微量凯氏定氮法测定蛋白质含量1046.pdf

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1、 实 验 报 告 实验课程：微量凯氏定氮法测定蛋白质含量 学生姓名：xxx 学 号：xxx 专业班级：xxx 2017 年 4 月 11 日 实验背景：凯氏定氮法：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。该方法在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由物质含氮量计算其蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。一、实验目的 1、掌握凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量的原理方法；2、学会使用凯式定氮仪。二、实验原理 蛋白质是含氮的化合物。

2、凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接收瓶内，硼酸接收氨后，形成四硼酸铵，然后用盐酸标准溶液滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为 NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3+

3、H2SO4(NH4)2SO4 （2）(NH4)2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3 （3）三、实验器材和试剂 1、实验器材：凯氏定氮蒸馏装置、50ml 锥形瓶 3 个、酸式滴定管、酒精灯 2、实验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸指示剂 0.2M HCL 四、实验步骤 1、定氮仪的洗涤（1）测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子 P3，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子 P1由橡皮管排出，如此数次。（2）用蒸汽洗涤反应室约10min后，在冷凝管末端小玻璃管的位置放上一个

4、盛硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。继续蒸馏12min。观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色，则证明反应室内部已洗涤干净；如果混合液变绿，说明定氮仪内有残留氨，没有洗涤干净，需要进一步用蒸汽洗涤。2、蒸馏（1）准备工作：蒸馏器洗净后，开放水龙头 P3，使水进入 A室，水放至A 室球部 2/3 处即可。取 3 个 50ml 的锥形瓶，分别加入 10ml 硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。（2）加样：用移液管吸取 2ml 消化液，小心地由漏斗 D 倾入 B室，用少量蒸馏水冲洗漏斗 D。取一个盛有硼酸的锥形瓶，置于 M 管下，使管口置于硼酸溶

5、液液面以下，将 P4 夹紧,向漏斗D 加入 30%氢氧化钠 5ml，慢慢松开 P4，使氢氧化钠进入 B 室，但漏斗中始终保持一部分液体封闭，往漏斗加入少量蒸馏水，重复以上过程，全程都要保持漏斗中的液体封闭。（3）蒸馏：用酒精灯加热，维持火力恒定，沸腾不可高于Y 管口以免 A 室溶液从 Y 管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F 顶端滴下时起，继续蒸馏 5 分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸 2 分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶准备滴定。（4）空白蒸馏：用移液管分别吸取2ml 蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。3、滴定 蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以 0.01mol/L 盐酸标准

6、溶液滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录所用盐酸的量。五、实验结果处理 1、实验数据 实验次序 实验试剂 1 空白 2 样品 1 3 样品 2 蒸馏水/ml 1 0 0 样液/ml 0 1 1 NaOH/ml 5 5 5 消耗 HCl/ml 0.05 0.85 0.80 平均值 0.05 0.825 2、计算：若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：样品的总蛋白含量（%）=式中：A 为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B 为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C 为称量样品的毫升数；0.2 为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为

7、常数;100是配出的100ml消化液；10是面粉质量 10g 100101000142.0)(%)样品的总氮含量CBA%57.13100101000125.6142.0)05.0825.0(10010100025.6142.0)(CBA样品的总蛋白含量（%）=由资料知面粉含量如图 该实验数据测得的蛋白质量略高出标准值 六、误差分析与讨论 1、误差分析（1）通常情况下，蛋白质含氮量在 16%左右，其 F 值为 6.25。但是，实际上不同来源的蛋白质的氨基酸组成差别很大，含氮量的差别也很大，如乳制品、面粉、花生的蛋白质含氮量分别为 15.67%、17.54%和 18.32%，则它们的 F 值分别为

8、 6.38、5.70 和 5.46。而计算中取 F 为 6.25，会导致蛋白质含量值偏大。（2）样品在空气中易变质；（3）实验用于滴定的 HCl 浓度过高，导致空白对照组仅滴定一滴便达到滴定终点，易产生操作误差；2、问题讨论 实验中应该注意些什么？本法适用于 0.05-3.0mg 氮，样品中含氮量过高时，则应减少取样量或将样液稀释。勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。参考文献：中国知网 百科,凯式定氮法 GB/T 5009.5 2003 食品中蛋白质的测定S.北京:中国标准出版社,2004.鲁健章，孙丽华，周彦钢，凯氏定氮法测定鱼蛋白质含量的干扰因素分析J.食品科学,文章编号：1002-6630(2010)19-0453-04 陈钧辉、李俊主编生物化学实验第五版