nsp7524 4 T T *A*A BspHI BspHI BspMII BspMII T*T*A*A T*T*A*A SnaBISnaBIBsaAIBsaAI T*T*A*A T*T*A A 5656CGCGCGCGCTAGCTAGGATCGATCGCGCGCGCGGCCGGCC *MboIMboIc cSau3AISau3AIc c*BfaIBfaIHinpIHinpI*BstUIBstUIDpnIDpnIHaeI

40、IIHaeIII*HhaIHhaIA A *T*TA*A*T*TMluIMluIAflIIIAflIIISpeISpeIBglIIBglIIBstYIBstYIA*A*T*TA*A*T*TEco47IIIEco47III StuIStuIA*A*TT 5757CGCGCGCGCTAGCTAGGATCGATCGCGCGCGCGGCCGGCCA*A*TTHaeIIHaeIIC C *G*GDsaIDsaIAvrIIAvrIIStyIStyIEagIEagIEaeIEaeIGdiIIGdiII C*C*G*GC*C*G*GNspBIINspBIIC*C*G*GSacIISacIIPvuIPvuIC*

41、C*GGBsiEIBsiEIBsiEIBsiEIGG *C*CBssHIIBssHIINheINheIBamHIBamHIBstYIBstYIKasIKasIBanIBanIBsp120IBsp120I5858CGCGCGCGCTAGCTAGGATCGATCGCGCGCGCGGCCGGCCG*G*C*CNarINarIBsaHIBsaHIG*G*C*CG*G*C*CG*G*CCT T *A*ABbeIBbeIHaeIIHaeIIApaIApaIBanIIBanIIBsp128Bsp1286 6 T*T*A*AXbaIXbaIBclIBclIEaeIEaeIT*T*A*ANruINruIFspI

42、FspIMscIMscIT*T*A*AT*T*AA5959GTACGTACTATATATATCGATCGATGCATGCATTAATTAA *Csp61Csp61TaqITaqIMseIMseI*RsaIRsaI*A A *T*TA*A*T*TA*A*T*TClaIClaIAseIAseIA*A*T*TScaIScaIA*A*TT6060GTACGTACTATATATATCGATCGATGCATGCATTAATTAAA*A*TTNsiINsiIC C *G*GBsiWIBsiWISfcISfcIXhoIXhoIAvaIAvaIAvaIAvaISfcISfcIC*C*G*GC*C*G*GC*C*

43、G*GC*C*GGPstIPstIGG *C*CAsp718Asp718BaBanInISalISalIApaLIApaLI6161GTACGTACTATATATATCGATCGATGCATGCATTAATTAAG*G*C*CAccI AccI AccIAccI G*G*C*CBsrl107IBsrl107I HincIIHincIIHpaIHpaIHincIIHincIIG*G*C*CG*G*CCKpnIKpnIBsp128Bsp1286 6HgiAIHgiAIT T *A*AT*T*A*ABstBIBstBIT*T*A*ADraIDraIT*T*A*AT*T*AA62624.4.限制性内切

44、酶酶解反应中的注意事项限制性内切酶酶解反应中的注意事项 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液1U1U的酶液足以在的酶液足以在1h1h内消化内消化1010g DNAg DNA，酶和底物，酶和底物比例比例2-10U/ug DNA,2-10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度避免使用过高的酶浓度 浓缩液使用前可用浓缩液使用前可用浓缩液使用前可用浓缩液使用前可用1111限制酶缓冲液稀释限制酶缓冲液稀释限制酶缓冲液稀释限制酶缓冲液稀释 限制性内切酶在含限制性内切酶在含限制性内切酶在含限制性内切酶在含50

45、%50%50%50%的甘油的缓冲液的甘油的缓冲液的甘油的缓冲液的甘油的缓冲液 中，于中，于中，于中，于-20-20-20-20稳定保存稳定保存稳定保存稳定保存6363 酶分装成小份，避免反复冻融酶分装成小份，避免反复冻融酶分装成小份，避免反复冻融酶分装成小份，避免反复冻融 反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低 通常增加反应时间，可降低酶量通常增加反应时间，可降低酶量通常增加反应时间，可降低酶量通常增加反应时间，可降低酶量6464DNA中的杂质如中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、蛋

46、白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度的纯度 五、影响限制性内切酶活性的因素五、影响限制性内切酶活性的因素纯化纯化DNA加大酶的用量，加大酶的用量，1ugDNA用用10U酶酶延长保温时间延长保温时间扩大反应体积（扩大反应体积（20 l）一般采取一般采取6565需要合适的底物：需要合适的底物：需要合适的底物：需要合适的底物：底物（底物（底物（底物（DNADNADNADNA）纯度要高）纯度要高）纯度要高）纯度要高.不能含不能含不能含不能含有有有有RNARNARNARNA和蛋白质和蛋白质和蛋白质和蛋白质;也不能含有过高的也不能含有过高的也不能含

47、有过高的也不能含有过高的EDTAEDTAEDTAEDTA。更不能。更不能。更不能。更不能含有酚、氯仿、乙醇、含有酚、氯仿、乙醇、含有酚、氯仿、乙醇、含有酚、氯仿、乙醇、SDSSDSSDSSDS和其他有机试剂。和其他有机试剂。和其他有机试剂。和其他有机试剂。DNADNADNADNA的浓度的浓度的浓度的浓度不宜过高，高浓度的不宜过高，高浓度的不宜过高，高浓度的不宜过高，高浓度的DNADNADNADNA会使溶液的粘会使溶液的粘会使溶液的粘会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻度增加从而抑制酶分子的扩散

48、导致酶切反应不彻底。常为底。常为底。常为底。常为50ul50ul50ul50ul内含内含内含内含1ug DNA1ug DNA1ug DNA1ug DNA。6666大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2.DNA2.DNA的甲基化程度的甲基化程度 DNADNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas DNA adenine methylas,dam),dam)（修饰（修饰G GA ATCTC中的中的A A）；）；DNADNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas DNA cytosine ethyla

49、s,dcm),dcm)（修饰（修饰C CC CA/TGGA/TGG的的C C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。6767不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数大多数是是37 37 o oC C，少数要求，少数要求40-65 40-65 o oC C。每微克每微克DNADNA用用1 15 5单单位的酶，保温位的酶，保温1212小时。小时。酶酶酶酶最适温最适温最适温最适温度度度度o o o oC C C C酶酶酶酶最适温最适温最适温最适温度度度度o o o oC C C C酶酶酶酶最适温最适温最适温

50、最适温度度度度o o o oC C C CApaApaApaApa I I I IBclBclBclBcl I I I IMaeMaeMaeMae II II II IITaqTaqTaqTaq I I I I30303030505050505050505065656565Apy Apy Apy Apy I I I IBstE BstE BstE BstE IIIIIIIIMaeMaeMaeMae III III III III303030306060606055555555BanBanBanBan I I I IMae Mae Mae Mae I I I ISmaSmaSmaSma I I