形态学与流式细胞术联合检测嵌合抗原受体-T细胞方法探究9877.pdf

《形态学与流式细胞术联合检测嵌合抗原受体-T细胞方法探究9877.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《形态学与流式细胞术联合检测嵌合抗原受体-T细胞方法探究9877.pdf（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、形态学与流式细胞术联合检测嵌合抗原受体-T 细胞方法探究 嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T细胞免疫治疗现在已经成为治疗血液疾病的重要治疗技术，并且在临床治疗中取得了较好的效果1,2,3,4。CAR-T 细胞在患者体内的存在和扩增与其临床反应密切相关5。尤其是 CAR-T 细胞免疫治疗主要并发症，细胞因子释放综合征与 CAR-T 细胞在体内的扩增相一致6。所以建立一种可靠的检测方法来追踪 CAR-T 细胞的数量及变化，不仅有助于观察治疗的效果，而且对于患者的安全也尤为重要。目前检测CAR-T细胞的方法主要有实时荧光定量PCR 7（real-time

2、quantitative PCR，Q-PCR）与流式细胞术8,9,10,11。其中 Q-PCR 的灵敏度最高，特异性最强。但是每种方法都有其局限性，譬如 Q-PCR 只能得到拷贝数，而无法看到细胞的表型。流式细胞术会面临抗体特异性不佳等问题。形态学作为一种快速、简洁有效的血液标本检测方法，目前尚未见形态学检测 CAR-T 细胞的报道。本研究通过分析 CAR-T 细胞与正常淋巴细胞区别，确定 CAR-T 细胞的形态学特征。但是仍然存在部分标本不能准确区分CAR-T 细胞与形态相似 T/NK 淋巴细胞和淋巴瘤细胞。针对以上问题，我们探究形态学与流式细胞术联合检测的方法，弥补单种检测方法的不足，以期

3、达到快速，准确定量检测患者体内 CAR-T 细胞的存在及变化。资料与方法 一、材料 回顾性分析自 2016 年 8 月至 2021 年 8 月在徐州医科大学附属医院血液科接受 CAR-T 细胞免疫治疗 256 例患者外周血与骨髓中形态学与流式细胞术检测 CAR-T 细胞的结果。256例患者均为 CAR-T 细胞输注后生存期超过 1 个月。其中多发性骨髓瘤患者 118 例，急性淋巴细胞白血病患者 68 例，淋巴瘤患者 70 例。分别统计 CAR-T 细胞输注后第 7 天、第 15天和第 21 天患者外周血 CAR-T 细胞数量。分别统计多发性骨髓瘤患者及急性淋巴细胞白血病患者于 CAR-T 细胞

4、输注后第 15 天骨髓中 CAR-T 细胞数量。本研究通过徐州医科大学伦理委员会审批（XYFY2016-KL0103-01；XYFY2017-KL013-01），所有患者均签署知情同意书。二、仪器与试剂 显微镜 OLYMPUS BX43，Navios 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter 公司。Biotin-Protein L GenScript用磷酸盐缓冲液重悬为浓度 1 mg/ml 保存于 4。Alexa Fluor 647-conjugated Streptavidin 美国 Jackson Immuno Research laboratories 公司，红细胞裂解液和相关抗

5、体均购自美国 Becton Dickinson 公司。三、方法 1.标本采集：经 CAR-T 细胞输注治疗后患者，分别于第7、15 和 21 天采集外周血，并于第 15 天采集骨髓标本，进行 CAR-T 细胞检测。2.取外周血及骨髓涂片，经瑞氏染色后，观察患者血片及骨髓片 CAR-T 细胞与正常 T 淋巴细胞形态学差异，分析CAR-T 细胞形态学特征及数量比例。3.通过流式细胞术检测蛋白 L分析CAR-T细胞在骨髓或外周血中的含量。提取样本单个核细胞并进行计数，调整浓度至 1107 个/ml。取 600 l 标本，平均分成 3 管，用 3 ml冰冷 1 磷酸盐缓冲液 洗涤 3 次（含有 4%牛

6、血清白蛋白），离心后，重悬到 0.2 ml 每管，分别标记为 A、B、C 3管。首先，A、B 管只加设门抗体（CD3 Percp、CD4 FITC、CD8 PE、CD45 V500），C 管加设门抗体与 1 g 蛋白 L，4 避光孵育 45 min，3 ml 冰冷磷酸盐缓冲液洗涤 3 次。离心弃上清后，B、C 管加入 10 l Alexa Fluor 647-共轭链霉亲和素，4 避光孵育 30 min，3 ml 冰冷磷酸盐缓冲液洗涤 3 次。离心弃上清后，重悬为 0.2 ml，上机检测。至少获取 1106 个细胞11。四、统计学分析 所有数据经整理后以统计学软件 SPSS 20.0 软件进行统

7、计学分析，通过形态学分析患者外周血或骨髓中 CAR-T 细胞，并统计检出率。通过流式细胞术分析患者外周血或骨髓中CAR-T 细胞，并统计检出率。采用 2 检验比较 2 种方法联合分析与单种方法分析检出率的差异。以 P0.05 为差异有统计学意义。结果 一、形态学分析 CAR-T 细胞结果 通过形态学方法分析 256 例患者外周血或骨髓 CAR-T 细胞检出 226 例，检出率 88.28%。CAR-T 细胞在骨髓中形态学表现为：胞体较正常淋巴细胞体积大，圆形，类圆形；胞浆嗜碱性，边缘易见一至多个数量不等的伪足凸起，部分细胞胞浆内可见细小颗粒；核圆形，核浆比大，核染色质为成熟结构（图 1A）。外

8、周血中 CAR-T 细胞胞体较正常成熟淋巴细胞大，胞体圆形，类圆形；胞浆量丰富，胞浆内易见颗粒，核圆形，类圆形，不规则形，染色质均匀一致，核仁未见。形态较骨髓相比，伪足减少，体积略大，胞浆内颗粒增多，细胞核变得略不规则，但核膜依然圆润。部分胞浆凸起的细胞形态介于单核样异型淋巴细胞与大颗粒淋巴细胞之间，较单核样异型淋巴细胞相比没有胞浆边缘深蓝，较大颗粒淋巴细胞相比体积偏大，核略不规则（图 1B）。图 1 嵌合抗原受体 T 细胞在骨髓与外周血中的形态特征（瑞氏染色，油镜1 000；1A 为骨髓嵌合抗原受体 T 细胞，胞体较正常淋巴细胞体积大，圆形，类圆形；胞浆嗜碱性，边缘易见一至多个数量不等的伪足

9、凸起，部分细胞胞浆内可见细小颗粒；核圆形，核浆比大，核染色质为成熟结构；1B 为外周血嵌合抗原受体 T 细胞，胞体较正常成熟淋巴细胞大，胞体圆形，类圆形；胞浆量丰富，胞浆内易见颗粒，细胞核略不规则，染色质均匀一致，核仁未见）二、流式细胞术分析 CAR-T 细胞结果 通过流式细胞术分析，256 例患者外周血或骨髓 CAR-T细胞检出可达 203 例，检出率达 79.29%。检测结果同相应形态学检测结果接近。通过 CD3 Percp、CD4 FITC、CD8 PE、CD45 V500 等抗体设门，可以发现 CAR-T 细胞主要以 CD8+T淋巴细胞为主。三、形态学与流式细胞术联合分析 CAR-T

10、细胞结果 2 种方法联合分析，256 例患者外周血或骨髓 CAR-T 细胞检出可达 254 例，CAR-T 细胞检出率达 99.22%。2 种方法CAR-T 细胞检出率比率正相关性分析显示，R2=0.934 5（图2）。2 种方法互相补充，几乎可以检出所有标本中 CAR-T 细胞，与单一分析方法相比，2 种方法联合分析 CAR-T 细胞检出率（99.22%）高于单纯一种方法检出率（形态学检出率88.28%，流式细胞术检出率 79.29%）。图 2 形态学与流式细胞术检测 256 例患者外周血嵌合抗原受体-T 细胞相关性分析 四、形态学与流式细胞术对不同类型标本CAR-T 细胞检测结果 对外周血

11、不同时间点检测 CAR-T 细胞比例进行分析，118例多发性骨髓瘤患者标本第 7 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 9.50%与 10.23%，第 15 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 13.50%与 15.19%，第 21 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 8.00%与 10.07%。68 例急性淋巴细胞白血病患者标本第 7 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 12.00%与 11.22%，第 15 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 21.00%与 23.10%，第 21 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 13.50%与 10.91%。70 例淋巴瘤患者标

12、本第 7 天形态学与流式细胞术平均检测比例分别为 7.50%与 10.35%，第 15 天形态学与流式细胞术平均检出率分别为 9.00%与 10.35%，第 21 天形态学与流式细胞术平均检出率分别为 6.50%与 5.69%。讨论 目前，对 CAR-T 细胞检测方法的报道主要以免疫学方法与分子生物学方法9,10,11,12,13。其中免疫学方法，又以流式细胞术为主；分子生物学方法以 PCR 为主，而且是灵敏度与特异性最佳的方法，可视为CAR-T 细胞检测的金标准。每种方法都有一定的优势，同时也存在欠缺与不足之处。流式细胞术可以通过获取大量细胞标本检测 CAR-T细胞免疫治疗患者外周血或骨髓中

13、 CAR-T 细胞的数量及变化，实验方法及流程简单、快速，能够较好满足临床对患者 CAR-T细胞免疫治疗疗效的追踪与评估。但是随着 CAR-T 细胞更新换代的加快及靶标设计多样化，导致很难找到一种可以通用而特异性的检测分子用于流式细胞术检测 CAR-T 细胞。蛋白 L 是一种从消化链球菌中分离出来的细菌表面蛋白，可选择性地与免疫球蛋白的可变轻链结合，而不干扰抗体的抗原结合特性12,13。流式细胞术检测蛋白 L 可以检出大部分标本，但因 CAR-T 细胞设计及来源不同等原因，会有接近 20%的 CAR-T 细胞检测效果不佳，甚至呈阴性。我们进一步分析检出效果不佳的标本类型及特征，发现除却标本送检

14、不及时及特殊用药导致的干扰之外，鼠源化 CAR-T 细胞比人源化 CAR-T 细胞检测灵敏度更高。这可能是因为不同种类免疫球蛋白对蛋白 L 的特异性结合能力有关。具体的分子机制需要进一步探究及大量数据的验证。通过形态学观察与检测 CAR-T 细胞，目前尚未见相关报道。我们通过比较 CAR-T 细胞与其他细胞形态学特点，发现CAR-T 细胞较正常淋巴细胞具有非常明显的形态学差异，而且在血液标本和骨髓标本中 CAR-T 细胞的形态学特征差异明显。总体上，CAR-T 细胞体积较正常淋巴细胞大，胞浆丰富且易见颗粒，胞膜边缘较正常淋巴细胞多有数量不等伪足凸起。依据 CAR-T 细胞形态学特征对相关标本进

15、行检测，检出率较高。对未检出及检测效果不佳的标本，我们进一步分析总结，发现除去样本数量极少不易检出之外，最主要的原因是不同环境中形态学特征变异性较大，个别标本不易区分淋巴瘤细胞、正常 T/NK 淋巴细胞与 CAR-T 细胞。甚至出现正常 T/NK 细胞与具备 CAR-T 特征的细胞极为相似的情况，但是通过流式分析发现为正常的 T/NK 细胞。此类标本较少，具体原因及机制需要进一步探究及大量数据的分析。形态学作为一种从未有人尝试过的 CAR-T 细胞检测方法能够为快速，准确检测 CAR-T 细胞提供一种有效的途径，但是受检测人员经验水平的影响较大，同时对 CAR-T 细胞形态学特征的分析缺少一定

16、标准。这些都需要在后期实验与工作中进一步总结归纳，以期制定一套 CAR-T 细胞形态学特征标准。通过比较目前存在的 CAR-T 细胞检测方法，我们发现联合形态学与流式细胞术检测 CAR-T 细胞具备快速，准确，敏感，易于操作等优点。可以很好弥补单一方法检测 CAR-T 细胞的缺陷与不足。检出率及准确性比单一方法检测显著提高。随着越来越多靶向 CAR-T 细胞产品应用于临床试验，势必带来 CAR-T 细胞检测难度的增加，单一方法很难满足高敏感度、特异性和易于复制的方法学要求。联合流式细胞术与形态学方法为快速，准确定量检测患者体内 CAR-T 细胞提供一种新的思路与方法，可作为 CAR-T 细胞检测重要的附加评价指标。为准确监测患者体内的 CAR-T 细胞动态变化对治疗效果评估及辅助治疗都有重要指导意义。